第五章 蛋白质理化性质的分析
5 蛋白质序列分析
实例分析，使用PHYRE系统 进行 RGDV P2蛋白的折叠识别预测
3.从头预测
• Abinitio prediction：直接从序列本身预测三 维结构。
5.4抗原表位预测分析
• 抗原抗体结合反应中，抗原参与的结合部 位称为抗原表位（epitope）
实例：TargetP对RSvc2蛋白细胞定 位预测
5.2结构与分析及motif搜索
• 结构域（structure domain）是在蛋白质结 构中介于二级结构和三级结构之间的可以 明显区分但又相对独立的折叠单元，每个 结构域自身形成紧实的三维结构，可以独 立存在或折叠，但结构域之间的关系较松 散。 • 常见工具：InterProSan， SMART，Pfam。
实例：使用PROSITE数据库对 RGDV P8 蛋白进行motif搜索。
5.3空间结构预测
• 二级结构预测的意义。 • 在线工具，SSPro 等。
• Amino Acids: MAGKLQDGVAIAKIKETINLFCEYSFGDLVNNRREIVGRVHDARKN AALAWPDLIMNCFLHSASHYGVVKFLLDIALSTRFGDFTLLGVSSQ NYPFYDLHVVMTKAFCNLDFAKDEYLMINDSFSSMMSAFLDEEGV HSAMSMELGIHDIEDRFVLRTKRLFYIIHEYHMSLDEIEPWLEKLPD ASGGTLLNQKSKEQMRVIFSNAKVRIANSINLYVTNNTNSYNEYVR EVAEYVADLWNIQATTNTQGHENELADEDFGVLASSSQMNGTKS ELGDSVIKSDGNEVKLEPAVFTRNDDEEELAGSEFTSLLSDDGRM G Predicted Secondary Structure (8 Class): CCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCHTHHHTTTCEHHHHHHH HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHEHETCE EEEEEECCSCCTCCHHEEEEHHHEECTCCCCCEECCCHHHHHH HHHHHHHHHCCEEEEHEEECECHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHHHHHHHHTCCCTTTTCHHCHHHHHHHHHHHHHHHHHHH HHHHEEEETHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHEEEECCCTCCHH HHHHHHTTEEEECHHCTCCHCHTTCEEEECTTCEEEECCEEEEE CCCHHHHHHHHHHHHHCTTTCCC
生物化学 第5章 蛋白质结构与功能
第五章蛋白质结构和功能的关系一、、肌红蛋白的结构与功能：1、肌红蛋白的三级结构哺乳动物肌肉中储氧的蛋白质。
由一条多肽链（珠蛋白，153个aa残基）和一个血红素辅基组成。
亚铁离子形成六个配位健，四个与N原子，一个与组氨酸，一个与氧配位。
球状分子，单结构域。
8段直的α-螺旋组成，分别命名为A、B、C…H，拐弯处是由1~8个氨基酸组成的松散肽段（无规卷曲）。
4个Pro残基各自处在一个拐弯处，另外4个是Ser、Thr、Asn、Ile。
血红素辅基血红素辅基，扁平状，结合在肌红蛋白表面的一个洞穴内。
CO 中毒CO 与肌红蛋白有更高的亲和性2、肌红蛋白的氧合曲线OMb 解离平衡常数：][]][[22MbO K =][2PO Mb K ∙=][2MbO 氧饱和度：[]2MbO Y =][][2Mb MbO +PO 2Y =2PO K +Y=0.5时，肌红蛋白的一半被饱和，PO 2=K =P 50=2.8t torr（托）解离常数K 也称为P 50，即肌红蛋白一半被饱和时的氧压。
3、Hill 曲线和Hill 系数YY K PO YK PO Y log log 1log 122-=-=-Hill曲线Log[Y/(1-Y)]=0时的斜率称Hill 系数（n H )肌红蛋白的n H =1二血红蛋白的结构与功能蛋白的结构与功能1、血红蛋白的结构：成人成人：HbA：α2β298%，a亚基(141)，β亚基（146）HbA2：α2δ22%胎儿：HbFα2γ2早期胚胎：α2ε2▲接近于球体，4个亚基分别在四面体的四个角上，每个亚基上有一个血红素辅基。
▲α、β链的三级结构与肌红蛋白的很相似，一级结构具有同源性。
氧合造成盐桥断裂42、血红蛋白的氧合曲线四个亚基之间具有正协同效应因此它的氧合曲四个亚基之间具有正协同效应，因此，它的氧合曲线是S 型曲线。
Hill 曲线和Hill 系数。
协同效应可增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量，使它能有效地输送氧气。
蛋白质的理化性质
蛋白质的理化性质蛋白质是一类高分子生物大分子化合物，由氨基酸分子结合而成。
下面将从化学、物理、生化等方面来介绍蛋白质的理化性质。
1. 氨基酸的性质氨基酸是蛋白质的基本组成单位，其分子结构具有酸性和碱性两部分，分别是羧基和氨基。
氨基酸的酸性和碱性反应性决定蛋白质的异性和电性。
氨基酸的酸性基团和碱性基团在不同的环境下会存在不同的离子形式，从而影响蛋白质的电性质。
2. 构象的性质蛋白质的构象是指氨基酸之间的立体构型，决定了蛋白质的特殊结构和功能。
蛋白质的构象主要由五种不同层次的结构组成，包括原生构象、二级构象、三级构象、四级构象和超级结构。
每一层次的构象都有一定的稳定性和特殊结构，是蛋白质功能和特性的决定因素。
3. 溶解和凝固的性质蛋白质在水中具有一定的溶解性，但可能会因为温度、pH值、离子强度等因素的改变而发生凝固。
这种溶解或凝固的性质取决于蛋白质的特殊结构以及其所处环境。
当蛋白质分子与水分子之间的相互作用受到破坏或受到特定溶剂或离子的作用时，蛋白质分子会转化为凝胶态或沉淀态。
4. 热力学性质蛋白质分子的热力学性质涉及其结构及其所处溶液环境的物理化学性质，可用于研究蛋白质折叠和复性过程。
蛋白质的热力学性质包括热容量、热稳定性、相转化、热解离等。
这些性质的变化与蛋白质结构的稳定性和功能密切相关。
蛋白质的光学性质主要表现为它们具有的吸收、发射光线的光学行为。
蛋白质的吸收和发射光束涉及其分子内的色团，这些分子内的色团主要由氨基酸的芳香族侧链所构成。
蛋白质的光学性质可以利用光谱分析来研究蛋白质的结构和功能。
综上所述，蛋白质的理化性质是多方面的，包括氨基酸的性质、构象的性质、溶解和凝固的性质、热力学性质以及光学性质等，这些性质的变化都会导致蛋白质的性质和功能的变化。
因此，对蛋白质的理化性质进行研究对于理解蛋白质的结构、功能与机制具有重要意义。
蛋白质—蛋白质的理化性质(生物化学课件)
蛋白质的胶体性质
颗粒 表面电荷
胶体稳定 的因素
水化膜
去掉两个稳定因素，则蛋白质从溶液中析出而产生沉淀。
蛋白质的胶体性质
溶
+++
酸
液 中
+
+碱
++
碱
－ －
－ －
酸 －－－ －
蛋
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质 带负电荷的蛋白质
白
脱水
质
作用
的
沉
淀
脱水 作用
碱
脱水
作用
酸
－－
－ －－
－ － －
不稳定的蛋白质颗粒 带负电荷的蛋白质
双缩脲反应
原理 应用
蛋白质分子中肽键结构（两个以上肽键）和双缩脲结构相 似，在碱性条件下可与Cu2+反应生成紫红色络合物。反应 产物在540nm波长处的吸光度值与蛋白质含量呈正比。
蛋白质、多肽的定量分析；蛋白质的水解程度检测。
一、蛋白质的颜色反应
Folin—酚试剂反应
原理 应用
在碱性条件下能与酚试剂反应生成蓝色化合物（钼蓝）， 在650nm波长处的吸光度值与蛋白质含量呈正比。
体内大多数蛋白质的等电点在pH5.0左右，因而在生理条件下 以阴离子形式存在。
蛋白质的等电点( isoelectric point, pI)
电泳
带电粒子在电场中的定向移动现象。
电泳技术 利用电泳进行分离分析的技术。
应用
蛋白质在一定pH的溶液中解离后成为带电的颗粒，由于 所带电荷性质及荷电数量不同，在同一电场力作用下， 其迁移速度不同，故可对蛋白质进行分离和纯化。
蛋白质的定性和定量分析，灵敏度较双缩脲反应高100倍， 可用于微克量级蛋白的定量分析。
蛋白质的理化性质
蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性解离及等电点1.蛋白质的等电点（pI）：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质上可解离基团解离成正、负离子的趋势相等，净电荷为零时溶液的pH。
➢等电点时溶解度最小可使蛋白质沉淀。
➢蛋白质pI要用等电聚焦等方法测定。
（二）蛋白质的胶体性质1.胶体溶液的三个条件：①大小在1-100nm范围内：蛋白质分子量很大，属胶体颗粒范围。
②同种电荷互相排斥：相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。
③质点外围有水化层：多肽链上的极性基团极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜。
蛋白质可以形成稳定的胶体溶液。
2.利用胶体溶液性质，可用透析法将蛋白质中小分子杂质除去。
（三）蛋白质的沉淀1.定义：蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。
如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或破坏其水化层和双电层，蛋白质胶体溶液因不再稳定而产生沉淀。
此现象即为蛋白质的沉淀作用。
2.类型：分可逆沉淀与不可逆沉淀。
➢可逆沉淀▁非变性沉淀定义：在温和条件下，改变溶液的pH或电荷状况，蛋白质结构和功能没有发生变化。
如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。
是分离和纯化的基本方法。
a.等电点沉淀法：用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH等于pI，破坏蛋白质表面净电荷使蛋白质沉淀。
b.盐析沉淀法：1.盐析：通过加入大量高浓度中性盐如硫酸铵、氯化钠等，破坏蛋白质分子表面的水化层，中和它们的电荷，而使蛋白质沉淀析出的现象。
2.各种蛋白质亲水性及荷电均有差别，因此通过调节中性盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的不同蛋白分别沉淀析出，这种方法称为分段盐析。
3.盐溶：加入低浓度盐导致蛋白质溶解度增加的现象。
c.有机溶剂沉淀法定义：加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，破坏蛋白质的水化膜使蛋白质产生沉淀。
注意：通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质发生变性。
➢不可逆沉淀▁变性沉淀定义：沉淀条件剧烈，破坏了蛋白质胶体溶液稳定性，同时也破坏了蛋白质结构和功能。
5.2蛋白质的物理化学性质
1.蛋白质是六大营养素之一，产能营养素之一
2.日常食物中的蛋白质，请列举
3.蛋白质有哪些功能？
4.你还了解跟蛋白质相关的哪些内容？
授课内容
备注
<教学过程>
第三节蛋白质的物理化学性质
一、蛋白质分子的大小形状蛋白质分子的形状
1.大多数蛋白质分子是近似球形的或椭球形的。如：肌红蛋白、血红蛋白、胰岛素、免疫球蛋白、溶菌酶等；少数蛋白质分子是纤维状的或细棒状的。如：血纤维蛋白、胶原蛋白、丝心蛋白、角蛋白等。蛋白质分子的大小小者数千，大者数千万，但大多数蛋白质在104～108数量级。
3.蛋白质沉淀(protein precipitation)：在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。这一现象被称为蛋白质沉淀。
蛋白质沉淀的方法：盐析、酸、碱、有机溶剂、重金属、生物碱、抗体。
1析出的现象。此法分离出的蛋白质物理性质、化学性质都不发生改变，常用来提取酶制剂。
1.变性：在某些理化因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失。
1）变性本质：二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。
2）变性因素：
物理因素：加热，加压，超声波，紫外线
化学因素：胍、脲、有机溶剂、强酸强碱，-巯基乙醇、重金属离子、生物碱试剂
颗粒大小：在1～100nm之间。因此溶于水，成为亲水胶体。分子周围有双电层和水化层，有利于稳定蛋白质胶体系统。
1.扩散
将一种溶质放在可以使其溶解的溶剂中，则溶质分子便向溶剂的各个方向移动，最终达到了在溶剂中均匀的分散。这种现象，称为分子扩散。——布朗运动的结果扩散的速度取决于颗粒的大小和形状。
蛋白质序列分析
/protscale/
利用BioEdit软件分析 软件分析 利用
5. Coil区分析 区分析 蛋白质中由2-7条 螺旋链相互缠绕形成类似麻花状结 蛋白质中由 条α螺旋链相互缠绕形成类似麻花状结 构的总称； 构的总称； 主要存在形式是2-5条相互缠绕形成的平行或反平行 主要存在形式是 条相互缠绕形成的平行或反平行 同寡聚体或异寡聚体； 同寡聚体或异寡聚体； 是控制蛋白质寡聚化的元件，转录因子、骨架蛋白、 是控制蛋白质寡聚化的元件，转录因子、骨架蛋白、 动力蛋白、膜蛋白、酶等； 动力蛋白、膜蛋白、酶等； 七肽重复区。 七肽重复区。 例，使用COILS服务器分析 使用 服务器分析 /software/COILS_form.html
第五章 蛋白质序列分析
蛋白质序列的基本性质分析
理化性质分析，疏水性分析，跨膜区分析，信号肽预测， 理化性质分析，疏水性分析，跨膜区分析，信号肽预测， Coil区分析，亚细胞定位 区分析， 区分析
结构域分析及motif搜索 搜索 结构域分析及 空间结构预测
二级结构及三级结构预测， 二级结构及三级结构预测，结构预测方法评价
模建评 价
比对、模建、 比对、模建、 模板选择
四级结构 模建日志 配合物模 建日志
通过CPHmodels同源模建 同源模建 通过 http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/
（2）折叠识别 ） 原理：将序列“ 原理：将序列“穿”入已知的各种蛋白质折叠子骨架 内，通过目的蛋白序列与已知折叠子的逐一比对，计 通过目的蛋白序列与已知折叠子的逐一比对， 算出未知结构序列折叠成各种已知折叠子的可能性； 算出未知结构序列折叠成各种已知折叠子的可能性； 折叠子一般包括一个或多个蛋白质超家族； 折叠子一般包括一个或多个蛋白质超家族； 每个折叠子的结构内核有确定的结构特征； 每个折叠子的结构内核有确定的结构特征； 基于序列同源性很低的蛋白质都可能存在结构相同的 折叠子进行预测。 折叠子进行预测。 例，通过PHYRE系统进行折叠识别预测 通过 系统进行折叠识别预测 /~phyre/index.cgi （3）从头预测 ）
蛋白质化学—蛋白质的理化性质(生物化学课件)
第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分 子和氨缩合生成有蓝色物质。
第一步 还原
O
H
C
OH
C
+ H2N C COOH
C
OH
R
O
O
C
OH
C
+
C
H
NH3 + CO2 + R
O
C H
O 还原型茚三酮
高温、高压
物理因素
紫外线、X射线、
变
性
电离辐射和超声波等
因
有机酸、生物碱
素
化学因素
有机溶剂、重金属盐
高浓度尿素、盐酸胍等
2024/4/13
28
变性实质：破坏了空间结构，一级结构不受影响。
2024/4/13
29
变性蛋白 质 的特点
①生物学活性丧失
②理化性质改变 ③易被蛋白酶水解
空间结构改变
溶解度↓，沉降率↑
4.黄色反应
含有苯环的氨基酸，如酪氨酸、色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成
黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。反
应式如下
NaOH
HO
+
HNO3
HO
O
NO2
N
O- Na+
硝基酚（黄色） O
邻硝醌酸钠（橙黄色）
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以呈黄色反应，苯丙氨酸 不易硝化，须加入少量浓硫酸才有黄色反应。
常用硫酸铵作分离蛋白质的盐析剂
3.醇沉分离法
醇沉法：利用杂质不溶于乙 醇的特性，在加入乙醇后，杂质 被沉淀出来的过程。
第五章 蛋白质理化性质的分析
蛋白质的定量分析
方法
凯氏定氮法 福林福林-酚试剂法 双缩脲法
原理
蛋白质具有恒定的含氮量 在碱性条件下蛋白质与铜生产复合物， 在碱性条件下蛋白质与铜生产复合物，还原 磷钼酸磷钼酸-磷钨酸试剂生产蓝色化合物 在碱性条件下， 在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与铜可生 产紫红色的络合物 在碱性溶液中， 在碱性溶液中，蛋白质将二价铜还原为一价铜 再与BCA 二羧酸-而喹啉钠） BCA（ 再与BCA（二羧酸-而喹啉钠）生产紫色复合物
细分级（ fractionation)：一般使用层析法 包括凝胶过滤、 层析法。 细分级（fine fractionation)：一般使用层析法。包括凝胶过滤、
离子交换、 离子交换、吸附和亲和层析等及电泳法
（二）蛋白质混合物的分离方法
1、根据分子大小的分离
（1）透析（dialysis)和超过滤(ultrafiltration)：玻璃纸、火棉纸和其它 透析（dialysis)和超过滤(ultrafiltration)：玻璃纸、 和超过滤(ultrafiltration) 合成材料 （2）密度梯度（区带）离心：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度 密度梯度（区带）离心：蔗糖梯度、 （3）凝胶过滤：交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等 凝胶过滤：交联葡聚糖、
氨基酸在水中溶解度各异， 氨基酸在水中溶解度各异，易溶于酸和碱 分配层析、纸层析、 分配层析、纸层析、薄层层析
蛋白质的两性电离性质： 蛋白质的两性电离性质：
离子交换层析、 离子交换层析、电泳
（流动相） 流动相） （固定相） 固定相）
分配系数有差异 分配系数大的物质有较快的移动速度
点样、展 点样、 显色、 层、显色、 定性 定量） （定量）
• 分子筛层析法：球形蛋白质 分子筛层析法：
蛋白质的理化性质
蛋白质的理化性质蛋白质是生物体中最为重要的大分子有机化合物之一，其具有多种理化性质，这些性质直接影响着蛋白质的功能和结构。
本文将着重介绍蛋白质的理化性质，包括分子质量、氨基酸组成、等电点、溶解性、热稳定性和光学性质等方面。
分子质量蛋白质的分子质量通常是指相对分子质量，用该蛋白质的分子质量与碳12的质量相对比得到。
蛋白质的分子质量因其组成氨基酸的种类、序列和数量而异。
一般来说，蛋白质的分子质量范围从数千到数十万不等。
氨基酸组成蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的，不同蛋白质中的氨基酸组成各异。
氨基酸的类型和数量直接影响着蛋白质的结构和性质。
常见的氨基酸包括20种标准氨基酸，它们各自具有独特的化学结构和性质。
等电点蛋白质的等电点是指在该蛋白质溶液中，净电荷为零的pH值。
蛋白质的等电点与其氨基酸组成密切相关。
当蛋白质的溶液pH值低于等电点时，蛋白质带有正电荷，而当溶液pH值高于等电点时，则带有负电荷。
等电点对于蛋白质在电泳分离和纯化过程中具有重要的意义。
溶解性蛋白质的溶解性在很大程度上取决于其氨基酸组成和环境条件。
一些蛋白质在水中易溶解，而另一些可能需要特定的溶剂或特定的pH值才能溶解。
溶解性对于蛋白质的结构和功能具有重要影响，不溶解的蛋白质可能会失去其生物活性。
热稳定性蛋白质的热稳定性是指其在高温下是否能够保持其原有的结构和功能。
蛋白质的热稳定性受其组成氨基酸的性质和序列的影响。
一些蛋白质在高温下能够保持稳定，而另一些则易于发生变性和失活。
光学性质一些蛋白质具有旋光性，即其能够使得通过它们的光发生旋转现象。
这种旋光性取决于蛋白质分子中的手性氨基酸，如L-氨基酸和D-氨基酸。
光学性质对于鉴定和纯化蛋白质具有一定的重要性。
综上所述，蛋白质具有丰富的理化性质，包括分子质量、氨基酸组成、等电点、溶解性、热稳定性和光学性质等。
这些性质对于蛋白质的结构和功能具有重要的影响，也在蛋白质的研究和应用中发挥着重要的作用。
蛋白质理化性质
六、凝固作用、沉淀作用
• 凝固作用 变性和凝固一般无明显区别，凝固是 变性的继续。 • 沉淀作用 ① 调pH值 加酸加碱后，蛋白质分子 的电荷变动引起斥吸力改变。 ②盐析法 由于加入一定量的盐而使 蛋白质发生沉淀作用的现象称为盐析。 盐溶 盐析
沉淀作用
③ 有机溶剂沉淀蛋白质 与水互溶的有 机溶剂（丙酮、乙醇等），这些溶剂与水的 亲和力大，能夺取蛋白质颗粒上的水化膜， 加之有机溶剂的介电常数低，分子间引力加 大，蛋白质溶解度降低而沉淀。 ④ 重金属盐沉淀蛋白质 ⑤ 生物碱试ห้องสมุดไป่ตู้沉淀蛋白质 • 抗体对蛋白质的沉淀：抗原与特异性的抗体 蛋白结合发生沉淀。
蛋白质的性质
蛋 白 质 的 紫 外 吸 收
• 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯 丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 • 这三种氨基酸的在280nm附近有最大 光吸收。因此，大多数蛋白质在 280nm 附近显示强的吸收。 • 利用这个性质，可以对蛋白质进行 定性定量鉴定。
五、变性和凝固
5.1蛋白质的性质与它们的结构密切相关。 某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质 的结构状态，引起蛋白质理化性质改变 蛋 并导致其生理活性丧失。这种现象称为 白 蛋白质的变性(denaturation)。
例： Hb含铁量0.34％，求其最低分子量。 解：Hb(Mw)=55.85/0.34%=16700
其它方法测得Mw是68000，说明Hb中含4个Fe.
也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原 理计算蛋白质的最低分子量。
分子量的测定
② 渗透压法测分子量 渗透压公式：M=CRT/π ③ 超离心沉降测分子量 ④ 凝胶过滤法(分子排阻法)测分子量 另外，还有SDS-PAGE法和数学求商 法等。
蛋白质的变性
蛋白质的理化性质
三级结构是指整条肽链的折叠 和盘绕方式，形成具有特定空 间构象的完整蛋白质分子。
蛋白质的高级结构决定了其生 物学活性和功能，是蛋白质发
挥生物学功能的基础。
Байду номын сангаас2
蛋白质的理化性质
溶解性
蛋白质的溶解性主要取决于其氨基酸组成和分子结构。一些氨基酸如极性氨基酸可以增加蛋白质的水溶性，而疏水性氨基酸 则会使蛋白质更难溶于水。此外，蛋白质的溶解度还受到pH值、离子强度和温度等因素的影响。
蛋白质的溶解度对其功能性质有重要影响，如形成凝胶、乳化和稳定性等。在食品加工过程中，蛋白质的溶解度决定了其在 不同条件下的行为和功能表现。
黏度
蛋白质的黏度主要取决于其分子大小、形状和浓度。蛋白质 分子在溶液中会形成网状结构，从而产生黏度。此外，蛋白 质的黏度还受到温度、pH值和离子强度等因素的影响。
03
蛋白质的分类
按功能分类
结构蛋白
主要参与细胞和组织的结构组 成，如胶原蛋白和角蛋白。
酶蛋白
具有催化生物化学反应的功能 ，如羧基酶和脱氢酶。
运输蛋白
负责运输分子和离子，如血红 蛋白和转运蛋白。
免疫蛋白
参与免疫应答，如抗体和免疫 球蛋白。
按分子量分类
低分子量蛋白质
相对分子质量较小，通常在 10,000-50,000之间，如肌红蛋 白和细胞色素C。
酶的活性受温度、pH值、激活 剂和抑制剂等多种因素影响，需 要在适宜的条件下才能发挥最佳
效果。
酶在生物体内发挥着广泛的作用， 如消化、代谢、免疫等，对于生 物的生长、发育和繁殖至关重要。
激素活性
激素活性是指蛋白质在生物体 内作为激素的能力，能够调节 生物体的代谢、生长和发育等
蛋白质理化性质通用课件
超速离心法
利用极高的离心力使蛋白 质颗粒沉降，可同时实现 分离和纯化。
电泳法
纸电泳法
利用滤纸作为支持物进行 电泳，适用于小分子蛋白 质的分离。
凝胶电泳法
利用凝胶作为支持物进行 电泳，根据蛋白质的电荷 和分子量实现分离。
三级结构
三级结构是指整条多肽链的空 间构象，由二级结构通过肽链 间的相互作用形成。
主要的相互作用包括疏水键、 氢键、离子键和范德华力等。
三级结构决定了蛋白质的生物 学活性和功能，对蛋白质的结 构稳定性和热稳定性具有重要 影响。
四级结构
四级结构是指蛋白质复合物的结构， 由两条或两条以上具有三级结构的肽 链通过相互作用形成。
激素等。
按来源分类
动物蛋白
主要来源于肉、蛋、奶等动物产 品，如鱼肉蛋白、乳清蛋白等。
植物蛋白
主要来源于豆类、坚果、谷物等 植物产品，如大豆蛋白、小麦蛋 白等。
按结构分类
单体蛋白
由一条多肽链组成的蛋白质，如肌红 蛋白、血红蛋白等。
复合蛋白
由多个亚基组成的蛋白质，如一些酶 、蛋白质复合物等。
04
CATALOGUE
03
CATALOGUE
蛋白质的分类
按功能分类
01
02
03
04
结构蛋白
主要参与细胞和组织的结构组 成，如胶原蛋白、角蛋白等。
催化蛋白
具有生物催化作用的蛋白质， 如各种酶。
运输蛋白
负责运输各种分子和离子的蛋 白质，如血红蛋白、铁传递蛋
白等。
激素蛋白
具有调节生物体代谢和生理功 能的蛋白质，如胰岛素、生长
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一定条件下某种物质的Rf值是常数 一定条件下某种物质的 值是常数
蛋白质的物理性质（ 蛋白质的物理性质（二）
蛋白质的两性电离与等电点
体内多数蛋白质 的等电点为5 的等电点为5左 右，在生理条件 下多以负离子形 下多以负离子形 负离子 式存在 应用： 应用：蛋白质的 等电点沉淀、 等电点沉淀、离 子交换、 子交换、电泳
前处理（pretreatment)：蛋白质释放；保持天然状态；不变性， 前处理（pretreatment)：蛋白质释放；保持天然状态；不变性，不
失活。方法：（1 失活。方法：（1）电动允浆机或搅拌机 （2）超声波 ：（ 磨 （4）纤维素酶或溶菌酶处理 如果所需要的蛋白质集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、 如果所需要的蛋白质集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖 体等，则可用差速离心法将其分开， 体等，则可用差速离心法将其分开，收集该细胞组分作为下一步材料 （3）加沙研
蛋白质的定量分析
方法
凯氏定氮法 福林福林-酚试剂法 双缩脲法
原理
蛋白质具有恒定的含氮量 在碱性条件下蛋白质与铜生产复合物， 在碱性条件下蛋白质与铜生产复合物，还原 磷钼酸磷钼酸-磷钨酸试剂生产蓝色化合物 在碱性条件下， 在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与铜可生 产紫红色的络合物 在碱性溶液中， 在碱性溶液中，蛋白质将二价铜还原为一价铜 再与BCA 二羧酸-而喹啉钠） BCA（ 再与BCA（二羧酸-而喹啉钠）生产紫色复合物
灵敏度
25-250ug
0.5-10mg/ml
BCA比色法 BCA比色法
0.5ug/ml
考马斯亮蓝方法
考马斯亮蓝G 250能与蛋白质通过范得华相互作 考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作 用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液 用形成蛋白质 考马斯亮蓝复合物蓝色溶液
1ug
蛋白质纯度和分子量测定
氨基酸的化学性质（ 氨基酸的化学性质（三）
3 黄色反应 苯环结构的氨基酸 含有苯环结构的氨基酸， 硝酸后被硝化成 含有苯环结构的氨基酸，遇硝酸后被硝化成 黄色物质， 黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步 形成深橙色的硝醌酸钠 深橙色的硝醌酸钠。 形成深橙色的硝醌酸钠。 4 考马斯亮蓝反应 考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。 具有红色和蓝色两种色调。 考马斯亮蓝 具有红色和蓝色两种色调 酸性溶液中 其以游离态存在呈棕红色 溶液中， 棕红色。 在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色。 疏水结合后变成蓝色 与蛋白质疏水结合后变成蓝色。 与蛋白质疏水结合后变成蓝色。
硫硝基苯甲酸
可用于比色法定量测定半胱氨酸的含量
与X射线及晶体衍射有关的部分诺贝尔奖获得者名单
年 份 学 科 1901 物理 1914 物理 1915 1917 1924 1937 1954 1962 1962 1964 1985 1986 1994 得奖者 伦琴Wilhelm Conral Rontgen 劳埃Max von Laue 亨利.布拉格Henry Bragg 物理 劳伦斯.布拉格Lawrence Bragg. 物理 巴克拉Charles Glover Barkla 物理 卡尔.西格班Karl Manne Georg Siegbahn 戴维森Clinton Joseph Davisson 物理 汤姆孙George Paget Thomson 化学 鲍林Linus Carl Panling 肯德鲁John Charles Kendrew 化学 帕鲁兹Max Ferdinand Perutz Francis H.C.Crick、JAMES d.Watson、 生理医学 Maurice h.f.Wilkins 化学 Dorothy Crowfoot Hodgkin 霍普特曼Herbert Hauptman 化学 卡尔Jerome Karle 鲁斯卡E.Ruska 物理 宾尼希G.Binnig 罗雷尔H.Rohrer 布罗克豪斯 B.N.Brockhouse 物理 沙尔 C.G.Shull 内 容 X射线的发现 晶体的X射线衍射 晶体结构的X射线分析 元素的特征X射线 X射线光谱学 电子衍射 化学键的本质 蛋白质的结构测定 脱氧核糖核酸DNA测定 青霉素、B12生物晶体测定 直接法解析结构 电子显微镜 扫描隧道显微镜 中子谱学 中子衍射
1、材料的选择 组织匀浆和破碎细胞获得粗提液（前处理） 2、组织匀浆和破碎细胞获得粗提液（前处理） 3、蛋白质初步提纯（粗分级） 蛋白质初步提纯（粗分级） 选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白， 4、选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白，直 至完全纯化（细分级） 至完全纯化（细分级） 5、目标蛋白的鉴定
氨基酸在水中溶解度各异， 氨基酸在水中溶解度各异，易溶于酸和碱 分配层析、纸层析、 分配层析、纸层析、薄层层析
蛋白质的两性电离性质： 蛋白质的两性电离性质：
离子交换层析、 离子交换层析、电泳
（流动相） 流动相） （固定相） 固定相）
分配系数有差异 分配系数大的物质有较快的移动速度
点样、展 点样、 显色、 层、显色、 定性 定量） （定量）
“三相纯化策略” 三相纯化策略” 三相纯化策略 ( three phase purification strategy)
富集(capture 初步纯化， 1) 富集(capture step) ：初步纯化，去除那些与目标蛋白 质性质差异很大的物质及对目标蛋白质不稳定的物质如各 种蛋白酶。离子交换、疏水作用、亲和层析， 种蛋白酶。离子交换、疏水作用、亲和层析，对层析介质 的要求是流速快、 的要求是流速快、载量大 2) 中间纯化(intermediate step)：去除那些在分子大小、 中间纯化(intermediate step)：去除那些在分子大小、 理化性质与目标蛋白质类似的杂质， 理化性质与目标蛋白质类似的杂质，通常采用与富集时不 同的层析技术，对分离介质的要求是选择性好( 同的层析技术，对分离介质的要求是选择性好(分辨率 载量大, 高) 、载量大,通常应用颗粒较小的介质 3）精制(polishing step)：最终去除那些痕量杂质,达到产 精制(polishing step)：最终去除那些痕量杂质, 品的纯度要求，凝胶过滤是这一步中经常使用的层析技术， 品的纯度要求，凝胶过滤是这一步中经常使用的层析技术， 对分离介质的要求选择性高
蛋白质沉淀反应
• 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况， pH或电荷状况 胶体溶液中沉淀分离 • 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化， 下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉 可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉 淀，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 如等电点沉淀法、 • 如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响荷电）、重金属 如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响荷电）、重金属 ）、强酸碱沉淀 ）、 盐沉淀（Hg2+、 Cu2+、 Ag2+） 盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某 些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀 些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀
• 分子筛层析法：球形蛋白质 分子筛层析法：
二、蛋白质纯度的测定
• • • 层析法： 层析法： 电泳法： 电泳法：PAGE 免疫化学方法： 免疫化学方法：更具抗原与抗体反应的特异性
蛋白质末端分析
蛋白质二硫键分析
-
OOC CHCH2 SH NH3
+
-
OOC CH CH2 NH3 S S
+
-
OOC CHCH2 SH
5、根据生物功能专一性的纯化方法
亲和层析：是分离蛋白质的一种极为有效的方法。 亲和层析：是分离蛋白质的一种极为有效的方法。只需一步处理即可使某种 蛋白质从很混合物中分离出来， 蛋白质从很混合物中分离出来，且纯度很高 谷胱甘肽S 转移酶（GST）：可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化 谷胱甘肽S-转移酶（GST）：可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化 ）： 6组氨酸标签：在中性和弱碱性条件下，带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结 组氨酸标签：在中性和弱碱性条件下， 合，在低pH下用咪唑竞争洗脱 在低pH下用咪唑竞争洗脱 pH
氨基酸的化学性质（ 氨基酸的化学性质（一）
一切蛋白质或二肽以上的多肽都具有此反应
氨基酸的化学性质（ 氨基酸的化学性质（二）
氨基酸与茚三酮在弱酸 性溶液中加热可产生有 色化合物。 色化合物。与含有游离 的α-氨基的氨基酸和 氨基的氨基酸和 肽类生成紫色化合物， 肽类生成紫色化合物， 紫色化合物 而脯氨酸因其α 而脯氨酸因其α-氨基 被取代而生成黄色产物。 被取代而生成黄色产物。 灵敏度：微克级。 灵敏度：微克级。多肽 灵敏度降低
蛋白质的化学性质
三、蛋白质结构分析
测序 X射线晶体衍射 射线晶体衍射 核磁共振 质谱
定量分析
蛋白质的物理性质（ 蛋白质的物理性质（一）
蛋白质的吸收光谱： 蛋白质的吸收光谱：
酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸具有紫外光（280nm） 酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸具有紫外光（280nm） 吸收能力
蛋白质的物理性质： 蛋白质的物理性质：
细分级（ fractionation)：一般使用层析法 包括凝胶过滤、 层析法。 细分级（fine fractionation)：一般使用层析法。包括凝胶过滤、
离子交换、 离子交换、吸附和亲和层析等及电泳法
（二）蛋白质混合物的分离方法
1、根据分子大小的分离
（1）透析（dialysis)和超过滤(ultrafiltration)：玻璃纸、火棉纸和其它 透析（dialysis)和超过滤(ultrafiltration)：玻璃纸、 和超过滤(ultrafiltration) 合成材料 （2）密度梯度（区带）离心：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度 密度梯度（区带）离心：蔗糖梯度、 （3）凝胶过滤：交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等 凝胶过滤：交联葡聚糖、