CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗
CHO细胞基本知识
CHO细胞基本知识引言CHO细胞（Chinese Hamster Ovary cells）是一种常见的哺乳动物细胞系，常被用于生物技术领域的研究和应用。
CHO细胞具有诸多优点，如易于培养、较高的复制速度和稳定性等，使其成为生物药物生产的重要工具。
本文将介绍CHO细胞的基本知识，包括其来源、特点、培养条件和应用等方面。
来源CHO细胞最初来源于中国仓鼠卵巢组织，1957年被美国科学家狄利克(Dilworth)和哈普斯特(Hamster)首次成功培养。
经过多年的研究和改进，CHO细胞逐渐成为工业界主要采用的细胞系之一。
现在，CHO细胞已经被广泛应用于生物制药行业，特别是重组蛋白的生产。
特点CHO细胞有许多特点使其成为生物药物生产的理想细胞系。
1.易于培养：CHO细胞相对容易培养，可以在常规的培养基中生长。
其生长要求较为简单，包括适当的培养基、温度、pH值、营养物质等。
2.高繁殖速度：CHO细胞的繁殖速度较快，在适宜的培养条件下，细胞数量可以迅速增加。
这对于大规模的生物药物生产非常有利。
3.稳定性：CHO细胞在长期培养过程中具有较高的遗传和表达稳定性。
这对于生物药物的一致性和稳定性非常重要。
4.多样性：CHO细胞可以表达多种重组蛋白，包括抗体、生长因子、酶等。
这使得CHO细胞在生物制药领域有广泛的应用前景。
培养条件CHO细胞的培养条件对于细胞的生长和表达产物的质量具有重要影响。
以下是一些常用的培养条件：1.培养基：CHO细胞通常使用含有葡萄糖和氨基酸的培养基，如DMEM（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medi um）或RPMI 1640。
培养基中还可以添加胎牛血清（FBS）或人血清蛋白（HSA）等血清成分，以提供细胞所需的营养和生长因子。
2.温度和湿度：CHO细胞通常在37摄氏度的恒温箱中培养，相对湿度约为90%。
温度和湿度的控制对细胞的生长和代谢活性至关重要。
3.pH值：CHO细胞在培养过程中的最适pH值通常在7.0-7.6之间。
重组带状疱疹疫苗（CHO细胞）说明书
应按照当地要求立即处置未使用的药品或废料。
2.接种：
更换针头，使用新针头接种疫苗。
不良反应】
1.全球临床研究
汇总本品在全球开展的17项临床研究，共有17,041名50岁及以上的
成人至少接种了1剂本品。
对本品的安全性评价主要来源于两项安慰剂对照临床研究（ZOSTER-006和ZOSTER-022），这两项研究在北美、拉丁美洲、欧洲、亚洲和澳大利亚开展，涉及按照0、2月程序接种了至少一剂本品（n=14,645）或生理盐水（n=14,660）的29,305例50岁及以上受试者。
受试者首剂接种时的平均年龄为69岁；7,286例（24.9%）受试者的年龄为50至59岁，4,488例（15.3%）受试者的年龄为60至69岁，17,531例（59.8%）受试者的年龄为70岁及以上。
在总人群。
cho细胞的应用场景
cho细胞的应用场景cho细胞（Chinese hamster ovary cell）是一种常用的哺乳动物细胞系，由中国仓鼠卵巢细胞培养而成。
由于其良好的生长特性和高产生物分子的能力，cho细胞已经成为生物制药领域中广泛应用的细胞系。
本文将从药物生产、疫苗研发、疾病模型以及基因工程等方面介绍cho细胞的应用场景。
一、药物生产cho细胞广泛应用于药物生产领域。
由于其稳定的遗传特性和高产物表达能力，cho细胞成为了大规模生产重组蛋白药物的理想细胞工厂。
cho细胞可通过基因工程技术，将需要表达的外源基因导入细胞中，使其产生目标蛋白。
这些目标蛋白包括抗体、生长因子、酶和激素等。
cho细胞的高产能和稳定性使得药物生产过程更加可靠和高效。
二、疫苗研发cho细胞在疫苗研发中也发挥着重要作用。
疫苗是预防疾病的有效手段，而cho细胞可以作为疫苗生产的重要工具。
利用基因工程技术，将病原体的抗原基因导入cho细胞中，使其表达目标抗原。
这些目标抗原可以激发人体免疫系统产生特异性抗体，从而提供对疾病的保护。
cho细胞在疫苗研发中的应用，可以加速疫苗的生产和推广，为人类健康做出贡献。
三、疾病模型cho细胞也被广泛应用于疾病模型研究中。
疾病模型是研究疾病发生机制和药物治疗效果的重要工具。
利用基因编辑技术，可以在cho细胞中模拟多种疾病的相关基因突变。
通过对这些突变cho细胞的研究，可以深入了解疾病的发生和发展过程，为疾病的诊断和治疗提供理论依据。
四、基因工程cho细胞在基因工程中也有着广泛的应用。
基因工程是一种通过改变生物体的遗传信息来获得新的性状或功能的技术。
利用基因编辑技术，可以在cho细胞中精确修改特定基因，实现对基因功能的研究和调控。
这些基因编辑技术包括CRISPR/Cas9、TALEN和ZFN 等。
通过基因工程技术，可以将cho细胞转化为细胞工厂，产生更多有价值的生物产品。
cho细胞在药物生产、疫苗研发、疾病模型和基因工程等领域都有着广泛的应用。
CHO 细胞表达重组DNA 蛋白制品病毒污染风险管理研究
世界最新医学信息文摘 2021年 第21卷 第5期163投稿邮箱：zuixinyixue@·基础研究·CHO 细胞表达重组DNA 蛋白制品病毒污染风险管理研究魏哲学1，2，武志昂1，3＊（通信作者）（1.沈阳药科大学，辽宁 沈阳 110023；2.沈阳三生制药有限责任公司，辽宁 沈阳 110027；3.北京亦度正康健康科技有限公司，北京 100055）0 引言生物制品基于来源可以分为3类：第1类是从人或者动物组织制得的产品，包括从人或动物的器官、组织、血液或其他生物体液当中提取的生物制品。
第2类是病毒疫苗和基因治疗的病毒载体。
第3类是从全面鉴定过的动物细胞表达的生物制品[1]。
中国仓鼠卵巢细胞（CHO ）是常用的细胞系。
这类制品包括细胞因子、单抗和重组亚单位疫苗等。
本文讨论的对象主要是第3类中的细胞因子类产品生产过程中病毒污染的控制问题，拟以风险管理理论为指导，采用失效模式和影响分析（Failure Mode & Effect Analysis ，FMEA ）方法，提取并确立导致失败模式发生的影响因素以及影响的严重程度，进而提出风险管理的建议。
CHO 细胞表达重组DNA 蛋白制品的病毒污染可以分为两类，即内源性病毒污染和外源性病毒污染[2]。
除内源性逆转录病毒样颗粒外，CHO 细胞在细胞培养过程中有可能发生外源性病毒污染，因此需要从物料的质量控制到细胞培养及纯化的全过程进行必要的控制，以降低外源性病毒污染的风险。
基于质量源于设计的原理，产品的质量源于良好的工艺设计，良好的病毒控制效果同样源于病毒控制及除病毒工艺设计。
本文不讨论工艺设计及工艺验证问题，仅就如何确保一个经过良好设计的工艺持续稳定的运行进行讨论。
1 理论与方法简介1.1 风险管理理论。
质量风险管理的过程就是风险最小化的过程[2]，在此过程中我们应当识别风险，选择最有效的方法来降低风险。
风险降低措施得以实施之后，需要进行定期的风险回顾，确认风险降低措施的有效性，确认之前的评估结论及风险降低措施是否符合最新技术和法规的要求。
国产重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)
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现有的国产及进口基因重组乙肝疫苗
生产单位
大连汉信 天坛生物 国内 华药金坦 深圳康泰 北京华尔盾 进口
疫苗名称(种类)
重组乙肝苗（汉逊酵母） 重组乙肝苗（酿酒酵母） 重组乙肝苗（CHO） 重组乙肝苗（酿酒酵母） 重组乙肝苗（CHO） 重组乙肝苗（汉逊酵母） 重组乙肝苗（酿酒酵母） 倍尔来福 10μg/0.5ml/支 5μg/0.5ml/支 10μg/1.0ml/支 10μg/0.5ml/支 10μg/0.5ml/支 5μg/0.5ml/支 10μg/支 10μg/0.5ml/支 10μg/0.5ml/支
6
不同种类疫苗抗体滴度比较
250
200
150
100
50
0
(mIU/ml) GMT 酵母5ug 酵母10ug 华北CHO10ug 华北CHO20ug T1 48.15 67.91 85.23 201.08 (mIU/ml) GMT T3 33.36 35.28 68.17 167.43 (mIU/ml) GMT T6 23.51 39.97 47.31 81.81
CHO乙肝疫苗 啤 酒 酵 母乙肝疫苗
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CHO乙肝疫苗的优势
CHO苗特性 酵母苗特性
重组CHO细胞乙肝疫苗技术为 酵母技术系美国默克公司技术
我国专有技术，国家Ⅰ类新药 型的HBsAg基因，针对性更强 转让。
用我国乙肝病毒流行株adr亚 流行株为adw亚型 由哺乳动物细胞（CHO细胞） 低等的真核细胞酵母菌表达，
陈胤忠，江苏省盐城市CDC，《基因重组乙型肝炎疫苗用于成人的免疫程序和接种剂量的研究》， 《中国计划免疫》2005.2 结果：高剂量疫苗组抗一HBsGMT和抗体高滴度分布比例均高于低剂量疫苗组；重组(CHO细胞) 乙肝疫苗抗一HBsGMT高于重组(酵母)乙肝疫苗，重组(CHO细胞)乙肝疫苗10ug诱导的抗一HBs GMT显著优于10ug重组(酶母)乙肝疫苗。 结论:对成人开展乙肝疫苗接种应选择高剂量的乙肝疫苗，建议选用20ug重组(CHO细胞)乙肝 疫苗．并优先选择0、1、6个月免疫程序。 12 华北制药—金坦生物
cho重组乙肝疫苗制作原理
cho重组乙肝疫苗制作原理宝子们，今天咱们来唠唠cho重组乙肝疫苗这个超厉害的东西的制作原理呀。
咱先得知道乙肝是个啥玩意儿，乙肝病毒可坏啦，它要是跑到咱身体里，就可能让咱肝脏生病呢。
所以呀，科学家们就想办法来预防这个坏家伙，这就有了乙肝疫苗。
那cho重组乙肝疫苗是怎么来的呢？这里面可有着很有趣的科学故事哦。
这个疫苗的制作呀，得从一种细胞说起，就是中国仓鼠卵巢（cho）细胞啦。
这细胞就像是一个小小的工厂呢。
科学家们先把乙肝病毒表面抗原的基因给找出来。
这基因就像是一个密码，它藏着能让身体识别乙肝病毒的关键信息。
然后呢，就像变魔术一样，把这个基因放到cho细胞里。
这就好比把一个特殊的生产配方给了这个小工厂。
这个cho细胞可聪明啦，它拿到这个基因之后呀，就开始按照这个基因里的指示来生产东西。
它生产的就是乙肝病毒表面抗原啦。
这个抗原就像是乙肝病毒的一个小标签，身体的免疫系统只要看到这个小标签，就知道乙肝病毒是个坏家伙啦。
这个生产的过程也不是一下子就完成的呢。
cho细胞要在合适的环境里慢慢悠悠地把这个抗原生产出来。
就像我们做手工一样，得一步一步来，不能着急。
它需要合适的温度、营养啥的。
比如说，就像我们人要吃饭才能有力气干活一样，cho细胞也得有各种营养物质来支撑它生产这个抗原。
等cho细胞生产出足够多的乙肝病毒表面抗原之后呢，就要把这个抗原从细胞里分离出来。
这就像是从工厂的产品里挑选出合格的产品一样。
科学家们会用各种高科技的方法，把这个抗原单独拿出来，然后进行一系列的处理。
处理之后呀，这个抗原就变得更纯净、更安全啦。
然后呢，再把这个抗原和一些其他的东西混合起来，做成疫苗。
这些其他的东西呢，有的是为了让疫苗更稳定，就像给宝贝东西加个保护罩一样；有的是为了让我们的身体更容易接受这个疫苗，就像给它穿上一件友好的外衣。
当我们把这个cho重组乙肝疫苗打到身体里的时候呀，身体里的免疫系统就像一群小卫士一样。
它们看到这个乙肝病毒表面抗原这个小标签，就开始警惕起来啦。
重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞) 华北金坦
重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)【药品名称】通用名称：重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)英文名称：Diagnostic Kit for Hepatitis B e Antigen(ELISA)【成份】本品系由重组CHO细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)，经纯化加佐剂吸附后制成，用于预防乙型肝炎。
疫苗有轻微乳白色沉淀。
【适应证】本疫苗接种后，可刺激机体产生抗乙型肝炎病毒的免疫力，用于预防乙型肝炎。
【用法用量】1.一般新生儿、儿童、成年人接种乙肝疫苗10微克/支，按0、1.6月免疫，三角肌肌内注射。
2.高危人群，尤其是HBsAg阳性母亲的新生儿接种乙肝疫苗20微克/支，按0、1.6月免疫，三角肌肌内注射。
3.HBsAg和HBeAg阳性母亲的新生儿联合使用HBIG与乙肝疫苗20微克/支。
即在出生后6小时内，肌内注射1支HBIG(100IU/毫升)，2-4周后开始注射第一针乙肝疫苗，第二、三针间隔与一般新生儿相同。
【不良反应】乙肝疫苗应用已近20年，尚未见到有严重的不良反应，极个别人接种后可能会出现中、低度发热，或注射局部有轻微胀痛等，一般在24小时内即自行消失。
【禁忌】对发热、患有严重急、慢性疾病和有严重过敏史者暂时都不要接种乙肝疫苗。
【注意事项】1.接种乙肝疫苗前安瓿一定要充分摇匀，如发现安瓿有破裂、疫苗变质或有摇不散的团块时，不能使用。
2.每一接种对象必须使用单独的注射器，防止交叉感染。
【药理作用】CHO(中国仓鼠卵巢细胞)细菌产的乙肝基因工程疫苗是将编码乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的基因插入适当载体，重组到CHO细胞内，表达出HBsAg经纯化和添加佐剂制备出的疫苗。
CHO细胞属哺乳动物细胞类，它是基因工程表达系统中最高等的宿生细胞，其表达产物更接近于天然产品。
【贮藏】于2~8℃避光保存，严防冻结。
【批准文号】国药准字S2*******【生产企业】企业名称：华北制药金坦生物技术股份有限公司。
CHO细胞表达系统研究进展
生物技术进展２０１６年㊀第６卷㊀第４期㊀２３９~２４３ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ㊀ＩＳＳＮ２０９５￣２３４１进展评述Ｒｅｖｉｅｗｓ㊀收稿日期:２０１６￣０２￣２２ꎻ接受日期:２０１６￣０４￣０４㊀作者简介:郑惠惠ꎬ技术员ꎬ主要从事真核重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈａｎｊｖｑｉｕｍｉｎｇ＠１６３.ｃｏｍꎮ∗通信作者:江洪ꎬ工程师ꎬ主要从事重组抗原研发研究ꎮＥ￣ｍａｉｌ:ｊｉａｎｇ＠ｗｏｎｄｅｒｇｅｎ.ｃｏｍＣＨＯ细胞表达系统研究进展郑惠惠ꎬ㊀江㊀洪∗北京万达因生物医学技术有限责任公司ꎬ北京１４１０１７摘㊀要:ＣＨＯ细胞表达系统是目前重组糖蛋白生产的首选系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术和大规模培养技术的应用和不断发展ꎬＣＨＯ细胞表达系统已经成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎬ并被广泛应用于抗体㊁重组蛋白药物和疫苗等产品的研发和生产中ꎮ近年来ꎬ针对ＣＨＯ细胞表达系统在某些重组蛋白的表达和大规模生产中存在的不足ꎬ研究者们通过利用基因工程技术手段ꎬ结合重组蛋白表达机制的研究成果ꎬ为优化和应用ＣＨＯ细胞表达系统做出了不懈努力ꎮ从培养基的优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最近研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的研究与应用提供参考ꎮ关键词:ＣＨＯ细胞培养ꎻ细胞改造ꎻ重组抗原表达ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.２０９５￣２３４１.２０１６.０４.０３ＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣＨＯＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍＺＨＥＮＧＨｕｉ￣ｈｕｉꎬＪＩＡＮＧＨｏｎｇ∗ＢｅｉｊｉｎｇＷｏｎｄｅｒｇｅｎＢｉｏ￣ｍｅｄｉｃｉｎｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＣｏ.Ｌｔｄ.ꎬＢｅｉｊｉｎｇ１４１０１７ꎬＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ:ＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｓｔｈｅｐｒｅｆｅｒｒｅｄｓｙｓｔｅｍｆｏｒｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.Ｗｉｔｈｔｈｅｅｖｏｌｖｉｎｇｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｔｈｅｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓꎬＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｈａｓｂｅｃｏｍｅｔｈｅｍｏｓｔｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｐｒｏｄｕｃｔｓ.Ｔｈｉｓｓｙｓｔｅｍｉｓｗｉｄｅｌｙｕｓｅｄｉｎｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓꎬｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄｖａｃｃｉｎｅｓ.Ｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓꎬｒｅｓｅａｒｃｈｅｒｓｈａｖｅｍａｄｅｇｒｅａｔｅｆｆｏｒｔｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｕｓｉｎｇｌａｔｅｓｔｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｍｅｃｈａｎｉｓｍ.ＴｈｉｓａｒｔｉｃｌｅｂｒｉｅｆｌｙｒｅｖｉｅｗｅｄｔｈｅｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｔｈｅＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｒｅｅａｓｐｅｃｔｓ:ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍꎬｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｓｔｒａｉｎｓｆｏｒｈｉｇｈ￣ｌｅｖｅｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｌａｒｇｅ￣ｓｃａｌｅｃｕｌｔｕｒｅｒｅｓｅａｒｃｈꎬｗｈｉｃｈｗａｓｅｘｐｅｃｔｅｄｔｏｐｒｏｖｉｄｅｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＣＨＯｃｅｌｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙｓｔｅｍ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅꎻｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎻｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｎｔｉｇｅｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ㊀㊀ＣＨＯ细胞是由Ｐｕｃｋ于１９５７年建成的中国仓鼠卵巢成纤维细胞系ꎮ发展至今ꎬＣＨＯ细胞已成为生物技术药物最重要的表达或生产系统ꎮ随着无血清悬浮培养技术㊁基因工程技术㊁生物反应器设计放大与强化技术㊁大规模高密度流加和连续灌注培养技术等的发展ꎬＣＨＯ细胞系统被广泛应用于抗体㊁基因重组蛋白质药物㊁病毒疫苗等生物技术产品的研究开发和工业化生产中ꎮＣＨＯ细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系ꎮ因为它具有准确的转录后修饰功能ꎬ表达的蛋白在分子结构㊁理化特性和生物学功能方面更接近于天然蛋白分子ꎮ但ＣＨＯ细胞在无血清培养基中会出现活力差㊁分泌外源蛋白能力弱等问题ꎮ所以建立稳定㊁高产的重组ＣＨＯ细胞成为很多研究者的目标ꎮ近年来ꎬ研究者从细胞营养㊁代谢㊁凋亡㊁信号传导等角度ꎬ结合蛋白表达机制等研究成果ꎬ对这一目标的实现做出了很多努力ꎮ本文从培养基优化㊁高产重组ＣＨＯ细胞株的构. All Rights Reserved.建㊁大规模培养三个方面综述了ＣＨＯ细胞表达系统的最新研究进展ꎬ以期为ＣＨＯ细胞表达系统的应用提供参考ꎮ１㊀培养基的优化研究发现ꎬ不同的细胞株甚至克隆对营养成分的需求都有差别ꎮ通过筛选比较不同培养基成分对重组抗原生产的影响ꎬ并开发适用于不同重组ＣＨＯ细胞株的培养基ꎬ成为很多研究者提高ＣＨＯ细胞表达系统产量的重要方式ꎮ为了维持细胞在无血清培养基中的正常生长ꎬ需要在基础培养基中添加很多其他因子ꎬ如激素㊁生长因子㊁蛋白水解物等ꎮ蛋白质水解物含有丰富的营养成分ꎬ可有效缩短细胞对无血清培养基的适应过程ꎮＤａｖａｍｉ等[１]通过组合比较不同来源的蛋白水解物对细胞密度及表达产量的影响ꎬ优化得到更适于ＤＧ４４的培养基ꎮ酵母水解物作为一种成本较低的非动物源蛋白水解物ꎬ可以使细胞密度增加的同时ꎬ使重组表达抗体的表达量大幅提高[２]ꎮ大豆水解物等都可以被添加到基础培养基中[１ꎬ３ꎬ４]ꎮ由于蛋白水解物的构成复杂ꎬ且批间差异大ꎬ因此蛋白水解物的添加会影响细胞培养基批次间的稳定性ꎮ如果去除培养基中的蛋白质水解物ꎬ需要添加氨基酸或微量元素等ꎬ通过优化调整其比例ꎬ仍能支持高密度的ＣＨＯ细胞培养[５]ꎮ刘兴茂等[６]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ实验对影响细胞生长的培养添加成分进行了考察ꎬ确定了腐胺㊁胰岛素及转铁蛋白对１１Ｇ￣Ｓ细胞的悬浮培养有明显的生长促进作用ꎮ设计的培养基可以使细胞最大生长密度达到４.１２ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎮＸｕ等[７]采用Ｐｌａｃｋｅｔｔ￣Ｂｕｒｍａｎ设计与支持向量机(ＳＶＭ)预测并实验确定了硫酸锌㊁转铁蛋白及ＢＳＡ对ＣＨＯ￣Ｋ１细胞的生长有促进作用ꎮ另有研究表明ꎬ使用柠檬酸铁作为转铁蛋白的替代物ꎬ可以使细胞的密度达到７.０ˑ１０６ｃｅｌｌｓ/ｍＬꎬ但是会降低转染效率[８]ꎮＭｉｋｉ等[９]研究发现ꎬ添加生长因子ＩＧＦ￣１和脂类信号分子溶血磷脂酸(ＬＰＡ)也可以有效加速ＣＨＯ细胞生长ꎮ优化培养基能有效提高重组ＣＨＯ细胞的培养密度ꎮ高密度的ＣＨＯ细胞培养是ＣＨＯ细胞表达系统实现工业化生产应用的必要条件之一ꎮ与大肠杆菌和酵母表达系统相比ꎬＣＨＯ细胞有生长较慢㊁培养周期较长㊁产量较低等缺点ꎮ为了提高重组蛋白产量㊁扩大ＣＨＯ细胞表达系统的生产应用范围ꎬ研究者们在优化培养基的实验基础上ꎬ构建高产的重组ＣＨＯ细胞系ꎬ为大规模的重组蛋白生产提供基础ꎮ２㊀高产重组ＣＨＯ细胞株的构建研究者们利用发展迅速的基因编辑技术对ＣＨＯ细胞进行筛选和改造ꎬ得到高产的重组细胞株ꎮ研究者们通过过量表达或敲除某个基因ꎬ调整代谢途径㊁延缓细胞凋亡㊁增强转录表达效率ꎬ有效的增加了重组蛋白产量ꎮ通过结合全基因组测序和基因敲除技术的研究成果ꎬ研究者们为得到反应性更好的糖基化重组蛋白做出了不懈努力ꎮ２.１㊀调整代谢途径乳酸作为糖酵解产生的代谢产物会影响细胞生长ꎮＺｈｏｕ等[１０]使用ｓｉＲＮＡ技术降低乳酸脱氢酶Ａ(ＬＤＨａ)和丙铜酸脱氢酶激酶(ＰＤＨＫｓ)基因的表达ꎬ使乳酸的产生降低了９０％ꎬ并增加了单抗的产量ꎮＴｏｕｓｓａｉｎｔ等[１１]通过在ｒＣＨＯ中表达酵母丙酮酸羧化酶(ＰＹＣ２)ꎬ改变了流加培养方式中葡萄糖的代谢速率ꎬ增长了细胞的对数生长期ꎬ从而增加了细胞密度及产量ꎮ２.２㊀延缓细胞凋亡为了延长细胞培养的时间从而增加产量ꎬ有研究者建立了能表达抗凋亡基因的ＣＨＯ细胞系ꎮＭａｊｏｓ等[１２]通过在ＣＨＯ中表达１个Ａｓｐ２９Ａｓｎ突变的抑制凋亡基因ꎬ有效延缓了细胞凋亡ꎮ也有研究者通过敲除细胞中的促凋亡基因来延缓细胞凋亡ꎬ如Ｃｏｓｔ等[１３]敲除了ＢＣＬ２相关蛋白Ｘ(ＢＡＸ)和ＢＡＫ的基因ꎬ使单克隆抗体产量增加了５倍ꎮＲｉｔｔｅｒ等[１４]发现８号染色体端粒区的缺失也可以使产物产量成倍增加ꎮ２.３㊀增强转录表达效率有研究者在细胞信号通路研究成果的基础上ꎬ通过表达转录及翻译过程中的相关蛋白ꎬ增强转录和表达效率ꎬ以增加目的重组蛋白的产量ꎮＬｅＦｏｕｒｎ等[１５]通过在ＣＨＯ中表达人信号受体蛋白ＳＲＰ１４ꎬ成功增加了分泌表达的重组蛋白的产０４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.量ꎮＰｅｎｇ等[１６]通过表达转录翻译相关蛋白ＳＬＹ１㊁ＭＵＮＣ１８Ｃ和ＸＢＰ１ꎬ使ＩｇＧ的产量提高了２０倍ꎻＲａｈｉｍｐｏｕｒ等[１７]在ＣＨＯ细胞中表达神经酰胺转移蛋白(ＣＥＲＴ)的突变基因使ｔ￣ＰＡ的产量增加了３５％ꎮ２.４㊀表达糖基化酶能产生糖基化的重组蛋白是ＣＨＯ细胞表达系统重要的优势ꎬ研究者们通过建立能表达Ｎ￣糖基化途径中不同酶类的细胞系以增加糖基化重组蛋白的反应性ꎮ如Ｇｏｈ[１８]建立的一个含有Ｎ￣乙酰氨基葡萄糖转移酶Ｉ基因的突变体ＣＨＯ￣ｇｍｔ４细胞系ꎬ其表达的重组葡萄糖脑苷脂酶将不需要多糖重构可直接用于治疗戈谢病患者ꎮＺｈａｎｇ等[１９]通过ＣＨＯ￣ｇｍｔ５细胞株表达的重组抗体ꎬ其Ｆｃ的Ｎ￣多糖缺少岩藻糖和唾液酸能增强ＡＤＣＣ的作用ꎮ根据ＣＨＯ￣Ｋ１的基因组信息ꎬＹａｎｇ等[２０]通过锌指核酸酶(ＺＦＮｓ)基因敲除的方法ꎬ研究了１９种包括作用于Ｎ￣糖基链分支㊁半乳糖基㊁聚ＬａｃＮＡｃ延伸㊁唾液酸化加盖的Ｎ￣糖基转移酶对Ｎ￣糖基化作用的影响ꎬ为更准确的表达特定糖基化方式的重组蛋白提供了重要参考ꎮ重组ＣＨＯ细胞表达重组蛋白能力的高低ꎬ不能简单的归结为某些关键基因的作用ꎮ为了得到高产的重组细胞株ꎬ需要研究者们综合考虑细胞的代谢情况㊁培养条件㊁蛋白表达效率和蛋白加工修饰能力等诸多因素ꎮ３㊀大规模培养研究基因工程技术㊁细胞融合技术及抗体类药物的迅速发展ꎬ推进了生物反应器培养技术在生物制药中的应用ꎮ由于ＣＨＯ细胞能以悬浮培养的方式高密度培养ꎬ培养体积可达１０００Ｌ以上ꎬ所以在大规模培养和重组蛋白的高产量生产中ꎬＣＨＯ细胞表达系统拥有广阔的发展前景ꎮ在大规模生产中ꎬ通常采用流加培养方式ꎬ通过添加营养物质来延长培养时间ꎬ增加细胞密度和目的产品的浓度ꎮ为了更大程度的提高重组蛋白的生产效率ꎬ研究者们需要根据不同细胞株的生长代谢特点ꎬ选择和优化起始培养基㊁补料培养基及补料策略ꎮ现代计算机技术㊁数学算法及理论的应用ꎬ也为研究者对细胞流加培养的优化提供了很大帮助ꎮ３.１㊀优化培养参数选择合适的培养基㊁优化细胞培养的参数(如温度㊁ｐＨ㊁溶氧㊁ＣＯ２浓度㊁渗透压等)对生产至关重要ꎮ同时ꎬ流加工艺参数(如流加培养基成分㊁流加时间等)均需根据不同的细胞株及反应器的特点来设计优化ꎮＦａｎ等[２１]采用分批补料方式培养ＣＨＯ细胞ꎬ实验显示培养基中的氨基酸和葡萄糖浓度对细胞的生长㊁ＩｇＧ浓度和Ｎ￣糖基化生成都很重要ꎮＫｉｍ等[２２]使用分批补料培养使ＩｇＧ的产量达到２.３ｇ/Ｌꎮ通过用小麦蛋白水解物(ＷＧＨ)代替补料中的谷氨酰胺可以使ｔ￣ＰＡ的产量达到４２２ｍｇ/Ｌ[２３]ꎮ３.２㊀应用新的培养技术微载体培养是一种动物细胞大规模培养技术ꎮ培养液中大量的微载体为细胞提供了极大的附着表面ꎬ从而可实现细胞的高密度培养ꎮ胡显文等[２４]在搅拌式反应器中无血清培养分泌ｕ￣ＰＡ的ＤＮＡ重组ＣＨＯ细胞ꎬ通过部分更换Ｃｙｔｏｐｏｒｅ多孔微载体ꎬ解决了大规模细胞培养中细胞凋亡的问题ꎮ并使用周期变压刺激技术使ｕ￣ＰＡ的产量提高了１０倍ꎬ且可以降低葡萄糖厌氧代谢产生乳酸的转化率ꎮＶｅｎｔｉｎｉ等[２５]通过Ｃｙｔｏｄｅｘ微载体培养ＣＨＯ￣ｈＴＳＨ细胞的实验表明ꎬ培养基中微载体的数量及在ｒｈＴＳＨ合成期开始时的细胞浓度是提高目的蛋白产量的重要参数ꎮ李智等[２６]利用ＣＨＯ细胞能在培养过程中自然结团的特性ꎬ采用超声沉降柱二合一灌流系统促进细胞结团和加强截留的特性ꎬ用无血清培养基连续灌流培养基因重组ＣＨＯ细胞ＭＫ３￣Ａ２株ꎬ分泌表达的ｒｈＴＮＫ￣ｔＰＡ生产率平均为８９ｍｇ/Ｌ ｄꎮ３.３㊀添加保护剂聚醚Ｆ６８可以有效减少生物反应器中搅拌对细胞产生的机械损伤ꎮ针对Ｆ６８对某些细胞株的生长及产量降低的情况ꎬ研究者发现０.０５％或０.０７５％的５００ｋＤａ的γＰＧＡ可以替代Ｆ６８应用于ＣＨＯＤＧ４４细胞的培养中[２７]ꎮ在细胞培养工艺逐级放大的过程中ꎬ每一步都需要研究者们监控细胞在生长和表达方面的相关指标ꎮ生物反应器在线监控ｐＨ㊁溶氧等参数的功能㊁色谱和在线蛋白分解监测等技术为大规模培养的过程控制提供了帮助ꎮ１４２郑惠惠ꎬ等:ＣＨＯ细胞表达系统研究进展. All Rights Reserved.４ 展望ＣＨＯ细胞是表达外源蛋白最多也是最成功的一类细胞ꎬ有其不可比拟的优点ꎬ同时也存在现行技术手段不能弥补的不足之处ꎮ结合生物信息学㊁细胞生物学㊁基因工程技术和生物反应器技术的研究成果ꎬ研究者们可以通过综合考虑细胞代谢特性㊁蛋白表达特性等影响因素ꎬ通过研发个性化培养条件及培养工艺ꎬ构建高表达载体ꎬ筛选稳定高产的重组细胞株ꎬ改造宿主细胞等角度继续优化ＣＨＯ细胞表达系统ꎬ为产业化生产重组蛋白提供基础ꎮ用于产业化生产的重组ＣＨＯ细胞ꎬ需要具备生长特性良好㊁能在无血清培养基中高密度培养㊁表达重组蛋白能力强㊁能正确的进行翻译后修饰等特点ꎮ糖基化是蛋白翻译后最重要的修饰之一ꎬ直接影响重组蛋白的空间结构㊁生物活性㊁稳定性㊁免疫原性和生物反应性等ꎮ对重组蛋白的糖基化研究一直是研发和生产真核重组蛋白的热点课题ꎮ随着基因编辑技术的发展ꎬ研究者们通过表达特定糖基化相关酶从而得到完整㊁准确的特定形式的糖链结构ꎬ为糖基化蛋白在免疫诊断㊁临床治疗等领域的持续发展奠定了基础ꎮ随着基因技术的不断发展ꎬ对细胞代谢㊁信号传导等方面研究的持续深入ꎬ构建能表达准确修饰的糖基化重组蛋白的高产重组ＣＨＯ细胞株仍将成为研究热点ꎮ参㊀考㊀文㊀献[１]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＥｇｈｂａｌｐｏｕｒＦꎬＮｅｍａｔｏｌｌａｈｉＬꎬｅｔａｌ..ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｐｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉａｏｎｇｒｏｗｔｈꎬｍｅｔａｂｏｌｉｃｐａｔｈｗａｙａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯＤＧ４４ｃｅｌｌｓ:ａｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｉｎｔｏａｍｉｎｏａｃｉｄｐｒｏｆｉｌｅｓ[Ｊ].Ｉｒａｎ.Ｂｉｏｍｅｄ.Ｊ.ꎬ２０１５ꎬ１９(４):１９４－２０５.[２]㊀ＳｕｎｇＹＨꎬＬｉｍＳＷꎬＣｈｕｎｇＪＹꎬｅｔａｌ..Ｙｅａｓｔｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅａｓａｌｏｗ￣ｃｏｓｔａｄｄｉｔｉｖｅｔｏｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎｉｎｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｓｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００４ꎬ６３(５):５２７－５３６.[３]㊀ＤａｖａｍｉＦꎬＢａｌｄｉＬꎬＲａｊｅｎｄｒａＹꎬｅｔａｌ..ＰｅｐｔｏｎｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｈａｓｖａｒｉａｂｌｅｅｆｆｅｃｔｓｏｎｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｉｎｔ.Ｊ.Ｍｏｌ.ＣｅｌｌＭｅｄ.ꎬ２０１４ꎬ３(３):１４６－１５６.[４]㊀ＣｈｕｎＢＨꎬＫｉｍＪＨꎬＬｅｅＨＪꎬｅｔａｌ..Ｕｓａｂｉｌｉｔｙｏｆｓｉｚｅ￣ｅｘｃｌｕｄｅｄｆｒａｃｔｉｏｎｓｏｆｓｏｙｐｒｏｔｅｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓｆｏｒｇｒｏｗｔｈａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｐｒｏｔｅｉｎ￣ｆｒｅｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ.Ｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２００７ꎬ９８(５):１０００－１００５.[５]㊀张大鹤ꎬ易小萍ꎬ张元兴ꎬ等ꎬ适于重组ＣＨＯ细胞培养的无血清培养基的制备[Ｊ].中国生物制品学杂志ꎬ２０１１(１０):１１５２－１１５６.[６]㊀刘兴茂ꎬ刘红ꎬ叶玲玲ꎬ等ꎬＣＨＯ工程细胞无血清悬浮分批培养的生长代谢特征及动力学模型[Ｊ].生物工程学报ꎬ２０１０ꎬ(１):８５－９２.[７]㊀ＸｕＪꎬＹａｎＦＲꎬＬｉＺＨꎬｅｔａｌ..Ｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｂａｓｅｄｏｎｔｒｉａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｓｕｐｐｏｒｔｖｅｃｔｏｒｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｍｅｄ.Ｒｅｓ.Ｉｎｔ.ꎬ２０１４ꎬｄｏｉ:１０.１１５５/２０１４/２６９３０５. [８]㊀ＥｂｅｒｈａｒｄｙＳＲꎬＲａｄｚｎｉａｋＬꎬＬｉｕＺ.Ｉｒｏｎ(ＩＩＩ)ｃｉｔｒａｔｅｉｎｈｉｂｉｔｓｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ￣ｍｅｄｉａｔｅｄｔｒａｎｓｉｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ６０:１－９.[９]㊀ＭｉｋｉＨꎬＴａｋａｇｉＭ.Ｄｅｓｉｇｎｏｆｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍｆｏｒｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｏｎｔｈｅｂａｓｉｓｏｆｇｅｎｅｒａｌｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｍｅｄｉａ[Ｊ].Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ６７(４):６８９－６９７.[１０]㊀ＺｈｏｕＭꎬＣｒａｗｆｏｒｄＹꎬＮｇＤꎬｅｔａｌ..ＤｅｃｒｅａｓｉｎｇｌａｃｔａｔｅｌｅｖｅｌａｎｄｉｎｃｒｅａｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒＯｖａｒｙｃｅｌｌｓ(ＣＨＯ)ｂｙｒｅｄｕｃｉｎｇｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅａｎｄｐｙｒｕｖａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｋｉｎａｓｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１５３(１－２):２７－３４.[１１]㊀ＴｏｕｓｓａｉｎｔＣꎬＨｅｎｒｙＯꎬＤｕｒｏｃｈｅｒＹ.ＭｅｔａｂｏｌｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｔｏａｌｔｅｒｌａｃｔａｔｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｄｕｒｉｎｇｆｅｄ￣ｂａｔｃｈｃｕｌｔｕｒｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ２１７:１２２－１３１.[１２]㊀ＭａｊｏｒｓＢＳꎬＣｈｉａｎｇＧＧꎬＰｅｄｅｒｓｏｎＮＥꎬｅｔａｌ..Ｄｉｒｅｃｔｅｄｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｍａｍｍａｌｉａｎａｎｔｉ￣ａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｓｂｙｓｏｍａｔｉｃｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ[Ｊ].ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ.Ｄｅｓ.Ｓｅｌ.ꎬ２０１２ꎬ２５(１):２７－３８.[１３]㊀ＣｏｓｔＧＪꎬＦｒｅｙｖｅｒｔＹꎬＶａｆｉａｄｉｓＡꎬｅｔａｌ..ＢＡＫａｎｄＢＡＸｄｅｌｅｔｉｏｎｕｓｉｎｇｚｉｎｃ￣ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅｓｙｉｅｌｄｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔＣＨＯｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１０ꎬ１０５(２):３３０－４０. [１４]㊀ＲｉｔｔｅｒＡꎬＶｏｅｄｉｓｃｈＢꎬＷｉｅｎｂｅｒｇＪꎬｅｔａｌ..Ｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆａｔｅｌｏｍｅｒｉｃｒｅｇｉｏｎｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ８ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓｗｉｔｈｈｉｇｈｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１６ꎬ１１３(５):１０８４－１０９３.[１５]㊀ＬｅＦｏｕｒｎＶꎬＧｉｒｏｄＰＡꎬＢｕｃｅｔａＭꎬｅｔａｌ..ＣＨＯｃｅｌｌｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｏｐｒｅｖｅｎｔｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｉｏｎ[Ｊ].Ｍｅｔａｂ.Ｅｎｇ.ꎬ２０１４ꎬ２１:９１－１０２.[１６]㊀ＰｅｎｇＲＷꎬＦｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒＭ.ＭｏｌｅｃｕｌａｒｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｆｅｘｏｃｙｔｉｃｖｅｓｉｃｌｅｔｒａｆｆｉｃｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２００９ꎬ１０２(４):１１７０－１１８１.[１７]㊀ＲａｈｉｍｐｏｕｒＡꎬＶａｚｉｒｉＢꎬＭｏａｚｚａｍｉＲꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｔｈｅｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｏｔｅｉｎｓｅｃｒｅｔｏｒｙｐａｔｈｗａｙｆｏｒｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｉｓｓｕｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓ:ｅｆｆｅｃｔｓｏｆＣＥＲＴａｎｄＸＢＰ１ｓｇｅｎｅｓ[Ｊ].Ｊ.Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１３ꎬ２３(８):１１１６－１１２２. [１８]㊀ＧｏｈＪＳꎬＬｉｕＹꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＰｒｏｄｕｃｉｎｇｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓｗｉｔｈｅｎｈａｎｃｅｄｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎｕｓｉｎｇＣＨＯ￣ｇｍｔ４ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎｍｕｔａｎｔｃｅｌｌｓ[Ｊ].Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄꎬ２０１４ꎬ５２４２生物技术进展ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ. All Rights Reserved.(４):２６９－２７３.[１９]㊀ＺｈａｎｇＰꎬＨａｒｙａｄｉＲꎬＣｈａｎＫＦꎬｅｔａｌ..ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｔｈｅＧＤＰ￣ｆｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒＳＬＣ３５Ｃ１ｕｓｉｎｇａｎｏｖｅｌＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｍｕｔａｎｔ[Ｊ].Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ２２(７):８９７－９１１.[２０]㊀ＹａｎｇＺꎬＷａｎｇＳꎬＨａｌｉｍＡꎬｅｔａｌ..ＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＣＨＯｃｅｌｌｓｆｏｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｉｖｅｒｓｅꎬｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ[Ｊ].Ｎａｔ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１５ꎬ３３(８):８４２－８４４.[２１]㊀ＦａｎＹꎬＪｉｍｅｎｅｚＤｅｌＶａｌＩꎬＭｕｌｌｅｒＣꎬｅｔａｌ..Ａｍｉｎｏａｃｉｄａｎｄｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｆｆｅｃｔｓａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１５ꎬ１１２(３):５２１－５３５.[２２]㊀ＫｉｍＢＪꎬＺｈａｏＴꎬＹｏｕｎｇＬꎬｅｔａｌ..Ｂａｔｃｈꎬｆｅｄ￣ｂａｔｃｈꎬａｎｄｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｕｌｔｕｒｅｓｗｉｔｈＣＨＯｃｅｌｌｌｉｎｅｓｉｎａｐｒｅｓｓｕｒｅ￣ｃｙｃｌｅｄｒｉｖｅｎｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｂｉｏｅｎｇ.ꎬ２０１２ꎬ１０９(１):１３７－１４５.[２３]㊀ＫｉｍｄｏＹꎬＣｈａｕｄｈｒｙＭＡꎬＫｅｎｎａｒｄＭＬꎬｅｔａｌ..Ｆｅｄ￣ｂａｔｃｈＣＨＯｃｅｌｌｔ￣ＰＡｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｆｅｅｄｇｌｕｔａｍｉｎｅｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｔｏｒｅｄｕｃｅａｍｍｏｎｉａｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｐｒｏｇ.ꎬ２０１３ꎬ２９(１):１６５－１７５.[２４]㊀胡显文ꎬ肖成祖ꎬ高丽华ꎬ等.用多孔微载体大规模长期培养动物细胞的方法[Ｊ].生物技术通报ꎬ２００１ꎬ(１):４５－４８. [２５]㊀ＶｅｎｔｉｎｉＤＣꎬＤａｍｉａｎｉＲꎬＳｏｕｓａＡＰꎬｅｔａｌ..ＩｍｐｒｏｖｅｄｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｗｉｔｈＣＨＯ￣ｈＴＳＨｃｅｌｌｓｏｎｈｉｇｈｅｒｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｐｒｏｖｉｄｅｓｈｉｇｈｅｒｏｖｅｒａｌｌｂｉｏｍａｓｓａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙｆｏｒｒｈＴＳＨ[Ｊ].Ａｐｐｌ.Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.ꎬ２０１１ꎬ１６４(４):４０１－４０９.[２６]㊀李智ꎬ肖成祖ꎬ杨琴ꎬ等.ＣＨＯ细胞无血清结团灌流培养:超声－沉降柱二合一灌流系统[Ｊ].中国生物工程杂志ꎬ２００８ꎬ(４):５３－５８.[２７]㊀ＣｈｕｎＢＨꎬＬｅｅＹＫꎬＣｈｕｎｇＮ.Ｐｏｌｙ￣ｇａｍｍａ￣ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｅｎｈａｎｃｅｓｔｈｅｇｒｏｗｔｈａｎｄｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔｅｒｏｖａｒｙｃｅｌｌｓｉｎｓｅｒｕｍ￣ｆｒｅｅｍｅｄｉｕｍ[Ｊ].Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ.Ｌｅｔｔ.ꎬ２０１２ꎬ３４(１０):１８０７－１８１０.３４２郑惠惠ꎬ等:ＣＨＯ细胞表达系统研究进展. All Rights Reserved.。
重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)研究概述
重组乙型肝炎疫苗（CHO细胞）研究概述作者：曹洋洋来源：《世界家苑·学术》2017年第07期摘要：全世界目前有慢性乙肝病毒感染3.5亿人，我国目前有慢性乙肝病毒感染1.3亿人，慢性乙肝病毒感染严重威胁着人类健康。
慢性乙肝病毒持续感染会发展为慢性肝炎、肝硬化、肝癌，故积极防治慢性乙肝病毒感染非常重要。
重组[中国仓鼠卵母细胞（（CHO细胞）乙肝疫苗]是采用基因工程技术将无传染性的乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的s基因片段克隆到载体，用重组载体转染真核生物CHO细胞，通过细胞培养、增殖、分泌出HBs旭到培养液中，收集分泌液，经高速离心、纯化、除菌后，加入佐剂吸附（氢氧化铝）而制成。
提取总的核酸RNA，逆转录成cDNA，利用特异l性引物扩增出轻重链Fd片段，成功构建人源抗乙肝病毒表面抗原基因工程抗体文库。
富集筛选，通过ELISA功能分析和序列测定，选择有较高的亲和力的抗体。
关键词：乙肝；CHO；基因重组；抗体1.背景介绍乙型肝炎病毒（HBV）属嗜肝DNA病毒科正嗜肝DNA病毒属，HBV感染严重威胁人类生命健康，HBV感染在我国是一个严重的公共卫生问题。
接种乙肝疫苗对预防乙肝病毒感染，控制乙肝病毒传播具有重要意义。
在HBsAg的两种表达系统中，利用CHO细胞表达的乙肝表面抗原具有免疫原性强，阳转率高的优点，但产量低是目前遇到的主要问题。
1.1乙肝病毒基因组结构HBV基因组是一部分双链DNA分子，由约3200个碱基对组成。
HBV的DNA双链中，短链称为正链，长度可变。
两条链5’端开始的250个核普酸交错排列，其碱基互补配对，故HBV DNA可保持环形。
HBV基因结构1.2乙肝病毒的分子生物学性质完整的HBV颗粒，即Dane颗粒，直径为42nm，由外膜和核衣壳组成。
外膜由HBsAg组成，后者含有一个环状的部分双链DNA分子，DNA多聚酶（P蛋白），DNA结合蛋白（C蛋白），及蛋白激酶（X蛋白）等。
1.3 CHO细胞表达系统蛋白质在合成过程中往往要经过翻译后的加工和修饰，才能成为有活性的蛋白质。
用于表达蛋白质的CHO细胞系统介绍
主要细胞系
DG44
CHO-K1
是否缺陷型
缺陷型
野生型和缺陷型（Lonza新推出）
筛选方法
利用浓度不断提高的二氢叶酸还原酶的抑制物氨甲喋呤(methotrexate ,MTX)选择抗MTX的细胞系,使DHFR基因及与之相连的目的基因一起扩增,达到提高目的基因表达水平的目的。
加入谷氨酰胺合成酶的抑制物甲硫氨酸亚砜(methioninesulphoximine,MSX) ,可使GS基因及与之相连的目的基因一起扩增,达到提高目的基因表达水平的目的。
筛选难易
需要不断提高MTX的浓度，去除选择压力后，扩增基因不稳定，较难
正常MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，较易
CHO-DHFR-细胞缺失二氢叶酸还原酶（DHFR），无法自身合成四氢叶酸，在没有次黄嘌呤（hypoxanthine）和胸腺嘧啶（Thymidine）时会死亡。用含有含单抗蛋白等的目的基因及与之相连的DHFR基因的表达载体，转染宿主细胞CHODHFR细胞，使其能利用二氢叶酸还原酶的抑制物氨甲喋呤(methotrexate ,MTX)进行筛选。
筛选难易需要不断提高mtx的浓度去除选择压力后扩增基因不稳定较难正常msx浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞较易蛋白表达量普通12gl较高29gl倍增时间23天1天主要有害代谢产物乳酸和氨较多较少细胞长期生长稳定性较稳定较差
用于表达单抗蛋白的CHO细胞系统介绍
细胞系统
DHFR系统
GS系统
CHO细胞表达抗体1
利用超滤膜将抗体从溶液中分离出来，适用于大规模生产中的抗体 纯化。
鉴定技术
1 2 3
ELISA法
酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常用的抗体 鉴定技术，通过抗原-抗体特异性结合的原理， 检测抗体的存在和浓度。
Western Blot法
Western Blot是一种将蛋白质从混合物中分离并 检测其特性的技术，适用于抗体特异性和亲和力 的鉴定。
诊断试剂领域
免疫诊断试剂
CHO细胞表达的抗体可用于免疫诊断试剂的制备，如酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫荧光技术等，用于检测 生物样品中的特定抗原或抗体。
分子诊断试剂
CHO细胞表达的抗体可用于分子诊断试剂的制备，如PCR技术、基因芯片技术等，用于检测生物样品中的特定基 因或蛋白质。
科研领域
抗体库构建
稳定性检测
通过加速稳定性试验等方法检测抗体的稳定 性，确保抗体的长期保存和使用效果。
05
CHO细胞表达抗体的应用
生物医药领域
抗体药物研发
CHO细胞表达的抗体可用于抗体药物 的研发，包括单克隆抗体、双特异性 抗体等，用于治疗癌症、自身免疫性 疾病等。
细胞免疫治疗
CHO细胞表达的抗体可用于细胞免疫 治疗，如CAR-T细胞疗法，通过改造 患者自身的免疫细胞，使其能够特异 性识别并攻击肿瘤细胞。
抗体在科研领域的应用
抗体作为重要的研究工具，可用于研究细胞信号传导、蛋白质相互 作用等生命过程，推动生物医学领域的发展。
02
CHO细胞表达抗体技术
CHO细胞的特点
高效表达
01
CHO细胞具有高效的蛋白表达能力，能够稳定地生产大量的抗无血清培养基中生长，简化了培养过程，降低
重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)
重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)Chongzu Yixing Ganyan Yimiao(CHO Xibao ) Hepatitis B Vaccine Made by Recombinant DNA Techniques in CHO Cell本品系由重组CHO细胞表达的乙型肝炎(简称乙肝)病毒表面抗原 (HBsAg) 经培养、纯化, 加入氢氧化铝佐剂后制成, 用于预防乙型肝炎。
1 基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物应符合“凡例”有关要求。
2 制造2.1 生产用细胞2.1.1 细胞名称及来源生产用细胞为DNA重组技术获得的表达HBsAg的CHO细胞C株。
282.1.2 细胞库的建立及传代应符合“生物制品生产用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
C株主细胞库的传代应不超过第21代，工作细胞库应不超过第26代，28生产疫苗的最终细胞代次应不超过第33代。
2.1.3 主细胞库及工作细胞库的检定应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程”规定。
2.1.3.1 细胞外源因子检查无菌、支原体、细胞病毒外源因子检查均应符合规定。
2.1.3.2 细胞鉴别试验应用同功酶分析、生物化学方法、免疫学、细胞学和遗传标记物等任何方法进行鉴别，应为典型CHO细胞。
2.1.3.2.1 细胞染色体检查用染色体分析法进行检测，染色体应为20条。
2.1.3.2.2 目的蛋白鉴别采用ELISA检测，应证明为HBsAg。
2.1.3.3 HBsAg表达量主细胞库及工作细胞库细胞HBsAg表达量应不低于原始细胞库的表达量。
2.1.4 保存细胞种子应保存于液氮中。
2．2 原液2.2.1 细胞制备取工作细胞库细胞，复苏培养后，经胰蛋白酶消化, 置适宜条件下培养。
2.2.2 培养液培养液为含有适量灭能新生牛血清的DMEM液。
新生牛血清的质量应符合规定（附录XIII D）。
2.2.3 细胞收获培养适宜天数后，弃去培养液，换维持液继续培养适1－2天后，当细胞表达HBsAg达到1.0 mg/L以上时收获培养上清。
CHO细胞表达系统的应用与研究
长生研
CHO细胞的五大应用优势
安全性高 蛋白的转录后修饰 与人体细胞相似
外源蛋白容易在CHO细胞 中合成并分泌到培养基中 可贴壁或者 悬浮培养
BHK
CHO
无血清培养时细胞 密度高于其它细胞
NSO
长生研
FDA批准的CHO细胞表达的生物技术药物
产品 商品名 公司
处于临床研究阶段：
临床前：
长生研
国内CHO细胞表达系统的两大技术瓶颈
表达量低
以tPA为例，达到年产量100克
表达量 g/(106cellsd) 中国 美国 5 50
生产100g/年 需要细胞罐（L） 5000L 500L
生产成本 （美元/克） 60000-100000 6000-10000
适应证
不孕症 不孕症 血清甲状腺球蛋白测试 急性心梗；肺栓塞，急性脑中风
粘多糖贮积病 Gaucher's病 艾杜糖硫酸酯酶缺乏症 Fabry's病 囊性纤维化 急性心梗 血友病B 血友病A 血友病A 多发性硬皮病 肾性贫血 肾性贫血 脊骨退行性病变的脊骨融合 胫骨骨折 转移性结肠癌或直肠癌 B-细胞慢性淋巴细胞白血病 转移性乳腺癌 慢性中重度银屑病 视网膜黄斑退化 CD20+ B细胞non-Hodgkin's淋巴瘤 中重度持续性哮喘 肾移植急性排斥 中重度银屑病 中重度类风湿关节炎；银屑病 脓毒症
长生研
改变细胞的能量代谢途径
引入基因
长生研cho国药集团长春生物制品研究所生物技术研究室200911wwwccibpcom长生研cho细胞表达系统的优势与国内外应用情况cho细胞的工程化构建cho细胞表达平台的意义和流程简介基因重组生物技术产品的表达系统及应用wwwccibpcom长生研基因重组生物技术产品的表达系统?大肠杆菌表达系统?酵母表达系统哺乳动物细胞表达系统分子量较小结构相对简单的蛋白质分子量较大结构较复杂较少糖基化的蛋白质结构复杂或糖基化对于活性非常重要的蛋白质wwwccibpcom长生研大肠杆菌表达系统的应用大肠杆菌表达的生物技术药物有20种分别是甲状旁腺激素利尿钠肽胰岛素及其两种突变体生长激素干扰素和gcsf白介素1ra白介素2白介素11rpa白喉毒素il2融合蛋白ospa脂蛋白等
cho细胞表达
cho细胞表达Cho细胞表达是指在生物学中，利用Cho细胞（Chinese Hamster Ovary cells）作为表达系统来表达外源蛋白质的过程。
Cho细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，具有较高的蛋白质表达能力和稳定的遗传特性，因此被广泛应用于生物医学研究和制药工业中。
Cho细胞表达系统的优势在于其能够高效地表达外源蛋白质，并能够正确地折叠和修饰蛋白质。
Cho细胞具有相对简单的遗传背景和较低的背景蛋白质表达，可以避免其他细胞系统中常见的问题，如蛋白质聚集、不稳定、部分折叠等。
此外，Cho细胞的培养和维持相对容易，生长速度快，适应不同的培养条件，对不同的基因表达系统都具有较高的兼容性。
Cho细胞表达系统的应用范围广泛，包括生物医学研究、药物发现与研发、生物制药等领域。
在生物医学研究中，Cho细胞表达系统常被用于产生重组蛋白，如抗体、细胞因子、酶等，用于研究蛋白质功能、结构与机制。
在药物发现与研发中，Cho细胞表达系统被用于产生药物靶标蛋白、药物载体、药物代谢酶等，用于筛选和评价药物候选化合物。
在生物制药中，Cho细胞表达系统常被用于大规模生产重组蛋白药物，如单克隆抗体、重组蛋白等。
Cho细胞表达系统的建立和优化需要考虑多个因素。
首先，选择合适的载体和表达系统是关键。
常用的载体包括质粒、病毒载体等，表达系统可以是稳定转染系统或转染后选择稳定表达细胞的系统。
其次，选择合适的表达宿主细胞株和培养条件也十分重要。
Cho细胞的培养基和培养条件需要根据表达蛋白的特性和需求进行优化，包括培养基成分、温度、pH值、培养密度等。
此外，还需考虑到蛋白质折叠、修饰和纯化等后续步骤。
Cho细胞表达系统的优势也存在一些限制和挑战。
首先，Cho细胞是一种非人类细胞，因此相较于人类细胞，其表达的蛋白质可能存在差异。
其次，Cho细胞在遗传稳定性和蛋白质表达水平上存在一定的变异性，需要进行筛选和优化。
此外，Cho细胞的培养和维持相对费时费力，对于大规模的生产需求可能不太适用。
CHO细胞表达抗体讲义
启动子和相应的增强 子是最关键的元件 真核启动子含有TATA 盒（确定转录起始位 点）和下游富含GC的 序列（决定转录起始 频率）
常用的CHO细胞表达启 动子的转录活性依次
为CMV启动子> SV40 启
动子> LTR启动子
表达盒
抗体基因表达盒的组织形式 已较为固定 ， 但其中各元件 的选择仍有值得探讨的地方
宿主细胞：DG44 质粒：共转染PcDNA3.3（Neo抗
性基因 ， ￥2000） 和Poptivec（DHFR标 记基因 ，￥3500）
筛选试剂：G418（遗传霉素）/MTX （氨甲喋呤）
CHO Cell
CHO-K1
野生型宿主 细胞
CHO-S
GS基因表达系统 瑞士的Lonza公司
宿主细胞：CHO-K1SV 质粒：PEE12.4（Amp抗性 ，GS标记基因， ￥2000） 筛选试剂：MSX（氨基亚砜蛋氨酸）
CHO C l a s s i f i c a t i o n
补充：
1980年CHO-K1经化学突变得到CHO-DXB11 （ 一个等位基因缺失） 1983年的电离辐射经诱变株CHO-DG44 （两个等位基因缺失） 由于CHO-DXB11 DHFR缺陷不彻代
DHFR（ 二氢叶酸还原酶） 筛选原理
◆ 四氢叶酸是一碳单位的载体 ，在 核苷酸的合成中起到重要作用。
◆ 当叶酸类似物MTX不可逆结合后 ， 阻止四氢叶酸合成 。细胞必须产 生更多的DHFR才能维持细胞代谢。
CHO细胞的培养
一般采用F12培养基培养 含10％血清的常规培养基里培养 无血清培养基
GS（谷氨酰胺合成酶） 筛选原理
L-谷氨酸+氨+ATP GS L-谷氨酰胺+ADP+Pi
CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)表达系统
CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）表达系统CHO细胞表达系统原理分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。
在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。
它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。
本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
CHO细胞表达体系及其特点诞生于70年代末的基因工程药物因其具有其他药物无法比拟的优点，已迅速成为制药工业中一个引人瞩目的领域。
1995年美国基因工程药物销售额约为48亿美元，1997年超过60亿美元，年增长率达20％以上。
各国政府将其视为新的经济增长热点而给予了大力支持。
基因工程药物研究与开发的主要环节包括：①基因的克隆和基因工程菌的构造；②重组细胞的培养；③目的产物的分离纯化等。
针对这些主要环节，研究人员正致力于高效表达、培养工艺及下游分离纯化等方面的研究。
随着基因工程技术的不断发展，目前已有多种表达系统可用于生产具有医疗价值的人或动物来源的蛋白质(表1)。
大肠杆菌(E.coli)是使用最早的表达系统，其显著优点是易于操作，产量高，成本低，但由于用E.coli生产的蛋白质药物因缺乏糖基化而在人体内易被降解，因此它的药放大大降低。
此外，它还存在易产生内毒素和包涵体的问题。
真核细胞中CHO细胞是目前重组糖基蛋白生产的首选体系；因为与其他表达系统相比，它具有许多优点：①具有准确的转录后修饰功能，表达的糖基化药物蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；②具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化；③具有重组基因的高效扩增和表达能力；④具有贴壁生长特性，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力，可以进行悬浮培养，表达水平较高；⑤CHO细胞属于成纤维细胞(fibroblast)，很少分泌自身的内源蛋白，利于外源蛋白的启分离。
但CHO细胞培养成本高，条件难掌握，易污染，在一定程度上影响了它的广泛应用。
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CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗
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CHO细胞表达体系特点及CHO细胞表达疫苗
关键词：细胞疫苗CHO细胞表达体系CHO细胞表达
分子生物学、分子免疫学等学科的发展使基因工程疫苗具有越来越重要的地位。
在基因工程疫苗研究的动物细胞表达系统中，最具代表性的就是中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary，CHO)。
它是用来表达外源蛋白最多也最成功的一类细胞。
本文就CHO细胞表达系统在疫苗研制中的应用做一综述。
1、CHO细胞表达体系及其特点
CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。
也可以悬浮生长。
目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-) 突变株CHO。
近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。
另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在sFM 中生长良好。
与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点：
(1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子；
(2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力；
(3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定；
(4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化；
(5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。
且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。
2、CHO细胞表达疫苗
（1）乙肝疫苗
CHO细胞表达疫苗的种类不多，多数处于研究阶段。
目前只有CHO表达乙肝疫苗已投入生产，这是除酵母表达乙肝疫苗以外，唯一已用于人类使用的基因工程亚单位疫苗。
使用酵母表达乙肝疫苗虽然获得了很大成功，但是酵母系统还存在着许多缺陷，最重要的一点，酵母不能模拟蛋白在人体肝细胞中的翻译后修饰、蛋白折叠、大分子组装以及糖基化。
这些特点正是抗原在动物细胞中引起免疫反应所必须的。
而CHO细胞表达的蛋白更接近人体来源的乙肝表面抗原。
1991年中国预防医学科学院病毒学研究所联合长春生物制品研究所等单位研制成功了由CHO细胞表达的基因工程乙肝疫苗，并于1992年批量上市。
该疫苗是以S 蛋白为靶抗原的乙肝疫苗，与酵母表达的乙肝表面抗原同属于第2代乙肝疫苗。
许多实验证明，乙肝病毒(rmv)衣膜蛋白的PreS部分在引发人体免疫反应中起着重要作用。
因此由CHO细胞中表达的含S和PreS2基因的乙肝表面抗原，被誉为第三代乙肝疫苗。
以色列生产的新型疫苗。
包含了S、PreS1、PreS2等3个基因，在CHO中表达的蛋白形成22 μm大小的颗粒，含有衣膜所有的抗原表位。
目前已投入市场的CHO表达基因重组乙肝疫苗主要有：法国巴斯德研究所Gen Hevac B、以色列Bio-Technology General公司的Bio-Hep-B、瑞士的Hepreeombe等。
在美国以酵母表达的乙肝疫苗为主的同时，CHO表达的乙肝疫苗占据了欧洲市场。
中国长春生物制品所的乙肝疫苗已正式生产。
在现有的安全性记载中，动物细胞表达的生物产品尤其CHO表达的产物的安全性很好。
在已批准进入临床或生产的动物细胞表达的乙肝疫苗的使用中，没有发现严重的副反应。
在免疫原性方面，我国CHO生产的乙肝疫苗的免疫原性与血源疫苗没有差异，明显优于酵母重组疫苗。
还有调查显示，新生儿接种国产乙肝CHO疫苗第1年的抗HBs阳性率为98.25％，抗体GMT为77.64，而血源疫苗免疫后第1年抗HBs阳性率在73.3％～93.5％之间。
与酵母重组疫苗比较，更低剂量的CHO乙肝重组疫苗及鼠细胞表达的乙肝疫苗在T细胞水平产生更高的免疫原性，这些疫苗刺激T细胞产生帮助引起更高的血清转化率和更高的抗HBs滴度2）Epstein-Ban-病毒(EBV)疫苗
象其他疱疹病毒一样，EBV外周包绕一层脂质包膜。
主要由gp340(有报道为gp350)和gp220两种糖蛋白组成，分子量分别为340kDa和220kDa。
gp340/220具有广泛的糖基化位点，其多糖部分占整个分子量的50％以上，因此，哺乳动物细胞是其最适宜的表达宿主。
将含gp340/220基因的重组载体，转染CHO-A6细胞系和CHO dhfr-细胞系，经筛选获得可表达gp340/220蛋白的细胞株，经纯化的gp340/220免疫小鼠。
2周后小鼠血清中检测到明显的gp340 /220特异性抗体，表明CHO细胞表达的gp340/220具有同天然膜抗原相似的分子量、糖基化程度、免疫特异性和免疫原性，可望成为EB病毒基因工程亚单位疫苗。
国外有研究也将gp340/220基因克隆构建重组载体，但经过定点突变使之只合成gp340蛋白。
该种蛋白同样能被抗gp340220的单克隆抗体所识别，并具有同EBV受体、CD21结合的能力，说明重组蛋白同野生型EBVgp340/220结构相似。
用重组蛋白免疫兔子，获得了高滴度的抗体，所产生的抗体可以中和野生型EBV。
（3）艾滋病病毒(HIv)疫苗
HIV基因组中的三大结构蛋白编码区分别编码核心蛋白Gag、聚合酶Pol和外膜蛋白Env。
Env 的前体单位为糖蛋白gpl60，加工后形成膜外蛋白gp120和跨膜蛋白gp41。
目前针对HIV病毒研制的疫苗有多种：减毒活疫苗、灭活疫苗、载体活疫苗、DNA疫苗、合成肽疫苗及重组亚单位疫苗。
其中不同宿主细胞表达的以Env、Gag、Pol等蛋白为靶抗原的多种亚单位疫苗在国外进入了临床实验。
其中CHO细胞表达的gpl20制成的疫苗为较早研制的一种。
重组载体转入CHO-L761h细胞系，获得可持续分泌gpl20蛋白的细胞株。
纯化后的蛋白同3种常用免疫佐剂免疫兔子，均诱导了高滴度的免疫反应；给猩猩接种也可以保护机体免受由低剂量的同类HIV毒株攻击而导致的感染。
但是在泰国给数千人免疫接种后无明显的保护效果。
不过。
在恒河猴接种gp120疫苗的同时注射CHO表达的重组白介素12(ILl2)。
所诱导的抗体水平是单一接种gp120疫苗的10倍；而新的I临床使用表明，受试者免疫重组痘病毒疫苗后。
再使用gp120亚单位疫苗加强，80%以上的人产生了特异的体液和细胞免疫反应。
3、小结
由于CHO表达系统具有完善的翻译后修饰功能。
对于一些特定的蛋白。
特别是糖基化程度高的蛋白来说。
是最为合适的表达体系。
因此，除了以上介绍的 3 种病毒疫苗外。
丙肝病毒、水痘一带状疱疹病毒亚单位疫苗在CHO细胞中的表达在国内外均有研究。
但CHO表达亚单位疫苗还存在着一些问题：
（1）单一的亚单位疫苗往往具有免疫原性弱的缺点；
（2）CHO细胞培养成本高、条件难控制。
在一定程度上限制了CHO细胞表达亚单位疫苗的发展。
因此。
应进一步研究CHO表达系统，对表达载体进行改造使之能容载更大片断的蛋白基因并提高表达量；改造CHO细胞使之更利于大规模生产；改进发酵工艺、纯化工艺。
使CHO 培养成本降低。