第七章 发酵工艺的控制

产物量 的测定
卡那霉素、红霉素等定义活性部分1μg＝1u 类似重量单位：规定抗生素的某种盐1mg=1000u如金霉素、 四环素的盐酸盐定一为1μg＝1u 不能用重量来表示酶的量。
②酶活力的表示法 酶活力用单位来表示。由于酶通常不是很纯 ③浓度表示法
三、发酵过程重要参数的控制
（一）温度对发酵过程的影响及其控制



大多数细菌：最适pH 为6.5-7.5； 霉菌为：4.0-5.8； 酵母为：3.8-6.0； 放线菌为：6.5-8.0。 不同菌种所需的pH有 差别 同一种类的微生物菌 种由于生长pH值不同 也可能形成不同发酵 产物



不同菌种所需的pH有差 别 同一种类的微生物菌种 由于生长pH值不同也可 能形成不同发酵产物， 如：黑曲霉：在pH2-3 时产柠檬酸，中性时产 草酸。
发酵热的测定及计算：
通过测量一定时间内冷却水的进出口温度差来计算：Q 发酵 =GC(t2-t1)/V；
Q生物：随菌种、生长时期和培养基成分的不同而变化； Q生 物=0.12 QO2 Q搅拌：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩 擦所产生的热量。 Q搅拌=（P/V）3600 Q蒸发：无菌空气与发酵液接触后，排出引起水分的蒸发报 需的热量。与温差大小有关。 Q辐射：发酵罐与环境温差而引起的热量辐射。与温差有关。


pH对菌体生长、代谢影响的主要原因： （1）细胞质膜的电性改变 （2）影响营养吸收和代谢途径 （3）影响酶活 （4）影响基质和产物性质。

2、影响pH值改变的因素

（1）产酸 （2）产碱 （3）耗酸耗碱 （4）加糖或加油过多 （5）生理酸性盐的利用（硫酸铵中氨离子被利用） （6）基质被分解形成碱性物质。

要确定合理的放罐时间，必须考虑以下几点： （1）经济因素： （2）产品质量因素： （3）其它因素：如染菌、代谢异常等。
确定放罐指标有：产物产量、过滤速度、氨基酸含量、 菌丝形态、pH值、发酵液外观和粘度。

分批发酵产量、产率、成本、利润与发酵时间的关系
（a,b,c三点分别为达到最高产率、最低成本和最大利润的发酵时间； d为无亏损点。发酵时间的选择ac之间的b 点比较理想）
氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。 氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子 的抑制。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程。 发酵后期氨基氮回升时要适时放罐，否则影响提取过程。
（3）菌浓度和菌形态 直接反映菌生长的情况。
菌形态：显微镜观察。
菌浓度的测定是衡量产生菌在整个培养过程中菌体 量的变化，一般前期菌浓增长很快，中期菌浓基本 恒定。补料会引起菌浓的波动，这也是衡量补料量 适合与否的一个参数。


“临界氧浓度”：微生物对发酵液中溶氧的最低要求
浓度，以C临界表示。
2、影响菌体需氧的因素
r= QO2 .X
(1)菌体浓度
(2)QO2 遗传因素
菌龄
营养的成分与浓度 有害物质的积累 培养条件
3、发酵过程供氧方式

实验室中:摇瓶机往复运动或偏心旋转运动供 氧。
中试规模和生产规模:通入无菌压缩空气并同 时进行搅拌。
菌浓测定方法 测粘度
压缩体积法（离心）
静置沉降体积法
光密度测定法 OD600~660 适合于细菌、酵母
（4）产物浓度 产物浓度直接反映了生产的状况,是发酵控制的重 要参数。
①效价表示法 有效成分的多少，大小用单位（U）来表示
重量折算单位：以最低抑菌浓度为一个单位， 如青霉素0.6微克＝1U 重量单位：规定某些抗生素活性部分1μg=1u 如链霉素、

1、温度对发酵的影响
（1）温度影响菌的生长速率；
（2）温度影响菌体的代谢途径； （3）温度影响发酵液的理化性质。 如：四环素发酵中金色链丝菌在低于30℃时合成金霉素的 能力较强，随着温度升高，合成四环素比例提高 又如：谷氨酸发酵，37℃时乳酸积累，低于20℃时氨基酸 合成途径的终产物反馈抑制作用加强。

（二）pH值对发酵过程的影响及其控制Βιβλιοθήκη Baidu


1、 pH对菌体生长和产物形成的影响：
（1）pH影响菌的生长速率； （2）pH影响菌体的代谢途径； （3）pH影响发酵液的理化性质。 黑曲霉：在pH2-3时产柠檬酸，中性时产草酸。 丙酮丁醇菌生长最适pH为5.5-7.0，而发酵最适pH为4.3-5.3。 青霉素菌生长最适pH为6.5-7.2，而青霉素合成最适pH为 6.2-6.8；

2、染菌主要原因

种子带菌 无菌空气带菌 设备渗漏 灭菌不彻底 操作失误 技术管理不善。
某制药厂发酵染菌分析举例
染菌原因 空气系统 设备问题
染菌率% 32.05 15.46
染菌原因 补料 种子带菌 环境污染或 不明原因
染菌率% 4.30 1.72
管理、操作
11.34



2、引起发酵过程温度变化的原因
发酵热：发酵过程中释放出来的净热量。
发酵过程中，随着菌体对培养基成分的利用，菌体进行氧 化代谢所释放的能量一部分被利用，其余则变成热能放出； 机械搅拌的作用产生的热量和因罐壁散热，水分蒸发等也 带走部分热量。


发酵过程中产热和散热的因素： （1）发酵热：Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射
液膜 界面 气膜
Po2 气 泡 O2 P*o2 C*o2
发酵液 co2
5、影响供氧的因素
（1）搅拌
1)搅拌的作用： a. 增加气液接触面积； b. 延长气泡运动路线，增加气液接触时间(使液体 作涡流运动) ； c.减少气泡周围液膜厚度 (使发酵液呈湍流运动) ； d.避免菌体结团，增加菌体对氧气的吸收。
1、发酵参数类型
按性质分可分三类：
物理参数：温度、搅拌转速、空气压力、空气流量、
溶解氧、表观粘度、排气氧（二氧化碳）浓度等。 化学参数：基质浓度（包括糖、氮、磷）、pH、产物 浓度、核酸量等。 生物参数：菌丝形态、菌浓度、菌体比生长速率、呼 吸强度、基质消耗速率、关键酶活力等。
从检测手段可分为：直接参数、间接参数
第七节 发酵工艺的控制

一、发酵工艺控制的目的与方法
二、温度对发酵过程的影响及其控制
三、pH值对发酵过程的影响及其控制
四、溶解氧对发酵过程的影响及其控制
五、泡沫对发酵过程的影响及其控制
六、发酵终点的判断
一、发酵过程工艺控制的目的
维持菌种最佳发酵条件，得到最大的比生 产速率和最大的生产率，使菌种的代谢潜 能得以发挥。
直接参数：通过仪器或其它分析手段可以测得的参
数，如温度、pH、残糖等。
在线检测参数 指不经取样直接从发酵罐上安装的仪表上 得到的参数，如温度、pH、搅拌转速； 指取出样后测定得到的参数，如残糖、
直接参数
离线检测参数
NH2-N、菌体浓度。
间接参数：将直接参数经过计算得到的参数，如摄氧率、KLa等。
2、几种重要发酵参数 （1）糖含量
糖的消耗：反映产生菌的生长繁殖情况；反映产物合成的活力。
糖含量测定包括总糖和还原糖。 总糖指发酵液中残留的各种糖的总量。如发酵中的淀粉、饴糖、 单糖等各种糖。 还原糖指含有自由醛基的单糖，通常指的是葡萄糖。
（2）氨基氮和氨氮
氨基氮指有机氮中的氮（NH2-N），单位是 mg/100ml。
氨氮指无机氨中的氮（NH3-N）。

3、最适温度的选择
最适发酵温度Tm发酵：最适菌体生长温度+最适产物 合成温度（Tm生长+Tm合成）。 Tm生长和Tm合成往往不一致。 Tm发酵还与菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长 阶段而改变。



4、最适温度的控制
工业上控温一般不需加热，而是 冷 却。 冷却方式：夹套或蛇形管中通入冷 却水，通过热交换来降温，利用自 动或手动调整冷却量以保持恒温发 酵。

（5）发酵罐体积： 大利用氧效率高（7-10%），小的效率低（3-5%）。 （6）发酵液的物理性质： 粘度、表面张力、离子浓度、泡沫等。

（四）泡沫对发酵过程的影响及其控制

1、泡沫的性质：发酵液中气体的逸出，加上发酵 液中含有蛋白质等发泡成分，故产生泡沫。

2、影响：泡沫过多而持久会影响发酵罐的装料系

2)搅拌器形式 轴向式和径向式两种。
上组发酵搅拌器多采用平桨式， 轴向液流有利于气液混合； 下组，多采用圆盘涡轮式，直径 小、转速快、效率高、功耗低、 产生径向液流、延长气体停留时 间，有利于打碎气泡。

3)挡板对搅拌液体流型的影响

4)搅拌组数对溶氧的影响


（2）空气线速度
kLα∝VSβ（VS为空气线速度；β为指数0.4-0.72）
35.13
3、染菌分析


（1）从染菌时间上： 早期染菌---可能是种子带菌、灭菌不彻底、操作失误、 无菌空气带菌。 后期染菌---中间补料污染、设备渗漏，操作问题。


呼吸强度：指单位重量干菌体在单位时间内所吸 取的氧量，以Qo2表示，单位为mmolO2/g干菌 体〃h)。 耗氧速率：指单位体积培养液在单位时间内的吸 氧量，以r表示，单位为(mmolO2/L〃h)。 r＝QO 〃X 2
式中：r——微生物耗氧速率(mmol)2/L〃h)； Qo2--菌体呼吸强度，(mmol)2/(g〃h))； X——发酵液中菌体浓度，(g/L)。

3、 发酵过程中pH值的调节及控制 （1）调节培养基原始pH值 （2）加缓冲剂 （3）使用盐类与碳源的配比平衡 （4）调节通风量 （5）补料发酵 （6）流加酸碱。 （7）添加碳酸钙法 （8）氨水流加法或尿素流加法。





（三）溶解氧对发酵过程的影响及其控制

1、供氧与微生物呼吸的关系


产量P；产率RP；成本C；利润B

C`：单产成本
P：产量 Rp：产率

C：成本
B：利润

a
d
b c 发酵时间
四、发酵过程染菌及防治
（一）污染对发酵造成的后果



1、基质或产物消耗使生产能力下降； 2、产生新的代谢物使收率和质量下降； 3、改变发酵pH使发酵过程异常； 4、分解产物使发酵过程失败； 5、噬菌体感染使菌种细胞裂解。
数，溢出损失或增加染菌机会，影响搅拌溶氧。 3、发酵过程中泡沫的产生：与通风、搅拌、原料 性质、微生物代谢活动状态



4、控制：
（1）化学消泡：气液界面散布系数大、水溶解度小、无毒、 不干扰溶氧、来源方便便宜。主要品种有：天然油脂；高 级醇、脂肪酸和酶类；聚醚类；硅酮类。 （2）机械消泡：

（五）发酵终点的判断

4、氧在液体中的传递



传递过程可分供氧及耗氧两个方面。 供氧:是指空气中的氧气从空气泡里通 过气膜（1/k1） 、气液界面(1/k2)和 液膜(1/k3)扩散到液体主流(1/k4)中。 耗氧:是指氧分子自液体主流通过液膜 (1/k5)、菌丝丛（1/k6）、细胞膜 （1/k7）扩散到细胞内（1/k8） 。 氧在传递过程中必须克服一系列的阻 力，才能被微生物所利用。
从菌种内在特点上满足： 生长速率、呼吸强度、营养要求（酶系统）、代谢速 率等； 从菌种外部环境上控制： 温度、pH、溶氧浓度、渗透压、离子强度、剪切力 等。
二、发酵过程的中间分析
中间分析是工艺控制的眼睛，从分析的代谢参数 来判断发酵过程中微生物的主要代谢变化。
代谢参数又称为状态参数，它们反映发酵 过程中菌的生理代谢状况. 如pH，溶氧，尾气氧，尾气二氧化碳，粘 度，菌浓度等
增加风量时，如空气线速度相应增加时，则溶
氧增加； 当空气线速度增加过大时，则会发生“过载” 现象，使搅拌效率和溶氧速率大大降低


（3）氧的分压：(p-p*) 加大罐压；提供纯氧。


（4）发酵罐内液柱高度 H/D从1增加到2时，kLα可增

加40%；H/D从2增加到3时，
kLα可增加20%；一般倾向 于H/D=3-5。但H/D过大， 对溶氧系数增加不大。

（二）发酵染菌的症状


1、耗氧异常（加快或减慢）； 2、耗糖异常（加快或减慢）； 3、CO2含量异常（增加或减少）； 4、泡沫增多； 5、pH异常； 6、菌浓异常。

（三）染菌的检查、原因分析和防止措施
1、染菌的检查与判断： 镜检：染色观察。 肉汤培养检查：测细菌或噬菌体 平板或斜面培养：杂菌检出。 每6-8小时检测一次，一般连续三次阳性反应即可判为 染菌。