第五章 蛋白质理化性质的分析

5、根据生物功能专一性的纯化方法
亲和层析：是分离蛋白质的一种极为有效的方法。 亲和层析：是分离蛋白质的一种极为有效的方法。只需一步处理即可使某种 蛋白质从很混合物中分离出来， 蛋白质从很混合物中分离出来，且纯度很高 谷胱甘肽S 转移酶（GST）：可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化 谷胱甘肽S-转移酶（GST）：可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化 ）： 6组氨酸标签：在中性和弱碱性条件下，带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结 组氨酸标签：在中性和弱碱性条件下， 合，在低pH下用咪唑竞争洗脱 在低pH下用咪唑竞争洗脱 pH
氨基酸在水中溶解度各异， 氨基酸在水中溶解度各异，易溶于酸和碱 分配层析、纸层析、 分配层析、纸层析、薄层层析
蛋白质的两性电离性质： 蛋白质的两性电离性质：
离子交换层析、 离子交换层析、电泳
（流动相） 流动相） （固定相） 固定相）
分配系数有差异 分配系数大的物质有较快的移动速度
点样、展 点样、 显色、 层、显色、 定性 定量） （定量）
“三相纯化策略” 三相纯化策略” 三相纯化策略 ( three phase purification strategy)
富集(capture 初步纯化， 1) 富集(capture step) ：初步纯化，去除那些与目标蛋白 质性质差异很大的物质及对目标蛋白质不稳定的物质如各 种蛋白酶。离子交换、疏水作用、亲和层析， 种蛋白酶。离子交换、疏水作用、亲和层析，对层析介质 的要求是流速快、 的要求是流速快、载量大 2) 中间纯化(intermediate step)：去除那些在分子大小、 中间纯化(intermediate step)：去除那些在分子大小、 理化性质与目标蛋白质类似的杂质， 理化性质与目标蛋白质类似的杂质，通常采用与富集时不 同的层析技术，对分离介质的要求是选择性好( 同的层析技术，对分离介质的要求是选择性好(分辨率 载量大, 高) 、载量大,通常应用颗粒较小的介质 3）精制(polishing step)：最终去除那些痕量杂质,达到产 精制(polishing step)：最终去除那些痕量杂质, 品的纯度要求，凝胶过滤是这一步中经常使用的层析技术， 品的纯度要求，凝胶过滤是这一步中经常使用的层析技术， 对分离介质的要求选择性高
与非极性吸附剂的结合可能主要是范德华力和疏水作用； 与非极性吸附剂的结合可能主要是范德华力和疏水作用；而与极性吸附剂的 范德华力和疏水作用 作用的主要力可能是离子吸引或氢键键和。吸附剂：结晶磷酸钙（ 作用的主要力可能是离子吸引或氢键键和。吸附剂：结晶磷酸钙（羟磷灰 石）、活性炭、硅胶、氧化铝和磷酸钙凝胶等。现在蛋白质提纯中使用最广 ）、活性炭、硅胶、氧化铝和磷酸钙凝胶等。 活性炭 泛和最有效的。 泛和最有效的。
氨基酸的化学性质（ 氨基酸的化学性质（三）
3 黄色反应 苯环结构的氨基酸 含有苯环结构的氨基酸， 硝酸后被硝化成 含有苯环结构的氨基酸，遇硝酸后被硝化成 黄色物质， 黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步 形成深橙色的硝醌酸钠 深橙色的硝醌酸钠。 形成深橙色的硝醌酸钠。 4 考马斯亮蓝反应 考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。 具有红色和蓝色两种色调。 考马斯亮蓝 具有红色和蓝色两种色调 酸性溶液中 其以游离态存在呈棕红色 溶液中， 棕红色。 在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色。 疏水结合后变成蓝色 与蛋白质疏水结合后变成蓝色。 与蛋白质疏水结合后变成蓝色。
硫硝基苯甲酸
可用于比色法定量测定半胱氨酸的含量
与X射线及晶体衍射有关的部分诺贝尔奖获得者名单
年 份 学 科 1901 物理 1914 物理 1915 1917 1924 1937 1954 1962 1962 1964 1985 1986 1994 得奖者 伦琴Wilhelm Conral Rontgen 劳埃Max von Laue 亨利.布拉格Henry Bragg 物理 劳伦斯.布拉格Lawrence Bragg. 物理 巴克拉Charles Glover Barkla 物理 卡尔.西格班Karl Manne Georg Siegbahn 戴维森Clinton Joseph Davisson 物理 汤姆孙George Paget Thomson 化学 鲍林Linus Carl Panling 肯德鲁John Charles Kendrew 化学 帕鲁兹Max Ferdinand Perutz Francis H.C.Crick、JAMES d.Watson、 生理医学 Maurice h.f.Wilkins 化学 Dorothy Crowfoot Hodgkin 霍普特曼Herbert Hauptman 化学 卡尔Jerome Karle 鲁斯卡E.Ruska 物理 宾尼希G.Binnig 罗雷尔H.Rohrer 布罗克豪斯 B.N.Brockhouse 物理 沙尔 C.G.Shull 内 容 X射线的发现 晶体的X射线衍射 晶体结构的X射线分析 元素的特征X射线 X射线光谱学 电子衍射 化学键的本质 蛋白质的结构测定 脱氧核糖核酸DNA测定 青霉素、B12生物晶体测定 直接法解析结构 电子显微镜 扫描隧道显微镜 中子谱学 中子衍射
1、材料的选择 组织匀浆和破碎细胞获得粗提液（前处理） 2、组织匀浆和破碎细胞获得粗提液（前处理） 3、蛋白质初步提纯（粗分级） 蛋白质初步提纯（粗分级） 选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白， 4、选择一种或几种合适的方法除去杂蛋白，直 至完全纯化（细分级） 至完全纯化（细分级） 5、目标蛋白的鉴定
蛋白质的化学性质
三、蛋白质结构分析
测序 X射线晶体衍射 射线晶体衍射 核磁共振 质谱
定量分析
蛋白质的物理性质（ 蛋白质的物理性质（一）
蛋白质的吸收光谱： 蛋白质的吸收光谱：
酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸具有紫外光（280nm） 酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸具有紫外光（280nm） 吸收能力
蛋白质的物理性质： 蛋白质的物理性质：
+ NH3
-
OOC CH CH2 NH3
+
COO S H+ NCHCH2S- + 3
S
-
Leabharlann Baidu
(DTNB) CO2H 二硫硝基苯甲酸 (DTNB Ellman反应 Ellman反应 NO2
NO2 CO2H
COO + H3NCHCH2S-S-
-
HSNO2 + CO2H
COO NO2
-
在pH8.0时，412nm波长有强烈吸收 pH8.0时 412nm波长有强烈吸收
氨基酸的化学性质（ 氨基酸的化学性质（一）
一切蛋白质或二肽以上的多肽都具有此反应
氨基酸的化学性质（ 氨基酸的化学性质（二）
氨基酸与茚三酮在弱酸 性溶液中加热可产生有 色化合物。 色化合物。与含有游离 的α-氨基的氨基酸和 氨基的氨基酸和 肽类生成紫色化合物， 肽类生成紫色化合物， 紫色化合物 而脯氨酸因其α 而脯氨酸因其α-氨基 被取代而生成黄色产物。 被取代而生成黄色产物。 灵敏度：微克级。 灵敏度：微克级。多肽 灵敏度降低
2、利用溶解度差别的分离方法
（1）等电点沉淀和pH控制 等电点沉淀和pH控制 pH （2）蛋白质的盐析和盐溶 （3）疏水层析 常用硫酸铵沉淀、 常用硫酸铵沉淀、离子交换和亲和层析之后
3、根据电荷不同的分离方法
（1）电泳 （2）离子交换层析
水平板式电泳槽
垂直板式电泳槽
4、蛋白质的选择吸附分离： 蛋白质的选择吸附分离：
蛋白质的定量分析
方法
凯氏定氮法 福林福林-酚试剂法 双缩脲法
原理
蛋白质具有恒定的含氮量 在碱性条件下蛋白质与铜生产复合物， 在碱性条件下蛋白质与铜生产复合物，还原 磷钼酸磷钼酸-磷钨酸试剂生产蓝色化合物 在碱性条件下， 在碱性条件下，蛋白质分子中的肽键与铜可生 产紫红色的络合物 在碱性溶液中， 在碱性溶液中，蛋白质将二价铜还原为一价铜 再与BCA 二羧酸-而喹啉钠） BCA（ 再与BCA（二羧酸-而喹啉钠）生产紫色复合物
一、蛋白质分子量的测定
• • • 蛋白质最小分子量的测定 最小分子量=原子量/组成百分数× 最小分子量=原子量/组成百分数×100 超速离心法： 超速离心法：分子大小和形状相同的蛋白质以相同的速度沉淀 SDS-PAGE电泳法：蛋白质所带电荷和分子大小不同， SDS-PAGE电泳法：蛋白质所带电荷和分子大小不同，在电场中的电泳速度各 电泳法 异
• 分子筛层析法：球形蛋白质 分子筛层析法：
二、蛋白质纯度的测定
• • • 层析法： 层析法： 电泳法： 电泳法：PAGE 免疫化学方法： 免疫化学方法：更具抗原与抗体反应的特异性
蛋白质末端分析
蛋白质二硫键分析
-
OOC CHCH2 SH NH3
+
-
OOC CH CH2 NH3 S S
+
-
OOC CHCH2 SH
蛋白质工程
第一章绪论 第二章蛋白质结构基础 第三章蛋白质分子设计 第四章蛋白质的修饰和表达 第五章蛋白质理化性质的分析和鉴定 第六章蛋白质工程的实际应用
第五章 蛋白质的理化性质分析
一、蛋白质理化性质 蛋白质理化性质 理化
蛋白质的物理性质 蛋白质的物理性质
分离纯化策略 分离纯化程序 三相纯化策略
二、蛋白质分离与纯化
多种分离纯化技术的联合应用
在进行重组蛋白的纯化时， 在进行重组蛋白的纯化时，对分离纯化方法的 选择应遵循以下原则： 选择应遵循以下原则：
• 应选择不同分离纯化机理的方法联合应用 • 选择能除去含量最多杂质的方法 • 选择高效的分离方法 • 将费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段 将费时、
（一）目标蛋白质的分离纯化程序
粗分级（rough fractionation)：当蛋白质混合物提取液得到后， fractionation)：当蛋白质混合物提取液得到后， 粗分级（
就可选用适当的方法将所需要的蛋白质与其它杂蛋白分开。 就可选用适当的方法将所需要的蛋白质与其它杂蛋白分开。一般这一步用 盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、 盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、 分级分离等方法 处理量大，既能除去大量杂质， 处理量大，既能除去大量杂质，又可浓缩蛋白质溶液
灵敏度
25-250ug
0.5-10mg/ml
BCA比色法 BCA比色法
0.5ug/ml
考马斯亮蓝方法
考马斯亮蓝G 250能与蛋白质通过范得华相互作 考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作 用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液 用形成蛋白质 考马斯亮蓝复合物蓝色溶液
1ug
蛋白质纯度和分子量测定
不同蛋白质采取不同的分离纯化策略
• 分泌型重组蛋白：体积大、浓度低易先行浓缩处理： 分泌型重组蛋白：体积大、浓度低易先行浓缩处理：
沉淀、 沉淀、超滤
• 包涵体型重组蛋白：离心 包涵体型重组蛋白： • 融合型重组蛋白 胞内可溶： 胞内可溶：亲和层析 细胞膜和细胞壁之间：溶菌酶（低浓度） 细胞膜和细胞壁之间：溶菌酶（低浓度）
蛋白质沉淀反应
• 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从 在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况， pH或电荷状况 胶体溶液中沉淀分离 • 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化， 下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉 可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉 淀，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 如等电点沉淀法、 • 如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响荷电）、重金属 如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响荷电）、重金属 ）、强酸碱沉淀 ）、 盐沉淀（Hg2+、 Cu2+、 Ag2+） 盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某 些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀 些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀
前处理（pretreatment)：蛋白质释放；保持天然状态；不变性， 前处理（pretreatment)：蛋白质释放；保持天然状态；不变性，不
失活。方法：（1 失活。方法：（1）电动允浆机或搅拌机 （2）超声波 ：（ 磨 （4）纤维素酶或溶菌酶处理 如果所需要的蛋白质集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、 如果所需要的蛋白质集中在某一细胞组分，如细胞核、染色体、核糖 体等，则可用差速离心法将其分开， 体等，则可用差速离心法将其分开，收集该细胞组分作为下一步材料 （3）加沙研
细分级（ fractionation)：一般使用层析法 包括凝胶过滤、 层析法。 细分级（fine fractionation)：一般使用层析法。包括凝胶过滤、
离子交换、 离子交换、吸附和亲和层析等及电泳法
（二）蛋白质混合物的分离方法
1、根据分子大小的分离
（1）透析（dialysis)和超过滤(ultrafiltration)：玻璃纸、火棉纸和其它 透析（dialysis)和超过滤(ultrafiltration)：玻璃纸、 和超过滤(ultrafiltration) 合成材料 （2）密度梯度（区带）离心：蔗糖梯度、聚蔗糖梯度 密度梯度（区带）离心：蔗糖梯度、 （3）凝胶过滤：交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖等 凝胶过滤：交联葡聚糖、
一定条件下某种物质的Rf值是常数 一定条件下某种物质的 值是常数
蛋白质的物理性质（ 蛋白质的物理性质（二）
蛋白质的两性电离与等电点
体内多数蛋白质 的等电点为5 的等电点为5左 右，在生理条件 下多以负离子形 下多以负离子形 负离子 式存在 应用： 应用：蛋白质的 等电点沉淀、 等电点沉淀、离 子交换、 子交换、电泳