土壤酶指标测定

土壤生物化学指标测定

一、土壤脱氢酶(dehydrogenase)活性测定（比色法）

（一）分析意义脱氢酶能酶促脱氢反映，它起着氢的中间传递题的作用。在土壤中，碳水化合物和有机酸的脱氢酶作用比较活跃，他们可以作为氢的工体。脱氢酶能自基质中析出氢而进行氧化作用。

（二）方法选择与原理Lenhard(1956)最先提出用TTC作为氢的受体生成红色的TF，进行闭塞测定，以溶液的光密度值表示酶活性。

后来对上述的方法做了不同的改进和完善。用土壤有机质作为氢的供体或用葡萄糖做氢的供体，用生成的TF数量或换算成氢的体积来表示脱氢酶的活性。

（三）试剂配制

1、0.5%TTC溶液

2、甲苯

3、Tris-HCl缓冲液Ph7.6：0.1M三羟甲基氨基甲烷（12.114g/L）50ml 与0.1MHCl

38.5ml混合后，用水稀释至100ml。

4、硫化钠

5、0.1mol/L葡萄糖溶液。

（四）实验步骤

1、标准曲线的绘制：称取相当于50mg纯品量的已烘干的TTC于50 ml比色管中，定容，制成1 mg/L的母液。分别向6支50ml比色管中依次注入1、

2、

3、

4、

5、6mL mg/ml 标准TTC溶液，用蒸馏水定容，是为工作液：取7只带塞比色管（50ml）依次加入2 mL Tris-HCl演算缓冲液，1 mL不同浓度的TTC工作液，1 mL10%硫化钠新配溶液，摇匀，放置20分钟；反应完全后，准确加入10ml甲苯，振摇。完全提取TF，稳定数分钟，取上层有机溶液在紫外分光光度计492nm处闭塞（在比色皿中也需稳定2分钟）绘制标准曲线。

2、操作过程：取0.5g新鲜土壤，置于50ml 比色管中，依次加入2mlTris-HCl盐酸缓冲液、1ml 0.1mol/L葡萄糖溶液、1ml 0.5% TTC溶液,震荡均匀，离心（4000转/分）5分钟后，将甲苯提取液在分光光度计492 nm处闭塞测定。同时设无土壤和无TTC的对照（以蒸馏水替代）。

3、结果计算：脱氢酶活性=TF含量/0.5g —土壤含水量

脱氢酶活性，以24h后1g干土中TF的生成量表示。

二、土壤过氧化氢酶（catalase）活性的测定（滴定法）

(一)分析意义过氧化氢酶广泛存在于土壤汇总和生物体内。土壤过氧化氢酶促过氧化氢

的分解有利于防止它对生物体的毒害作用。过氧化氢酶活性与土壤有机质含量有关，与微生物的数量也有关。一般认为，土壤中催化过氧化氢分解的活性，有30%或40%以上是耐热的，即非生物活性，常由锰、铁引起催化作用。土壤肥力因子与不耐热的即过氧化氢酶活性成正比。

(二)方法选择与原理本法是基于用高锰酸钾滴定酶促反应前后，过氧化氢的量，由二者

之间的差求出分解H2O2的量，以此来表示酶的活性。

2KMnO4+5 H2O2+3H2SO4------2MnSO4+K2SO4+8H2O+5O2

(三)试剂配制

1、0.3% H2O2

2、3N硫酸

3、0.1N高锰酸钾（优级纯）溶液。

（四）实验步骤

1、操作过程：取2g 新鲜土壤，置于小口100 ml小口三角瓶中，并注入40ml 蒸馏水和5ml 0.3% H2O2，塞上塞子，将三角瓶放在恒温振荡机上（25 0C）,震荡20 分钟。而后迅速加入5ml 3N硫酸，以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中的悬液用慢速型滤纸过滤。然后，吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾滴定至淡粉红色终点。

2、结果计算：用于滴定的、土壤滤液所消耗的高锰酸钾量为B，用于滴定25ml原始过氧化氢混合液的所消耗的高锰酸钾量为A。

过氧化氢酶活性=(A —B)/2g —土壤含水量

酶活性以1g敢图分钟内消耗0.1N高锰酸钾ml数表示。

三、土壤多酚氧化酶（polyhphenol oxidase）活性的测定（比色法）

（一）分析意义多酚氧化酶参与土壤有机组分中芳香族化合物的转化作用。土壤中的酚类物质在多酚氧化酶作用下氧化生成醌。醌与氨基酸等通过一系列生物化学过长鞥

所合成最初的胡敏酸分子。所以，多酚氧化酶是腐殖化的一种媒介，他是土壤氧化

还原酶中了解的较多的一种酶。

（二）方法选择及原理在空气存在的情况下，多酚氧化酶能酶促一元酚、二元酚、三元酚氧化成醌。根据基质的变化，测定多酚氧化酶的三种方法如下：

1、比色法：多酚氧化酶酶促邻苯三酚，用乙醚提取生成的紫色没食子素；比色着色的

乙醚相，用紫色没食子素表示酶活性。此种方法具有速度快的优点，闭塞技术要求

求严，培养PH值要准确，并且范围较窄。是目前广为应用的一种方法。

2、碘量滴定法：本法根据多酚氧化酶酶促基质生成的醌，在酸性条件下，用标准碘液

滴定生成稳定的蓝色络合物，以碘的体积表示酶的活性。此法要注意保证反应所需

要的酸度，对碱性土壤应加过量的酸，才易于判断滴定终点。

3、测压法：本法用Warburg呼吸器，测定在多酚氧化酶作用下消耗用于氧化多酚化合

物的氧量，表示酶活性。此法要求仪器设备，且测定样品所需要时间较长。测定

多酚氧化酶常用的基质有邻苯二酚和邻苯三酚，由于测定多分氧化酶是基于测定加

入土壤的多酚的演化速度，一般邻苯三酚氧化得最快，故常用邻苯三酚为基质，以

比色法进行测定。

（三）试剂配置

1、1%邻苯三酚溶液

2、乙醚

3、0.5N盐酸

4、重铬酸钾标准溶液：取0.75g K2Cr2O7 (优级纯)溶解於1L0.5N HCl(相当于50ml醚中

含5mg紫色没食子素)

5、PH4.5柠檬酸—磷酸缓冲液：0.2M磷酸氢二钠.2 H2O（分子量=178.05，35.61g/L）

9ml与0.1N柠檬酸. H2O（分子量=210.14，21.01g/L）11ml混合而成。