2. 第一链cDNA合成(反转录)
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明
cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。
（2）cDNA第一条链的合成。
（3）cDNA第二条链的合成。
（4）双链cDNA的修饰。
（5）双链cDNA的分子克隆。
（6）cDNA文库的扩增。
（7）cDNA文库鉴定评价。
一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。
）。
2. 混匀后，70℃反应10分钟。
3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。
4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。
6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。
7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。
二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。
逆转录
A 包装 500μl
B 包装 1ml
50μl
100μl
1ml
1ml×2
注意事项：
1）用 DEPC 处理实验用到的所有实验器材，或者 购买已经证明无核酸酶的实验用具，实验过程戴 手套并经常更换手套，避免 RNA 酶的污染。 2）确保所用试剂中无 RNA 酶污染。 3）试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中，所 有管子要确保扣严。 4）纯化过的 RNA 必须保证不含有盐，金属离子， 乙醇和苯酚，以上成分会干扰第一链 cDNA 的合 成反应。可采用乙醇沉淀 RNA 的方法去除掉痕量 污染物。 5）为保证反转录反应的有效进行，需使用高质量 的 RNA 模板。 6）实验结果显示，最快逆转录速度可达 2kb/min， 需要提高反转录效率或模板含量较低时可以适当 延长反转录时间。
本制品中 Random N6 和 Oligo(dT)18 引物比例经过优化，可均 匀合成样品中的 cDNA；
本制品中含有去基因组成分，反转录时可同步去除基因组 DNA 污染。
保存温度：-20℃。
产品包装：
产品组成 2×NovoScript® Plus 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix gDNA Purge RNase Free Water
仅供科研使用，不能直接应用于人体
近岸蛋白质科技有限公司
Novoprotein Scientific Inc.
技术咨询电话：400-600-0940；(021)5079-8060 官方网站： 邮箱：product@ 地址：上海市浦东新区张江高科技园区伽利略路11号1号楼
II.第一链 cDNA 的 PCR 扩增
合成的第一链cDNA可直接用于PCR。
常用反应体系（50μl）：
cdna合成的基本原理
CDNA合成的基本原理介绍CDNA合成是一种常用的分子生物学技术，用于将RNA转录本转化为相应的DNA序列。
本文将详细探讨CDNA合成的基本原理及其在生物研究中的应用。
一、CDNA合成的步骤CDNA合成通常包括以下几个主要步骤：1. RNA提取首先，需要从细胞或组织中提取RNA。
RNA提取的方法有很多种，常用的包括酚-氯仿法和商用RNA提取试剂盒。
2. 反转录反应反转录反应是将RNA转录本转化为相应的DNA序列的关键步骤。
该反应通常在逆转录酶的作用下进行。
逆转录酶能够将RNA模板上的核酸序列转录成互补的DNA链。
3. DNA合成在反转录反应中，逆转录酶合成的第一链cDNA是由RNA模板的互补链合成的。
为了合成双链cDNA，需要在反应体系中加入DNA聚合酶和dNTPs。
4. 纯化和放大合成的cDNA需要经过纯化和放大，以获得足够的量用于后续实验。
纯化通常通过凝胶电泳、酶切和PCR等方法进行。
二、CDNA合成的重要考虑因素在进行CDNA合成时，需要考虑以下几个重要因素：1. RNA模板的选择在CDNA合成之前，需要选择适当的RNA模板。
RNA模板的选择应根据研究的目的和样本的特性来确定。
不同类型的RNA模板可能需要不同的反转录酶和反应条件。
2. 反转录酶的选择逆转录酶是CDNA合成的关键酶，不同的逆转录酶具有不同的特性。
例如，一些逆转录酶具有RNA依赖性DNA聚合酶活性，可以直接合成双链cDNA，而其他逆转录酶则需要额外添加DNA聚合酶。
3. 反应条件的优化反转录反应的条件需要根据具体实验进行优化。
反应温度、反应时间、逆转录酶和dNTPs的浓度等因素都可能影响CDNA合成的效率和准确性。
4. RNA降解的控制RNA在提取和合成过程中容易受到降解的影响。
为了避免RNA降解对CDNA合成的影响，可以在提取过程中添加RNase抑制剂，并在合成过程中加入RNase H来降解RNA模板。
三、CDNA合成的应用CDNA合成在生物研究中有广泛的应用，包括以下几个方面：1. 基因表达分析CDNA合成可以用于基因表达分析。
ThermoScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒适用于RT-qPCR
产品信息Thermo ScientificMaxima第一链cDNA合成试剂盒（适用于RT-qPCR）#K1641，#K1642/onebio分析证书经验证，在两步法RT-qPCR中，对于不同起始量（5 ng-0.5 fg）的RNA逆转录产物，使用Thermo Scientific Maxima SYBR Green/ROX qPCR 预混液进行qPCR扩增。
其反应效率在90-110％之间，曲线斜率在-3.09和-3.58之间，且相关系数>0.99。
质量授权人：Jurgita Zilinskiene目录页码试剂盒组分 (4)贮存条件 (4)产品描述 (4)重要提示 (5)RT-qPCR实验方案 (6)对照反应 (6)疑难解答 (7)参考文献 (8)试剂盒组分贮存条件所有试剂盒成分都应贮存于-20 °C。
产品描述Thermo Scientific Maxima第一链cDNA合成试剂盒是合成cDNA第一链的方便系统，适用于两步法实时定量RT-PCR（RT-qPCR）中的cDNA合成。
试剂盒采用先进的Maxima 反转录酶（RT），该酶源自M-MuL V 逆转录酶的体外进化。
这种酶相比M-MuL V逆转录酶热稳定性高，扩增效果强劲且具有更高的cDNA合成效率。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒能够在较高温度下（55-65℃），在很宽的总RNA量范围内（从1 pg到5 μg）合成cDNA。
合成反应能在15-30分钟内完成。
Maxima第一链cDNA合成试剂盒的各组分经预混合，以节约时间和减少移液错误。
试剂盒由Maxima Enzyme Mix、5×反应混合液、无核酸酶的水三部分组成。
Maxima Enzyme Mix包含Maxima反转录酶和Thermo Scientific Ribolock RNase抑制剂。
重组的Ribolock RNase抑制剂能有效保护RNA模板在高于55℃时不被RNase A、B和C降解。
cDNA第一链合成试剂盒
cDNA 第一链合成试剂盒操作方法1、逆转录反应（ 1）在无菌薄壁管中加入以下成份：Total RNA 0.5-1.0 μg(dN) 9 or oligo(dT) 18 100pmol（ 2）混匀后， 70℃变性 5min，将薄壁管迅速置于冰上冷却，然后依次加入以下成份：5×M-MLV Buffer 4μldNTPs（ 10mM each）RNasin 1μl 10U100mM DTTM-MLV Reverse Transcriptase 2μl 100UDEPC-treated water up to 20 μl（ 3）混匀后短暂离心，使用oligo(dT) 18 引物时在42℃，使用随机引物(dN) 9 时在37℃下温育 1 小时。
（4） 94 ℃ 5min 终止反应后，冰上冷却。
（5）合成的 cDNA第一链可直接用于 PCR扩增或进行其它下游操作。
2、 PCR扩增（ 1）在 PCR薄壁管中加入以下试剂Synthesized cDNA 2-5 μl10×PCR Buffer 2μlUpper primer 10pmolLower primer 10pmoldNTPs（10mM each）0.5 μlTaq DNA Polymerase 1.5UddH2O up to 20 μl（ 2）混匀后短暂离心，然后进行PCR扩增。
94℃预变性 2.5min 。
进入下列30~40 个循环（此扩增条件仅供参考）：94℃30s， 60℃ 45s ，72℃ 1min ~3min。
最后 72℃延伸 7min。
注意事项1、确保 RNA完整性及纯度。
RNA质量是决定合成cDNA第一链成功的关键因素，其纯度及完整性可由 OD260/OD280比值和进行琼脂糖凝胶电泳检测。
较纯的 RNA 样品 OD260/OD280比值通常为 1.8-2.0 ，若该比值偏低，应进一步纯化。
真核生物RNA样品电泳图谱 28s 和 18s 的比值约为 2:1 ，否则，表明有 RNA降解。
cdna第一链合成所需要的引物
cdna第一链合成所需要的引物CDNA合成是一种在实验室中合成DNA的技术。
在合成CDNA的过程中，引物起着关键的作用。
引物是一种短链DNA或RNA序列，其序列与目标RNA 的反义序列互补。
通过引物的互补配对，CDNA链可以在反转录过程中产生。
在合成CDNA第一链时，需要使用两种引物，即逆转录引物和OLIGO（dT）引物。
逆转录引物是在典型的CDNA合成反应中使用的第一个引物，它通常由RNA 依赖的DNA聚合酶（例如M-MLV逆转录酶）合成。
逆转录引物的设计应囊括目标RNA的起始位点，以确保所有目标RNA分子都能够转录成CDNA。
OLIGO（dT）引物是用于合成mRNA的CDNA的第二个引物。
它是一种具有多个连续脱氧胸腺嘧啶（dT）的短链DNA序列。
这种引物通过与目标mRNA 的多聚腺嘌呤尾部互补，从而将其用作合成CDNA的起始点。
在实际实验中，通常会使用反转录引物和OlIGO（dT）引物的混合物来合成CDNA的第一链。
这是因为许多mRNA分子的5'端没有腺嘌呤残基，所以OLIGO（dT）引物无法与它们互补。
因此，在使用OLIGO（dT）引物无法反转录mRNA分子的情况下，反转录引物可以用于产生CDNA的第一链。
此外，在CDNA合成的过程中，还需要引物包含其他特定序列，以便于在后续实验中对CDNA进行扩增、检测等操作。
例如，引物的末端通常含有限制酶切位点，以便将CDNA放入载体中。
此外，引物还可以带有一组序列标签，如荧光标签或亲和标签，以便实现CDNA的可视化或纯化。
总结起来，合成CDNA第一链所需的引物包括逆转录引物和OLIGO（dT）引物，它们的序列应与目标RNA互补。
合成CDNA的引物设计应考虑目标RNA的特点，并可能包含特定的序列标签或限制酶切位点。
引物的选择及其设计对于成功合成CDNA的第一链至关重要，因此需要进行仔细的序列分析和合成策略的考虑。
第五章_cDNA文库的构建
3’
第二链合成
• 剩下的cDNA单链的3’末端可能形成一个弯回来的 双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条 cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA。
5’
cDNA第一链 DNA聚合酶 cDNA第二链合成 cDNA第一链 cDNA第二链
5’ 3’
• 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA 中有用的序列被切掉）。
•λZapcDNA 载体
• 优点：
1、高的转染效率
2、可在体内用M13辅助噬菌体将其变为真核生物的 质粒表达载体。
• 含有一个真核启动子
•λZapcDNA 载杂交 1、已知氨基酸序列的相关简并密码子探针； 2、纯化蛋白质的相应抗体探针；
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链 核酸酶S1
5’ 3’
cDNA第一链 cDNA第二链
3’ 5’
cDNA 合成
缺点：合成 效率低;〈1% mRNA能合 成cDNA。
• 改进
• RNase H酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，
并将其降解成许多小片断。 • 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎 片断。 • DNA聚合酶I能除去引物并修补后再使用DNA连接酶
基本原理：
• 许多真核生物的转录激活因子都是由两个结构上
可以分开的、功能上相互独立的结构域组成； • 应用重组DNA技术，可以将来自同一个转录因子的、 或者两种不同转录因子的结构域分开，分开的两 种结构域在体内重新组装成具有功能的转录因子，
从而激活UAS（上游激活序列）下游启动子调节的
报告基因的表达。
通常由以下原因造成:
• prey蛋白的非特异性结合；
• 无需与诱饵蛋白结合就能诱导报告基因的转录。
使用快速反转录试剂盒合成第一链cDNA
RT延伸。
注意事项
1. 下列操作步骤适用于模板量为50 ng-2 μg的总RNA，如果总RNA量大于2 μg，请按比例扩 大反应体系。
2. 在冰上进行操作，防止RNA发生降解。 3. 不需分开变性和退火两个步骤。但是对于二级结构很复杂的RNA模板，推荐使用变性步
KR116-0μl 25 μl 50 μl 1 ml
KR116-02 (100 rxn)
200 μl 200 μl 100 μl 200 μl 2×1 ml
KR116-03 (1000 rxn) 10×200 μl 10×200 μl 10×100 μl 10×200 μl 10×2×1 ml
操作步骤
使用快速反转录试剂盒合成第一链cDNA
50 ng-2 μg总RNA可建立20 μl反应体系。
1. 将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×King RT Buffer、 RNase-Free ddH2O在室温（15-25℃）解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液 涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。
以下操作步骤请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性，进行各项反应时，应先配 制成Mix，然后再分装到每个反应管中。
2. 按照表1的基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育 3 min。然后置于冰上放置。
表1 gDNA去除反应体系
组成成分
使用量
5×gDNA Buffer
产品特点
反转录效率高：反转录效率可达95%以上； 操作简单快速：反应体系配制简单，21 min完成cDNA第一链的合成； 通读复杂模板：能够作用于GC含量高，二级结构复杂的RNA模板； 样品普适性高：对不同物种来源及杂质较多的RNA模板的适用性高； 后续兼容性好：后续配合荧光定量检测产品，灵敏度高、稳定性好。
一步法或两步法反转录cDNA文库的PCR实验原理和流程,gi
一步法或两步法反转录cDNA文库的PCR实验原理和流程,gi逆转录PCR逆转录是指以RNA为模板合成与其互补的cDNA的过程。
逆转录PCR是将RNA的逆转录(reverse transcription) 和cDNA的聚合酶链式反应(PCR)相结合的技术，故逆转录称为RT-PCR或反转录PCR。
逆转录PCR实验原理是，提取组织或细胞中的总RNA，以RNA为模板，利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA链为模板进行PCR扩增，从而获得大量拷贝。
逆转录PCR的出现使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。
逆转录PCR应用逆转录PCR的用途广泛，可用于分析基因的转录产物、检测细胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探针、直接克隆特定基因的cDNA序列等。
如在临床上RT-PCR可以用于遗传病诊断、癌症检测、检测病人标本中的RNA病毒，如HAV、HCR、HIV等。
在植物方面RT-PCR常用于研究环境胁迫对植物基因表达的影响，以及在特定的环境或生长阶段中植物体不同部位基因表达的差异性。
使用RT-PCR检测分析RNA 转录产物具有以下突出的优点：理论上可以检测几乎任何基因的转录产物；可以实现极为微量RNA样品（ng级别）的检测；样品耐受性好，未经纯化的粗制生物样品也可以用于检测；模板逆转录PCR的模板是RNA，可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。
无论使用何种RNA，都需确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。
RNA提取可以利用试剂盒从细胞（或组织）中提取得到RNA。
模板RNA的纯度和完整性对于扩增的结果有很大影响，从细胞中分离RNA应注意尽量减少RNA酶的污染（RNA酶分布广泛，除细胞内源性RNA酶外环境中也存在大量RNA酶），在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境：避免RNA酶污染包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂抑制内源性RNA酶。
罗氏第一链cDNA合成试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 中文说明书
反应次数目录号反应次数04 379 012 00150次，包括10次对照反应04 896 866 001100次04 897 030 001200次试剂盒包装与含量小瓶/瓶盖标签适用于a) 04 379 012 001 b) 04 896 866 001 c) 04 897 030 0011红色TranscriptorReverseTranscriptase（逆转录酶）a) 1瓶，25 μl (20 U/μl)b) 1瓶，50 μl (20 U/μl)c) 2瓶，各50 μl (20 U/ μl)储存缓冲液：200 mM 磷酸钾，2 mM 二硫苏糖醇，0.2% Triton X-100(v/v)，50% 甘油(v/v)，pH 约为7.2∙2无色Transcriptor RTReaction Buffer(5×)（逆转录缓冲液）a) 1瓶，1 mlb) 1瓶，1 mlc) 2瓶，各1 ml5×浓度：250 mM Tris/HCl，150 mM KCl，40 mM MgCl2，pH约为8.5(25°C)∙3无色ProtectorRNase Inhibitor（RNase抑制剂）a) 1瓶，50 μl(40 U/μl)b) 1瓶，100 μl(40 U/μl)c) 2瓶，各100 μl(40 U/μl)储存缓冲液：20 mM Hepes-KOH，50 mM KCl，8 mM 二硫苏糖醇，50 % 甘油(v/v)，pH 约为7.6 (4°C)∙4黄色/ 紫色Deoxynuc-leo-tideMix（dNTP）a) 1瓶，100 μl(黄色瓶盖)b) 1瓶，200 μl(紫色瓶盖)c) 2瓶，各200 μl(紫色瓶盖)dATP, dCTP, dGTP, dTTP各10 mM∙5蓝色Anchored-oligo(dT)18Primer（锚定oligo(dT)18引物）a) 1瓶，100 μl(50 μM)b) 1瓶，200 μl(50 μM)c) 2瓶，各200 μl(50 μM)6Random Hexamera) 1瓶，100 μl(600 μM)蓝色Primer（随机引物）b) 1瓶，200 μl(600 μM)c) 2瓶，各200 μl(600 μM)7绿色Control RNA（对照RNA）a) 1瓶，20 μl(50 ng/μl)包含提取于永生细胞系(K562)的总RNA 片段稳定溶液∙8绿色Control Primer Mix PBGD（对照基因引物）a) 1瓶，40 μl5 μM 人类PBGD特异性正向与反向引物∙9(b和c为瓶7)无色Water, PCR-gradea) 1瓶，1 mlb) 2瓶，各1 mlc) 3瓶，各1 ml注意：货号为04 896 866 001和04 897030 001的产品不含有control试剂(瓶7和瓶8)，因此瓶7即为Water, PCR-grade。
基因克隆01 反转录合成第一链cDNA
RNase-free dH2O
0.75 ul（超出10ul体系可不加）
短离心，42℃保温1h，70℃保温15min，冰上急冷3min，-20℃保存，使用时稀释10倍。
三、配制PCR体系共25ul和50ul
ddH2O
18.25 ul 34.6ul
10xPCR Buffer
模版RNA和引物混合液
6ulБайду номын сангаас
5xReverse Transcriptase M-MLV Buffer
2 ul
dNTP Mixture(10mM)
0.5 ul(如是2.5mM则加2ul)
Ribonuclease Inhibitor(40U/UL)
0.25 ul（放在-20℃冰盒）
Reverse Transcriptase M-MLV(Rnase H-)200U/uL
2.5 ul 5ul
dNTP Mixture
2 ul 4ul
上游引物（10uM）
0.5 ul 2ul
下游引物(10uM)
0.5 ul 2ul
cDNA（上述反转录反应液）
1 ul 2ul
rTAQ（5U/ul）
0.25 ul 0.4ul（放在-20℃冰盒）
四、跑PCR：
94℃3min预变性
94℃30S变性
50℃30S退火
72℃1min延伸
72℃10min延伸完整
五、配置琼脂糖凝胶：
量取TBE(0.5x（5x母液）)23ml和琼脂糖（Biowest Agarose）0.23g加入锥形瓶中，在微波炉中加热溶解到澄清透明，冷却到不烫手后加入Goldenview 0.5—1ul，混匀后倒板。
逆转录PCR实验protocol
逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR，rtpcr）实验方法原理提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。
实验材料组织细胞试剂、试剂盒RNA提取试剂dNTP混合物Taq DNA聚合酶第一链cDNA合成试剂盒仪器、耗材离心管离心机水浴锅PCR管电泳仪凝胶图像分析系统移液管移液枪离心管盒实验步骤一、总RNA的提取二、cDNA第一链的合成目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。
现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
1．在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 ug，补充适量的DEPC HO使总2体积达11 ul。
在管中加10 uM Oligo（dT）12-18 1 ul，轻轻混匀、离心；2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；3．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM） 2 ul；下游引物（10 pM） 2 ul；dNTP(2mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul） 1 ul。
轻轻混匀，离心。
42℃孵育2-5 min；4．加入SuperscriptⅡ1 ul ，在42℃水浴中孵育50 min；5．于70℃加热15 min以终止反应；6．将管插入冰中，加入RNase H 1 ul ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。
-20℃保存备用。
三、PCR1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 ul；上游引物（10 pM）2 ul；下游引物（10 pM）2 ul；dNTP(2 mM) 4 ul；10x PCR buffer 5 ul；Taq 酶（2 u/ul）1 ul；O，使总体积达50 ul。
反转录PCR操作方法
RT-PCR反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）又称为逆转录PCR。
其原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo (dt)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。
再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
实验中各步所需的药品如下：1. RNA提取：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、75%乙醇、DEPC水2. cDNA第一链的合成: DEPC 水、引物、10×PCR buffer、 MgCl2、dNTP mix、 0.1M DTT(硫苏糖醇) 、SuperscriptⅡ、 RNase H 13. PCR 扩增：第一链cDNA 、上游引物、下游引物、 dNTP Mix、10×PCR buffer、 Tag 酶、琼脂糖凝胶电泳（TAE试剂、琼脂糖、溴酚蓝或二甲苯、）主要过程：(一)反转录酶的选择1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶H活性相对较弱。
最适作用温度为37℃。
2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。
最适作用温度为42℃。
3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mg2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4．MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。
此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。
（二）合成cDNA引物的选择1．随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。
DNA文库的构建(精)
一般覆盖倍数达到是基因组的 某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合， 一条染色体或更小的区段（如一个YAC或BAC克隆 等）。
例如：将基因组 DNA用多种限制性 内切酶切割， Southern杂交 显示目标基因在 8.3kb的Spel片段上 则可将Spel酶切的 基因组DNA中酶+dCTP
末端转移酶+dGTP
载体和cDNA退火
CH3
CH3
加接头
CH3
接头
CH3
CH3
CH3
cDNA的定向插入
ds-DNA合成 与SalI匹配 接头相连 NotI酶切
载体
1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase
NotI primer/adaptor
SalI adapto反复冻溶基因组DNA与cDNA的比较
1）cDNA所包含的遗传信息要远远少于基因组 DNA但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外 大量调控序所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于 低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，NA,制备合适大小的DNA 片断，或提取组织或器官的mRNA并反转录成 cDNA， （2）DNA片段或cDNA与经特殊处理的载体连接形成 重组DNA， （3）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体 菌， （4）阳性重组菌落或噬DNA探针
从原平板克隆 中分离cDNA
步骤： 1）基因组DNA的酶切、固定 2）基因DNA充分饱和杂交，固 定相应的cDNA, 5) 洗脱cDNA并重新转化受体菌。
限制：由于基因组的复杂性，很难究基因的表 基于复性动力学原理的均一化学法
基因组DNA饱和杂交法
理论基础：不同表达水平的基因对应的基因组拷 贝数相对一高；二是去磷酸化好。
第六课 反转录合成cDNA第一链
共计 注意： • Total RNA的使用量小于2.5ug • Poly(A) RNA的使用量小于0.5ug
2.
在PCR仪上进行下列反应：
① ② 65 ℃ 5min 立即置冰上
实验步骤
3. 在另一无RNase的薄壁PCR管中配置下列混合液
① ② ③ ④ 5X PrimeScript Buffer RNase Inhibitor (40U/ul) PrimeScript RTase (200U/ul) RNase free H2O 共计 2 ul 0. 25 ul 0.5 ul 2.25 ul 5 ul
实验试剂
5X PrimeScript Buffer 3. RNase Inhibitor (40U/ul)
4. 5. 6. 7. 8. dNTP Mixture (10 mM each) Oligo dT Primer (50 uM) Random 6 mers (50 uM) Total RNA RNase free H2O
第六课
反转录合成cDNA第一链
实验目的
1，学习反转录cDNA第一链的原理 2，通过反转录合成目的基因的cDNA第一 链
实验原理
• 反转录酶的特性 ① 具有RNA指导的DNA聚合酶活性，即：以RNA为模板， 脱氧核苷三磷酸为底物，从 5’- 到 3’- 合成 DNA，反应 需要引物 ② 具有DNA指导的DNA聚合酶活性 ③ 有RNase H活性，即降解RNA-DNA杂交分子的单链RNA 的活性 ④ 不具有3’到5’校正功能 • 反转录酶主要有 ① 莫洛尼氏小鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶 ② 鸟类的禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶 ③ 嗜热微生物的耐高温病毒反转录酶 • PrimeScript RTase是TaKaRa公司开发的RNase H-型反转录 酶，具极强的延伸能力，可合成12kb的cDNA第一链，即使 对具有复杂二级结构的RNA，在42℃条件下也能得到良好的 反转录效果。 • cDNA第一链可用于： cDNA第二链的合成，杂交，PCR扩增， Real Time PCR等反应。
全长cDNA文库的构建方法
全长cDNA文库的构建方法全长cDNA文库的构建是基因组学研究中的重要步骤，它能够捕获一个生物体所有的转录本，为基因表达、功能研究和基因组注释提供有用的信息。
下面将介绍一种常用的全长cDNA文库构建方法。
样本准备需要准备含有目标转录本的细胞或组织样本。
这些样本可以是新鲜或冷冻的，只要它们的质量和数量能够满足后续步骤的需求。
对于一些需要特殊处理的样本，如动物组织，需要按照相关法规进行采集和处理。
RNA提取从样本中提取高质量的RNA是构建全长cDNA文库的关键步骤。
常用的RNA提取方法是Trizol法或RNAiso Plus法。
这些方法能够有效地分离出RNA，并且可以去除大部分的蛋白质和基因组DNA。
在提取RNA后，需要对其质量和浓度进行检测，以确保其适用于后续步骤。
反转录将RNA进行反转录，生成cDNA，是构建全长cDNA文库的另一个关键步骤。
常用的反转录方法是 oligo(dT)引物法和随机引物法。
oligo(dT)引物法利用了mRNA特有的poly(A)尾，能够捕获mRNA进行反转录。
随机引物法则利用了引物结合在RNA的任意位置，也能捕获全长的cRNA。
在反转录完成后，需要检测cDNA的浓度和特异性，以确保其适用于后续步骤。
文库构建在得到全长cDNA后，需要将其克隆到载体中，构建成文库。
常用的载体有质粒、噬菌体和BAC等。
这些载体都能够在细菌中进行复制和扩增，使得文库的规模得以扩大。
在构建文库时，需要确保cDNA的插入率和多样性，以避免后续步骤中的误差。
文库质量检测在构建完全长cDNA文库后，需要对其质量进行检测。
随着生物技术的不断发展，基因组学和蛋白质组学研究取得了突破性进展。
在此基础上，研究者们开始mRNA转录本的全长序列，即cDNA。
cDNA文库的构建对于基因表达、功能研究和比较基因组学等领域具有重要意义。
本文将探讨全长cDNA文库的构建方法及其应用研究。
全长cDNA文库构建的关键问题包括如何获取全长的、完整的mRNA转录本，以及如何将这些转录本有效克隆到表达载体中。
反转录的实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习反转录技术的原理和操作方法；2. 掌握从RNA模板合成cDNA的第一链的方法；3. 熟悉反转录试剂盒的使用。
二、实验原理反转录（Reverse Transcription）是指将RNA模板逆转录成cDNA的过程。
反转录酶是一种RNA指导的DNA聚合酶，可以在RNA模板的指导下合成cDNA。
反转录技术在分子生物学研究中具有重要作用，如基因克隆、基因表达分析等。
三、实验材料1. 实验试剂：反转录试剂盒、RNA提取试剂、DEPC水、引物、dNTPs、RNase抑制剂等；2. 实验仪器：离心机、PCR仪、恒温水浴锅、电泳仪、凝胶成像系统等；3. 实验样本：含有目的RNA的细胞或组织。
四、实验步骤1. RNA提取：按照RNA提取试剂说明书操作，提取细胞或组织中的RNA；2. RNA浓度测定：使用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度；3. 反转录反应：按照反转录试剂盒说明书进行操作，将提取的RNA作为模板，在特定条件下合成cDNA第一链；4. cDNA纯化：使用柱式或磁珠纯化cDNA，去除未反应的RNA、dNTPs、RNase抑制剂等杂质；5. PCR扩增：将纯化的cDNA作为模板，进行PCR扩增，验证反转录结果；6. 电泳检测：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察扩增结果。
五、实验结果与分析1. RNA提取：成功提取出目的RNA，A260/A280比值在1.8-2.2之间，表明RNA纯度较高；2. cDNA合成：反转录反应完成后，在特定条件下进行PCR扩增，成功扩增出目标片段；3. 电泳检测：PCR产物在琼脂糖凝胶上呈现清晰的条带，表明反转录和PCR反应均顺利进行。
六、实验结论1. 成功从RNA模板合成cDNA的第一链，为后续的基因克隆、基因表达分析等研究提供了基础；2. 反转录技术操作简便，结果可靠，适用于分子生物学研究。
七、实验注意事项1. 实验操作过程中应避免RNA降解，使用DEPC水处理实验器材和试剂；2. 操作过程中应严格按照试剂说明书进行，避免人为误差；3. 实验结果可能受到RNA质量、反转录酶活性、引物设计等因素的影响，需进行多次实验验证。
cDNA文库的构建
cDNA文库的构建BIOX. 时间：2006-9-10 来源：生命经纬分为六个阶段：阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链阶段2：cDNA第二链的合成阶段3：cDNA的甲基化阶段4：接头或衔接子的连接阶段5：Sepharose CL-4B凝胶过滤法分离cDNA阶段6：cDNA与λ噬菌体臂的连接[阶段1：反转录酶催化合成cDNA第一链]1．在置于冰上的无菌微量离心管混合下列试剂进行cDNA第一链的合成：poly(A)+RNA (1μg/μl) 10μl寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl1mol/L KCl 3.5μl2μl250 mmol/L MgCl2dNTP溶液（含4种dNTP，每种5mmol/L）10μl0.1 mol/L DTT 2μlRNase抑制剂（选用）25单位O至48μl加H22．当所有反应组在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管。
在这个小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）。
3．大规模和小规模反应管都在37℃温育1h。
4．温育接近结束时，在含有同位素的小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后将反应管转移到冰上。
大规模反应管则在70℃温育10 min，然后转移至冰上。
5．参考《分子克隆实验指南》第三版附录8所述方法，测定0.5μl小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸（TCA）沉淀的放射性活度。
此外，用合适的DNA 分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对小规模反应产物进行分析是值得的。
6．按下述方法计算cDNA第一链的合成量（推算方法略）：[掺入的活度值(cpm)/总活度值]×66(μg)=合成的cDNA第一链(μg) 7．尽可能快地进行cDNA合成的下一步骤。
[阶段2：cDNA第二链的合成]1．将下列试剂直接加入大规模第一链反应混合物中：10 mmol/L MgCl270μl2 mol/L Tris-HCl (pH7.4) 5μl10 mCi/ml[α-32P] dCTP（400 Ci/mmol）10μl1 mol/L (NH4)2SO41.5μlRNase H (1000单位/ml) 1μl大肠杆菌DNA聚合酶I (10 000单位/ml) 4.5μl温和振荡将上述试剂混合，在微量离心机稍离心，以除去所有气泡。
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cDNA合成
一. 普通cDNA合成
普通cDNA第一链合成使用Fast Quant RT Kit(TIANGEN)，具体如下：
1. Microtube 管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量
2.5 μl；
2. PCR仪中42℃保温3 分钟后迅速在4度急冷2 分钟以上；
3. 在上述Microtube 管中配制下列反转录反应液Mix2.5ul；
4将反转录中反应中的Mix,加到gDNA 去除步骤的反应中，充分混匀，总体系5ul。
5.42℃孵育15Min。
6.95度孵育3min后放于冰上或4度，得到的cDNA可用于后续实验
二. microRNA cDNA第一链合成
按照天根miRNA第一链合成试剂盒（KR211）进行操作，具体如下：
（a）miRNA 3' 末端进行加Poly (A)处理
1. 在冰上预冷RNase Free 的反应管内加入以下试剂至总体积5 μl (最后加入
E.coli Poly(A) Polymerase)
*在反应中使用的Total RNA 必须含有小分子RNA.
此过程也可以使用小分子RNA（建议加入量为1-2 µl。
请根据目的miRNA 丰度决定加入量）。
2. 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在PCR仪中42℃反应60 min,95度3min，4度急速降温。
所得的反应液可以直接进行下游实验，也可以放置-20℃短暂保存。