第二章 菌种与种子扩大培养

4、国内外主要菌种保藏机构介绍 、
菌种是一个国家的重要资源，世界各国都对菌种极为重视，设 置了各种专业性保臧机构 专业性保臧机构，主要的菌种保臧机构介绍如下： 专业性保臧机构 ATCC American （ 1 ） Rockvil1．Maryland.U.S.A。 ． 。 Type Culture Collection.
C 沙土管保藏法（细菌，霉菌，防线菌 ） 沙土管保藏法（细菌，霉菌，
这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽孢 产孢子或芽孢的微生物。 产孢子或芽孢 它的制备方法 制备方法是： 制备方法 首先，将沙与土洗净烘干过筛 洗净烘干过筛后，按沙与土的比例为 －2∶l 按沙与土的比例为l－ ∶ 洗净烘干过筛 按沙与土的比例为 混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为1厘米左右， 121°C间歇灭菌三次 间歇灭菌三次，灭菌试验合格后烘干备用。一般沙用 沙用80 ° 间歇灭菌三次 沙用 目过筛，土用 土用30－ 目过筛。其次，将斜面孢子制成孢子悬 目过筛 土用 － 100目过筛 目过筛 浮液接入沙土管中或将斜面孢子刮下直接与沙土混合 直接与沙土混合，于干燥 直接与沙土混合 器中用真空泵抽干，放在冰箱内保存。一般保存期可达 保存期可达2-10年 保存期可达 年 不等。 不等
b 操作方法及步骤 （1）安瓿管要求 由于液氮保存于超低温状态，所使用的安瓿 ） 安瓿 管需能承受大的温差而不致于破裂，一般用95料或 料或GCl7的玻璃 管需能承受大的温差而不致于破裂 料或 的玻璃 印上标记，加棉塞后灭菌 管，安瓿管选好后印上标记 加棉塞后灭菌，烘干后备用 印上标记 加棉塞后灭菌，烘干后备用。 （2）菌种准备及分装 因为液氮法菌种要经受超低温的冷冻过 ） 超低温的冷冻过 保护剂，常用的保护剂为 ％甘油 保护剂为10％甘油。用保护剂 程。所以也需要保护剂 保护剂 保护剂为 制备好菌液后，加入准备好的安瓶管中，一般安瓿管的装量为 0.2－1mL。 －
3、新种分离与筛选的步骤 、
定方案： 定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特 性。 采样： 采样：有针对性地采集样品。 增殖： 增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖 培养后，在数量上占优势。 分离筛选： 分离筛选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目 的菌。 发酵性能测定： 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、 培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品 品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最 适pH值、提取工艺等。
二、菌种的保藏与复壮
（一）菌种的保藏 1、菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料， 特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、氨基酸、 酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行 微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。 其任务首先是使菌种不致死亡，同时还要尽可能设 法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转 化。
（2）增殖培养 ）
含有目的菌较多的土样不需要富集培养 如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的 基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖， 从而提高它们在样品中的比例，便于分离。 富集培养的一般方法：采用有利于目的菌种而不利于无 关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体 中比例上升的目的。 例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或 者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这 一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可 能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。 一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通 过大量艰苦的工作筛选取得。
（3）培养分离 ）
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物 的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这— 步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用， 而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划 线分离法、稀释分离法。
稀释分离法
• 稀释倒 平板法
• 平板 涂布法 注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。 注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
3、菌种保藏的方法
菌种保藏的方法很多，一般有下面几种 一般有下面几种： 一般有下面几种 A 斜面冰箱保藏法（酵母） 斜面冰箱保藏法（酵母） 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条 件下培养到菌体或孢子生长丰满后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个 ℃冰箱保存。 月到六个月。 月到六个月 B 石蜡油封存法（酵母） 石蜡油封存法（酵母） 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，用量要高出斜面 高出斜面 一厘米，然后保存在冰箱中。此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、 通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、 一厘米 通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌 霉菌、酵母等微生物的保存。保存期约一年左右 保存期约一年左右。 霉菌、酵母等微生物的保存 保存期约一年左右。
（1）采样 ）
采样对象：以采集土壤为主。 采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为 好。
采取土壤样品要考虑的几个问题
土质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放 线菌少；在植物残体枯枝落叶下的土壤中较多含有拮抗 性真菌。 离地面5~20cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含 菌量最高。 采土季节以春秋两季最好。 采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克， 盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、 地点、植被情况等。 多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分 布平均情况
（5）菌种鉴定 ）
经典分类鉴定方法：形态特征、 经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特 血清学试验等。 征、血清学试验等。 现代分类鉴定方法：遗传特性、 现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组 计算机数值分析。 分、计算机数值分析。
（6）毒性试验 ）
自然界的一些微生物是在一定条件下产毒的，将 其作为生产菌种应当十分当心，尤其与食品工业有 关的菌种，更应慎重。据有的国家规定，微生物中 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆 菌作为食用无须作毒性试验外，其他微生物作为食 用，均需通过两年以上的毒性试验。
E 液氮超低温保藏法（细菌，真菌） 液氮超低温保藏法（细菌，真菌）
液氮超低温保臧法足近几年才发展起来的，此法国外已较 普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法 是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产 是适用范围最广的微生物保藏法 不产 孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理想，可用液氮保臧法 液氮保臧法。其 孢子的菌丝体 液氮保臧法 保存期最长。 a 原理 用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达一196℃， 一 ℃ 远远低于其新陈代谢作用停止的温度（一130℃），所以此时 新陈代谢作用停止的温度（ 新陈代谢作用停止的温度 ℃ 菌种的代谢活动已停止 化学作用亦随之消失 代谢活动已停止，化学作用亦随之消失 代谢活动已停止 化学作用亦随之消失。
关键是先把微生物从常温过渡到低温 （3）冻结 液氮法的关键 先把微生物从常温过渡到低温 ） 关键 先把微生物从常温过渡到低温。这样在细胞接 接 触低温前，使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞 使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。 触低温前 使细胞内自由水通过膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞 美国 ATCC采用先将菌液降温到 ℃，再以每分钟降低 ℃的速度 一直 先将菌液降温到0℃ 每分钟降低1℃的速度，一直 先将菌液降温到 每分钟降低 降低到－ ℃ 液氮罐的气相中。由于液 降低到－38℃，然后才把装有菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中 液氮罐的气相中 氮要蒸发，这样温度就会上升，冰晶状态发生变化 冰晶状态发生变化，从而导致菌种死亡。 冰晶状态发生变化 所以要常常注意液氮的残存量，定期补加 常常注意液氮的残存量， 常常注意液氮的残存量 定期补加。 （4）重新培养 当要使用或检查所保存的菌种时，可将安瓿管从冰箱中取出， ） 室温或35－ ℃水浴中迅速解冻，当升温至 ℃时即可打开安瓿管 升温至0℃时即可打开安瓿管，将菌种 室温或 －40℃水浴中迅速解冻 升温至 移到适宜的培养基斜面上培养。
第二章 菌种与种子扩大培养
本章讲述内容
第一节 微生物工业用菌种 第二节 种子扩大培养
第一节 微生物工业用菌种
一、菌种的分离筛选 1、菌种的来源 、 根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买； 从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
2、分离思路 、
新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照 生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法， 快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。 实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必 须重新进行分离纯化。 有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合 理先进的设备与之配合。
• 划线分离法 划线分离法——平板划线法 平板划线法
（4）筛 ）
分初筛、复筛。 分初筛、复筛。
选
Ⅰ、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物 初筛：从分离得到的大量微生物中， 筛选出来的过程。 筛选出来的过程。 一般采用平板筛选。 一般采用平板筛选。 常用的初选方法： 常用的初选方法： • 水解酶产生菌的筛选： 水解酶产生菌的筛选： 将酶的作用底物加在培 养基中，接种后适温培 养基中， 养，根据菌苔周围是否 产生水解圈筛选出水解 酶产生菌。 酶产生菌。 • 拮抗菌的筛选 对峙培养： 拮抗菌的筛选—对峙培养 对峙培养： 将病原指示菌与待测菌株 相对接种在平板上适温培 养，根据病原菌的生长情 况筛选出拮抗性菌株。 况筛选出拮抗性菌株。
2、菌种保藏的原理 、
菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点人工创造 条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减 少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低 水平缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“体眠” 状态，抑制其繁殖能力。 一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优 良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经 济，以便生产上能推广使用。
2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体源自文库荡培养，取 ）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养， 发酵滤液进行活力测定。 发酵滤液进行活力测定。
Ⅱ、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的 复筛：在初筛的基础上， 生产能力强弱的过程。 生产能力强弱的过程。 • 复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法 复筛采用摇瓶培养后， 进行测定。 进行测定。 • 复筛过程中，要结合培养条件进行。 复筛过程中，要结合培养条件进行。 培养条件包括： 培养条件包括：培养基 pH值 值 发酵温度 供氧量等。 供氧量等。
D真空冷冻干燥保减法（细菌，防线菌 ） 真空冷冻干燥保减法（ 真空冷冻干燥保减法
真空冷冻干燥保臧法是目前常用的较理想的一种方法。其基本原理 基本原理是在较低的温度 真空冷冻干燥保臧法 基本原理 下（－ ℃），快速她将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华 （－15℃ 水分升华。 （－ 水分升华 在这样的环境中，微生物的生长和代谢都暂时停止，不易发生变异。 因此，菌种可以保存很长时间，一般 年左右 一般5年左右 一般 年左右。这种保藏方法虽然需要一定的设备， 要求亦比较严格，但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所以，国内外 都已较普遍地应用。 这种方法的基本操作 基本操作过程是先将微生物制成悬浮液 制成悬浮液，再与保护剂混合 与保护剂混合，然后放在特 基本操作 制成悬浮液 与保护剂混合 制的安瓶管内，用低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干 低温下用真空泵抽干，最后 低温下用真空泵抽干 将安瓿管真空熔封，并低温保藏。 保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用可能是在冷冻干燥的脱水过程中代 脱水过程中代 保护剂一般采用脱脂牛奶或血清 替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型，防此细胞膜因为冻结而破坏 防此细胞膜因为冻结而破坏。保护剂 替结合水而稳定细胞成分（细胞膜）的构型 防此细胞膜因为冻结而破坏 还可以起支持作用 支持作用，使微生物疏松地固定在上面。牛奶可以离心或加热的方法脱脂 牛奶可以离心或加热的方法脱脂。 支持作用 牛奶可以离心或加热的方法脱脂