细胞悬浮培养在口蹄疫疫苗中的研究进展
口蹄疫灭活疫苗质量控制和检测技术的研究进展
准级 的厂房 内， 要在 Ｑ Ａ系统的框架 内， 按照规 定 的制苗 规程来 进 行 ，必 须达 到可 以防止 任何 来 自生 产工 厂的 病毒 逃逸的 生物 安全级 别。ＧＭＰ生产车 间 内应 严格 密 闭，在与 外界相 通处 要安
装 双 ＨＥ Ａ 过滤 器来 过 滤 所 有 的 空 气 ， Ｐ
多 生 物 源 性 的 材 料 ，例 血 清 、 蛋 白 胨
和 动物 源性水 解 乳蛋 白等 ，所 以必 须
要 求 这 些 产 品 的 供 货 商 提 供 疫 病 检 验
强疫 苗的 质量控 制和相 应 的检测技 术 的研 究直 接关 系到 口蹄疫疫 病防控 的
成败 。
报告。例欧盟 的 １ ９／１４ Ｅ ９ ９ ０ ／ Ｃ官方指 技 术是 关键 因素 ，必须按 照 Ｇ ＭＰ规 范 令 明确要求 检测这 些原 料产 品 中是 否
一
，
量 直接影 响到 终产 品的 好坏 ，所以 应 严 格加 以控制 。理 想的种 毒应 该具 备 以下特性 ：在细胞培养物 上容易生长 、
内的无 菌状态 ，调节 好细 胞生 长的 各
种 最佳 生长 条件 是更加 重要 的。 由于 口蹄疫 病毒 不耐 酸 、碱 和不 耐热 ，所
以 对 ｐ 值和 温 度 的控 制 是 关 键 。 Ｈ 此外 ，
解酶很敏感 ，在生产 中必须加 以重视 。 当前 ， 口蹄 疫 的双价 苗 生 产技 术 已经成 熟 ，并 用于 大 批量 的生 产 。对 于 其 质量控 制最 关键 的部 分在 于必 须
维普资讯
口 蹄 疫 灭 活 疫 苗 质 量 控 有＝ ＝ Ｉ 和 检 测 技 术声 研 究 进 展
张怀 宇 ’ ，王泰健 。赵启祖 ’
悬浮培养生产口蹄疫病毒灭活工艺研究
悬 浮培养 生产 口蹄疫 病毒 灭 活安全 性 及灭 活 效 果 ，
同时研究 摸索 了新 的灭活 工艺 。
１ 材 料
工艺 是近 年来 我 公 司在 国内 率先 研 发 和 成 功 应 用 的全 新技 术体 系 。细胞 经 悬 浮培 养 、 毒 收 获 ， 接 获
悬 浮灭 活疫苗 生 产 过 程 中的灭 活工 艺 而 言 是 一 种 挑 战 一］ 。本 实 验 考 察 和 验 证 了现行 灭 活 工 艺 对
为关 键 的环 节之 一 ， 灭 活 工 艺 的科 学 、 理 直 接 其 合 影 响到产 品安 全 性 和效 价 ＿ ２。 口蹄 疫 病 毒 灭 活 １１ － 方法 很多 ， 目前 国内外 普 遍 采用 的是 将 ２一溴 乙 而 胺氢溴 酸盐 （ ２一ｂｏ ｅｈｌ ｒｍｏｔｙ ａ—ｍｉｅｙ ｒｂｏ ｉｅ ｎｈ ｄｏ ｒｍ ｄ ， Ｂ Ａ） Ｅ 经环化 制成 二 乙烯 亚胺 （ Ｅ ） Ｂ Ｉ 后加 人 口蹄 疫 病毒 液 内进 行 灭 活 。 。但 不 同产 品 、 同 厂 家 不
２ ２ ３ 二 乙烯 亚胺 一甲醛 （ Ｅ —Ｆ 联 合 灭 活 ．． Ｂ Ｉ Ａ）
当病毒 液 温 度 升 至 （０±１ ℃ 时 ， 别 按 ０ ０ ％ 、 ３ ） 分 ．６ １ 比例加 入 甲醛 溶 液及 ０ ２ｍｏ ＬＢ Ｉ使 其 Ｂ Ｉ ％ ． ｌ Ｅ ， ／ Ｅ 终 浓度 为 ２ ｍ ｏ Ｌ ｍ ｔ 。混 匀 并 倒 瓶 后 待 温 度 升 至 ／
口蹄疫 病 毒 灭 活 是 口蹄 疫 灭 活 疫 苗 生 产 中最
得 的 口蹄疫 病 毒 液 不 仅 含有 高浓 度 的 口蹄 疫 完 整 病毒 颗粒 （４ Ｓ ， 时也 含 有 大量 细 胞碎 片 、 １６ ） 同 口蹄 疫病 毒非 结构蛋 白等 非抗 原性 蛋 白物 质 ， 口蹄 疫 对
口蹄疫疫苗研究进展
口蹄疫疫苗研究进展口蹄疫疫苗的研究进展【综述】【摘要】口蹄疫是被列为A类疫病的家畜传染病之一，接种疫苗是防止该病流行的有效措施。
本文就口蹄疫灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗、转基因植物可饲疫苗、合成肽疫苗、蛋白质载体疫苗、基因工程弱毒疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗及空病毒衣壳蛋白疫苗的最新研究进展作一综述。
【关键词】 I=1蹄疫；疫苗Progress in Research on Foot--and．-M outh Disease VaccineCHEN Li—xin，JIN Yu—zhu，HU Rong—liang(Department of印idemiology，Institute of Military Veterinary Medicine，Academy ofMilitary Medicine，Changchun 130062，China)【Abstract】 Foot．and．mouth disease is one of the infectious disease class A in animals．Vaccination is an effective measure forprevention of epidemic of the disease． This paper reviewed the development in research on inactivated vaccine，recombinant subunitvaccine，edible transgenic plant vaccine，synthetic peptide vaccine，protein vector-based vaccine，recombinant attenuated vaccine，livevector-based vaccine，DNA vaccine and empty capsid protein vaccine against foot—and-mouth disease．【Key words】 Foot—and—mouth disease；Vaccine口蹄疫(Foot．and—mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot．and．mouth disease virus，FMDV)引起的偶蹄动物烈性接触性传染病，主要危害牛、羊、猪等，发病率极高，传播速度极快。
悬浮培养生产口蹄疫病毒灭活工艺研究
当病毒液温 度升 至（ ±ｌ℃时 按 ２％ 的 比例 加 入 已 环 化 ２ ６ ｆ １
，
ｌ材料
１ ． １病毒液
好的 ． ｏＬ Ｅ，其ＢＩ浓度为 Ｍ 混匀并 ０ １ Ｉ ２ ／Ｂ 使 Ｅ终 ｍ ４ 。 ｍ 倒瓶后 待温度
升至（ ±１ｏ时开始计时 ， ２ ６ ）Ｃ 灭活２ ｈ ８。
通过生物反应器悬浮培养生产的猪 口蹄疫Ｏ Ｋ９ 毒株 细 ２ ． Ｂ 卜一Ａ 型Ｚ ／３ ．３ Ｅ Ｆ 联合灭活 ２ 胞毒液ｊ 批 ， ＝ 批号分别为 ： １０ ９ Ｍ １ ０ １Ｍ １０ ５ 由 口蹄 三 Ｍ０ ４ ０ 、 Ｏ ４ １ 、 ０ ４ １ ， 疫车间接毒班生产提供 。 １ ＿ ２灭活剂 胺氢溴酸盐（Ｅ １ Ｂ Ａ后置于３ 水浴进行环化 ， ０ ｎ ７ 每１ 摇匀一次 ， ｍｉ 作用后即可获得０ ｍｏＩ ． Ｙ ２ ￣
．．
７． ４ ．
阅 考 学 憾占 外技一 禽
乔亮明 ， 董永明， 熊德 晶 （ 金宇保灵生物药品有限公 司， 内蒙古 呼和浩特 ０ ０ ３） １０ ０
摘 要 ： 采用单 独使 用Ｂ Ｉ 活剂３） Ｅ灭 （ ℃灭 活、 单独使 用Ｂ Ｉ Ｅ％活剂２ ℃ 灭活及Ｂ ＩＦ 联合 灭活等 三种方 法对猪 口 疫０型Ｚ ／３ ＇ ６ Ｅ— Ａ 蹄 Ｋ ９
２４ 灭 活后 检 验 ． ２ １１６ 抗 原含 量 测 定 ４． ４ Ｓ
以０ Ｎ ￣０ ． （［． ２ １ ８％浓度）ａ Ｈ为溶剂 ， ＮＯ 按４％浓度） Ａ２ 溴乙 ２ 灭活 阻断 ￣ 一 Ｕ ． ３
烯亚胺（ｉ） Ｂ 灭活剂 。 ｎ 过滤除菌后备 溶液进行终止灭活， 使其Ｎ ２ ２ ３ ａＳ ０ 终浓度为２％。
Ｖ蹄疫病毒灭活是 口蹄疫灭活疫苗生产 中最为关键的环节 １
1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒技术
1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒技术一、技术背景国内口蹄疫布控形势仍严峻，高效、安全的病毒性疫苗是防止口蹄疫情发生的最有效方法。
BHK21细胞是繁殖FMDV的理想宿主，国外普遍采用了2000－5000L 反应器悬浮培养BHK21细胞技术生产口蹄疫苗。
目前国内主要通过大规模转瓶培养BHK21细胞生产口蹄疫苗，仅一家单位已采用上千升反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗。
转瓶培养BHK21细胞生产口蹄疫苗工艺，因为每个转瓶均是独立的细胞培养单元，每瓶的细胞质量、病毒产量和滴度都不同，导致疫苗批间差大，隐性污染引起高内毒素，副反应大等缺点。
反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫苗工艺，不仅能提高BHK21细胞密度，自动监控细胞生长或病毒繁殖时的最适生化条件，提高病毒滴度，而且工艺规模放大相对容易，管道化操作最大可能避免了污染的发生，能显著提高口蹄疫疫苗的质量。
MMBS已成功开发了BHK21反应器悬浮培养基、120L-650L-1200L反应器悬浮BHK21细胞技术、1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗工艺等关键技术，为反应器生产口蹄疫疫苗的产业化奠定了扎实的技术基础。
二、工艺技术1200L反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺：利用BHK21悬浮培养基从液氮中复苏已适应悬浮培养的BHK21细胞株，种子细胞经摇瓶、5L反应器、120L反应器和650L反应器等逐级放大培养，最后在1200L反应器中悬浮培养BHK21细胞至合适密度，接种口蹄疫病毒种毒，维持一定的溶氧、pH值、温度等工艺参数，适时收获一次性收获培养液,制备成苗。
图1表示了反应器悬浮培养BHK21细胞的照片，细胞密度可以达到3×106cells/ml左右以上。
图2表示了悬浮培养的BHK21细胞接种口蹄疫病毒14hr 后的BHK21细胞。
从反应器中收获上清的口蹄疫病毒抗原量（146S完整病毒粒子）高于转瓶培养工艺。
细胞连续流悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用研究
细胞连续流悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用研究发布时间：2021-12-22T02:27:28.372Z 来源：《中国科技人才》2021年第26期作者：辛俊宝[导读] 将用于口蹄疫疫苗生产的细胞批式悬浮培养技术进一步改进为连续流悬浮培养方式，可缩短细胞培养时间，提高病毒粒子有效含量，提高生产效率，所生产的口蹄疫疫苗质量都很稳定。
杨凌金海生物技术有限公司陕西杨凌 712100摘要：将用于口蹄疫疫苗生产的细胞批式悬浮培养技术进一步改进为连续流悬浮培养方式，可缩短细胞培养时间，提高病毒粒子有效含量，提高生产效率，所生产的口蹄疫疫苗质量都很稳定。
关键词：口蹄疫灭活疫苗；连续流细胞悬浮培养；质量稳定口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是一种高传染性的病毒性疾病，主要感染偶蹄动物。
口蹄疫传染性强，畜群一旦感染，发病率有的高达100%，可造成巨额经济损失和社会政治负面影响，国际动物卫生组织（OIE）将该病列在法定上报的动物传染病之首，中国政府也将其排在一类动物传染病的首位。
对于口蹄疫的防控，绝大多数地区、国家仍采取以免疫灭活疫苗为主的防控措施，我国也是主要采取这一方式防控口蹄疫。
口蹄疫灭活疫苗是一种以细胞培养技术为载体制备口蹄疫病毒液，并将病毒液彻底灭活，获得口蹄疫抗原，抗原与适宜佐剂进行配制最终形成疫苗。
因此，制备口蹄疫病毒液的细胞及细胞培养技术是疫苗制备过程中的关键技术，该技术的先进与否直接关系到疫苗的质量，包括疫苗的安全性、有效性、稳定性等质量指标和生产效率。
传统细胞悬浮培养技术一般采用批式培养，即一个批次的细胞培养完毕后用于接种口蹄疫病毒，制成抗原后再重新培养一个批次，每个批次的培养时间一般在72h或更长时间，疫苗的生产效率低，培养的病毒液有效含量低。
本文研究的目的是对传统悬浮培养工艺进行改进，成为连续流加的培养方式，可使培养时间缩短至不足24h，而且能保证细胞各项质量指标不受影响，这样大大提高了生产效率。
细胞悬浮培养技术在兽用疫苗领域的应用
细胞悬浮培养技术在兽用疫苗领域的应用发布时间：2021-07-06T03:05:52.323Z 来源：《中国科技人才》2021年第10期作者：刘艳昭刘洋谭源[导读] 对悬浮细胞进行分析，不同条件下生长的细胞的驯化可能不同于对病毒的敏感性，不同的克隆菌株对同一病毒表现出不同的敏感性。
因此，如何使用细胞系统大规模生产疫苗，必须有一个可繁殖病毒的适应性选择，适用于悬浮作物的特点有：高生物稳定性、耐腐蚀性强，产品生产周期短，产品表现效率高，满足大规模生产需求等。
哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨 150069摘要：目前，生物反应堆的悬浮液技术已广泛用于海外动物疫苗的生产。
由于我国细胞悬浮技术起步晚，与其他国家的差距仍然存在，但是也取得了令人鼓舞的进展。
此外，对生物技术反应堆中的悬浮液技术进行深入研究，加强和发展悬浮细胞培养技术，有助于进一步完善与细胞悬浮液有关的生产。
关键词：动物细胞；悬浮培养；兽用疫苗动物细胞培养始于20世纪初，以青蛙凝固的淋巴细胞被冻结作为基础，在无菌条件下，试验管成功地发展了青蛙的胚胎神经组织，并观察了细胞生长过程。
随着细胞培养技术的发展，悬浮液培养技术被用于大规模发展疫苗，并广泛用于生产。
悬浮培养法是一种技术，在生物技术反应堆中有效培育动物细胞，用于生物产品生产。
细胞悬浮液培养由于其生产效率高、质量控制简便，被广泛用于研究和开发体外生长的细胞，更重要的是将细胞培养技术应用于生产动物疫苗。
一、悬浮培养技术的核心要素对悬浮细胞进行分析，不同条件下生长的细胞的驯化可能不同于对病毒的敏感性，不同的克隆菌株对同一病毒表现出不同的敏感性。
因此，如何使用细胞系统大规模生产疫苗，必须有一个可繁殖病毒的适应性选择，适用于悬浮作物的特点有：高生物稳定性、耐腐蚀性强，产品生产周期短，产品表现效率高，满足大规模生产需求等。
1、细胞培养的选择。
在细胞悬浮过程中，选择营养介质也是一个重要的环节。
一般来说，血清是动物细胞生长所需的营养素之一，然而，由于血清的复杂性和各批血清的不均匀性，生产受到了阻碍。
悬浮培养口蹄疫病毒灭活工艺的生产规模扩展与产能提升
悬浮培养口蹄疫病毒灭活工艺的生产规模扩展与产能提升
冯泽泰;蒲小峰;梁军;张满义;齐晓;张志刚
【期刊名称】《现代畜牧科技》
【年(卷),期】2024()3
【摘要】随着口蹄疫对全球畜牧业的不断威胁,悬浮培养口蹄疫病毒灭活工艺的研究与发展愈发成为关注的焦点。
该文旨在系统性地探讨该工艺在生产规模扩展与产能提升方面的关键问题,以满足不断增长的口蹄疫疫苗需求。
深入分析原材料供应链、设备与工艺流程的优化以及质量控制等关键因素,重点关注新型悬浮培养技术、先进的灭活工艺和自动化生产等前沿技术的应用。
安全与法规合规被特别强调,以
确保疫苗生产的可靠性和安全性。
在经济层面,进行生产成本与经济效益的全面评估,为决策者提供科学依据。
最后,对当前面临的技术与市场挑战进行深刻分析,并提出未来发展的战略建议,旨在推动悬浮培养口蹄疫病毒灭活工艺的可持续发展,为口
蹄疫防控提供更为有效的工具和战略支持。
【总页数】3页(P116-118)
【作者】冯泽泰;蒲小峰;梁军;张满义;齐晓;张志刚
【作者单位】新疆方牧生物科技有限公司;动物生物医药兵团重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
【相关文献】
1.悬浮培养生产口蹄疫病毒灭活工艺研究
2.悬浮培养生产口蹄疫病毒灭活工艺研究
3.GEM技术浓缩纯化O型口蹄疫病毒灭活抗原方法的建立
4.灭活的羊口疮病毒抑制口蹄疫病毒在BHK-21细胞中的复制
5.BHK-21悬浮细胞培养条件筛选及口蹄疫病毒悬浮培养工艺研究
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
细胞悬浮培养研究进展
细胞悬浮培养研究进展「摘要」：细胞在培养液中呈悬浮状态生长与增殖的培养技术。
是一种通过振荡或转动装置使细胞始终处于分散悬浮于培养液内的培养方法。
非贴壁依赖性细胞的一种培养方式。
「关键词」：植物细胞的悬浮培养愈伤组织动物细胞悬浮培养展望「引言」：植物培养细胞中含有各种特殊的代谢产物，如生物碱、色素、甾体、萜等药用成分及香精等, 有的含量很高。
因此，利用植物细胞培养技术生产药物已成为当代生物技术的一个重要领域，特别是培养药用植物细胞直接生产天然药物的研究已成热点。
动物细胞培养在生物技术和生物医药研究中已得到了广泛的应用，通常动物细胞培养为病毒疫苗的生产提供培养基质同时也是多种生物药品生产不可缺少的工具包括单克隆抗体和基因治疗产品等。
（一）植物细胞悬浮培养植物细胞能合成许多具有重要价值的次级代谢产物,它们可作为农药、杀虫剂、调味剂及香精等。
这些产物传统上是从天然植物中直接提取,但天然植物生长周期较长,而且生长还受地域和环境因素的限制,所以采用直接提取具有较大的局限性。
化学合成法已用于多种产品的生产,但是有些物质不能通过化学法合成,或虽能合成,却比较困难。
植物细胞培养可大规模生产代谢产物,现已成为生产某些高价值产品的重要途径。
一般情况下,培养细胞中的次级代谢物含量明显高于原来植物细胞中的含量,而且这种方法还能避免地域和环境的影响。
19 0 2年,Haberlandt在营养液中成功地培育了单个植物细胞,尽管未能使其分裂生长但为植物细胞培养翻开了新的一页。
此后,许多科学家在植物细胞培养方面进行了研究,特别是近二十年里,植物细胞培养取得了飞速发展,悬浮培养日益完善,固定化培养逐步显示其优势,膜培养技术也已崭露头角。
以下介绍有关植物和动物细胞的悬浮培养情况。
1.悬浮培养特点植物细胞培养与微生物有许多相似的地方,但两者又存在着明显的不同,如植物细胞对剪切力敏感,培养要求小通气量,还需要C仇和光照等条件。
1.1对剪切力敏感:植物细胞的个体大,细胞壁僵脆且具有大的液泡,这些特性决定了其对剪切十分敏感。
口蹄疫疫苗研究的进展
口蹄疫（Foot-and-mouth dis-ease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，以传播迅速、感染率高为其特点。
世界各国对本病的研究极为重视，世界动物卫生组织（Of-fice International Des Epizooties，OIE）将其列为A类传染病之首。
长期以来，FMD疫苗接种作为特异性免疫预防本病的有效手段之一，并在防治中被广泛应用，收到了显著的效果。
随着现代分子生物学技术的发展，FMD疫苗的研制不断深入，已从传统疫苗向新型疫苗方向发展。
1灭活疫苗1930年Frenkel H S等[1]首次成功地实现了FMDV的体外培养，满足了疫苗的规模化生产，并实现了对病毒量化研究。
1931年4月在柏林微生物学会首次召开了专题学术会议，确定了FMD疫苗研究的方向。
1962年英国的Mowat和Chapman等开始用乳仓鼠肾传代细胞(BHK-21)培养FMDV，生产灭活疫苗并迅速商业化。
目前应用的灭活剂，主要有乙酰乙烯亚胺(N-acetylethylenimine，AEI)，灭活曲线为线性。
主要作用于核酸，蛋白抗原性保持较好，但毒性较大。
后来改用二乙烯亚胺(Binary ethyleneimine，BEI)，其毒性较小，被广泛应用[2-5]。
FMD疫苗的免疫佐剂有氢氧化铝胶、司班、轻型矿物油。
由于疫苗佐剂的不断地更新，已由最初的水佐剂发展成现在的油佐剂，其他一些佐剂也相继问世并取得了一定的效果[6-8]。
尽管FMD灭活疫苗在FMD预防和控制上发挥了重要作用，但是灭活疫苗本身也存在许多安全隐患，国外学者先后用分子生物学方法证明欧洲暴发的FMD是因使用了灭活不彻底的抗原制备的疫苗所引起。
2活疫苗常规FMD活疫苗，是把原始强毒用生物学方法在生物媒介（如乳鼠、乳兔、鸡胚、细胞等）进行连续传代驯化。
口蹄疫悬浮细胞最佳培养条件的研究
2020年第12期近几年，随着口蹄疫疫苗生产工艺的技术升级，已从转瓶生产工艺全面转型升级为悬浮培养工艺，但悬浮培养工艺所生产的口蹄疫病毒146s 水平则取决于一个良好的生产工艺，其中细胞培养的温度、pH 、溶氧是最基本、也是最重要的条件。
本试验通过改变悬浮细胞培养的温度、pH 、溶氧三个条件，旨在探索口蹄疫悬浮细胞的最佳培养条件。
1材料与方法BHK21悬浮细胞（中牧股份兰州生物药厂提供）、细胞培养基（天信和生物科技有限公司提供）、口蹄疫O 型种毒（兰州生物药厂质检研发处提供）、2%NaOH （自制）。
2~3日龄乳鼠（兰州生物药厂四车间提供）。
7.5L 生物反应器、倒置显微镜、超速冷冻离心机、高效液相色谱仪、全自动密度梯度制备仪。
1.4.1使用7.5L 反应器培养BHK21悬浮细胞，温度分别设定为35.5℃、36.0℃、36.5℃、37.0℃、37.5℃，pH 设定为7.2，溶氧设定为50%，待细胞密度达到4.0×106cells/mL 、细胞活率在90%以上时，用2%NaOH 调细胞pH 至7.6~7.8。
分别将口蹄疫O 型种毒按细胞体积的3%接毒，观察细胞病变情况并记录数据，待细胞病变达90%后收获。
1.4.2使用7.5L 反应器培养BHK21悬浮细胞，pH 分别设定为6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4，温度设定为37.0℃，溶氧设定为50%，待细胞密度达到4.0×106cells/mL 、细胞活率在90%以上时，用2%NaOH 调细胞pH 至7.6~7.8。
分别将口蹄疫O 型种毒按细胞体积的3%接毒，观察细胞病变情况并记录数据，待细胞病变达90%后收获。
1.4.3使用7.5L 反应器培养BHK21悬浮细胞，溶氧分别设定为20%、30%、40%、50%、60%、70%，pH 设定为7.2，温度设定为37.0℃，待细胞密度达到4.0×106cells/mL 、细胞活率在90%以上时，用2%NaOH 调细胞pH 至7.6~7.8。
悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗现状及其关键技术
项目技术资料
1. 650L/4000L 反应器悬浮培养BHK21 细胞生产口蹄疫病毒总结报告 2. 650L /4000L 反应器悬浮培养BHK21 细胞生产口蹄疫病毒工艺规程 3. 5/10L 反应器悬浮培养BHK21 细胞操作规程 4. 120L 反应器悬浮培养BHK21 细胞操作规程 5. 650L /4000L反应器悬浮培养BHK21 细胞操作规程 6. 650L/4000L 反应器悬浮培养BHK21 细胞生产口蹄疫病毒操作规程 7. 650L /4000L 反应器悬浮培养BHK21 细胞生产口蹄疫病毒技术要点 8. 各级反应器细胞培养记录 9. 650L/4000L 反应器口蹄疫病毒培养记录
三、无血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫交钥 匙工程
工艺技术转让 验证和培训 指导客户生 产
反应器悬浮 生产线建设
生产线建设与工艺过程
生产线建设与工艺过程
生产线的布
局、建设主 要取决于产
品生产的工
艺模式和规
模
项目流程
业务接洽 了 解 需求 和 项目可行性
•项目目标 •反应器培养规模 •预期产业化规模 •反应器培养基础 及配套条件 •建立细胞库和病 毒库 •病毒检测的条件 和经验 ……
能源 成本
原料成本 原料种类少，配制差错率低，更容易 集中配制； 反应器无血清悬浮培养，不仅成本低
反应器无血清悬浮培养 培养基等2种
而且对抗原后期纯化难度下降，并且极
大地减弱了产品的不良反应；
原料种类
反应器低血清悬浮 培养 4种 转瓶培养 培养基、血清、水解 乳蛋白等10余种
据统计，反应器低血清悬浮产1000L 培养基、血清等约 病毒原液的成本仅为转瓶培养方式相同 产量的50%。
口蹄疫疫苗研究进展
口蹄疫疫苗研究进展摘要对口蹄疫疫苗的研制历史和不同疫苗的特性进行了综述，以期为疫苗的合理应用提供技术帮助。
关键词口蹄疫；疫苗；研究进展口蹄疫是由口蹄疫病毒（FMDV）所引起的偶蹄家畜的急性传染病，羊、猪和牛都可患此病，有时还可以传染给人，其特征是在口腔黏膜和鼻、蹄、乳头等部位皮肤形成水泡和烂斑。
本病传播迅速，危害性强，被世界动物卫生组织（OIE）列为国际动物贸易间必须检疫的A类动物传染病，我国农业部也将其划定为一类动物传染病，本病也是最具政治经济色彩的烈性动物疫病。
因此，各国都在致力于控制和消灭口蹄疫的工作，而对大多数国家来说，疫苗免疫是防控本病的关键措施。
口蹄疫疫苗的研制最早由Belin（1927）在20世纪初期提出，到20世纪40年代达到了广泛研究的程度。
第一个应用的灭活疫苗是Waldmann等（1937）用人工感染的牛舌上皮和水泡液中的病毒制得，应用牛舌上皮细胞需要收集足够的细胞材料，并且整个收集过程要求保持无菌，这促进了对适宜细胞系的研究。
1947～1954年Frenkel在牛舌上皮细胞增殖FMD获得成功，方法简单，价格低廉。
1965年Telling和Elsworth开始用发酵罐大量生产悬浮细胞，现在几乎所有的FMD疫苗都以这种方法生产。
口蹄疫疫苗的灭活最初使用甲醛，但研究证明该方法有活病毒残留，而且甲醛灭活FMDV后，有效免疫抗原146S病毒粒子损失较大。
1959年Brown和Crick首先用乙酰乙烯亚胺（AEI）灭活病毒制造疫苗[1]，1975年Bahnemann首创了口蹄疫的二乙烯亚胺（BEl）灭活苗[2]，现今广泛应用的灭活剂主要还是以乙酰乙烯亚胺（AEI）、二乙烯亚胺（BEl）和β－丙内脂为基础。
目前应用于商品疫苗大规模生产FMD病毒抗原的技术有3种：①牛舌上皮组织生产的Frenkel培养法；②在转瓶单层BHK-21传代细胞上生产的单层培养法；③在发酵罐中BHK-21传代细胞上生产的悬浮培养法。
猪口蹄疫疫苗生产和检验存在问题及发展趋势
猪口蹄疫疫苗生产和检验存在问题及发展趋势国内现有的口蹄疫疫苗生产企业虽然完成了GMP改造，实行了GMP管理制度，但根据日常监管及飞行检查中发现，仍然存在许多管理不规范的问题，这些因素皆可能影响口蹄疫疫苗的质量。
另外根据国外发达国家的生物制品生产技术，国内的口蹄疫疫苗生产企业，在口蹄疫疫苗生产工艺和检验技术方面，还存在以下问题。
一、口蹄疫疫苗生产工艺落后对于口蹄疫灭活疫苗生产，国外大部分疫苗生产企业已不采用转瓶生产技术，改用大规模悬浮培养技术，目前国内企业的转瓶培养技术由于生产规模过大，每个班组每天接种转瓶数达到千余瓶，很难保证零污染，过多的转瓶根本做不到逐瓶进行无菌检验，仅靠肉眼观察，根据培养液颜色变化排除污染转瓶，很难做到万无一失，只要有一瓶污染培养物混入抗原液中，就可能因内毒素引起疫苗的副反应。
因此要从根本上解决疫苗质量问题，必须改转瓶培养为悬浮培养，悬浮培养技术不仅可保证生物安全，也可提高疫苗的均一性，结合现有的疫苗抗原浓缩纯化技术，生产出高度纯化的高效疫苗，是提高现有疫苗质量，降低疫苗副反应的根本措施。
二、口蹄疫疫苗检验技术有待提高现有的疫苗质量标准中规定效力检验必须采用本动物进行检验，由于国家实行100%的强化免疫政策，很难选出易感的检验用动物，采用血清中和试验选择易感动物，在技术上难以排除具有细胞免疫的非易感动物，在检验实际中经常发生检验数据不规律的问题，影响检验的准确性。
因此必须尽快研制体外检验技术，代替现有的本动物试验。
在这方面农业部已组织了多次试验，但到目前为止尚未取得理想的替代方法。
三、口蹄疫疫苗生产用毒种免疫谱和免疫原性不理想，应及时更换目前的疫苗生产用毒种除亚洲I型已统一更换为江苏毒株以外，O型毒株有3株，其中有的毒株年代较久，免疫原性并不理想，应及时更换免疫谱更广、免疫原性更好的毒株用于生产和检验。
四、口蹄疫疫苗佐剂依赖进口，国产佐剂难以达到安全要求目前各企业采用的疫苗佐剂除常规的矿物油佐剂外，主要为进口的206佐剂，该佐剂易于乳化、粘度小、免疫副反应小，是口蹄疫疫苗的主要佐剂，但由于其价格昂贵，使疫苗生产成本偏高。
口蹄疫悬浮细胞最佳培养条件的研究
2020年第12期近几年,随着口蹄疫疫苗生产工艺的技术升级,已从转瓶生产工艺全面转型升级为悬浮培养工艺,但悬浮培养工艺所生产的口蹄疫病毒146s 水平则取决于一个良好的生产工艺,其中细胞培养的温度、pH、溶氧是最基本、也是最重要的条件。
本试验通过改变悬浮细胞培养的温度、pH 、溶氧三个条件,旨在探索口蹄疫悬浮细胞的最佳培养条件。
1材料与方法BH K 21悬浮细胞(中牧股份兰州生物药厂提供)、细胞培养基(天信和生物科技有限公司提供)、口蹄疫O 型种毒(兰州生物药厂质检研发处提供)、2%N aO H (自制)。
2~3日龄乳鼠(兰州生物药厂四车间提供)。
7.5L 生物反应器、倒置显微镜、超速冷冻离心机、高效液相色谱仪、全自动密度梯度制备仪。
1.4.1使用7.5L 反应器培养BH K 21悬浮细胞,温度分别设定为35.5℃、36.0℃、36.5℃、37.0℃、37.5℃,pH 设定为7.2,溶氧设定为50%,待细胞密度达到4.0×106cel l s/m L 、细胞活率在90%以上时,用2%N aO H 调细胞pH 至7.6~7.8。
分别将口蹄疫O 型种毒按细胞体积的3%接毒,观察细胞病变情况并记录数据,待细胞病变达90%后收获。
1.4.2使用7.5L 反应器培养BH K 21悬浮细胞,pH 分别设定为6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4,温度设定为37.0℃,溶氧设定为50%,待细胞密度达到4.0×106cel l s/m L 、细胞活率在90%以上时,用2%N aO H 调细胞pH 至7.6~7.8。
分别将口蹄疫O 型种毒按细胞体积的3%接毒,观察细胞病变情况并记录数据,待细胞病变达90%后收获。
1.4.3使用7.5L 反应器培养BH K21悬浮细胞,溶氧分别设定为20%、30%、40%、50%、60%、70%,pH设定为7.2,温度设定为37.0℃,待细胞密度达到4.0×106cel l s/m L 、细胞活率在90%以上时,用2%N aO H 调细胞pH 至7.6~7.8。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
２ ０ ０ ９ 年 以前 ，国 内的 口蹄 疫疫 苗 生产企 业毫 无例 外 均 采 用 传统 的细 胞 转 瓶贴 壁 培 养 的 方式 来 生 产 口疫 疫 苗 ，这一 方式 己延续 多年 ，为防控 口蹄疫 起 到了非 常重 要 的作 用 ，但 由于转 瓶数 量众 多 ， 占用车 间面 积大 、手 工 操作 、生产 效率低 下 ，且 细胞密度 低 ，因此 悬浮 培养 成 为兽 用疫苗 技术 和质 量发 展瓶颈 。悬 浮培养 在 国外 已
公 司所拥 有 。当前生 物制 药 的主流技 术是 在大 型机械搅 拌 式反应 器 中 ，用 无血清 培养 基和 流加培 养工 艺悬 浮培 养细胞进行 生产＿ １ 】 。（ ２） 动 物细胞大规模培养生 产生物制
品的应用领域 在快速发展 。２ ０ ０ ７ 年全球 销售额最 高 的６ 大
２ ． １ ． １ 细胞 的筛选驯化和保 藏 （ １ ）实现悬 浮培养首先 需 要选择 合适 的宿 主细胞 ，细 胞系 的特 征 直接影 响放 大
的获得 、个性化培养基 的研发 、动 物细胞反 应器及配套
浮培 养 ，治疗性 抗体 生产技 术 的发展极 大地 推动 着生 物
反应 器在 生物 制药行业 中的应用 ，到２ ０ 世 纪末 已进入万
升 级规模 。２ ０ ０ ０ 年 以后 ，随着 流加培养 、灌 注培 养 、个
性化 细胞 培养基 等技 术 的发展 ，作为 大规模 培养 主要设
制 品的第 一次浪 潮 。２ ０ 世纪 ８ ０ 年代 后 ，Ｃ Ｈ Ｏ细胞 实现悬
２ 悬 浮培 养工 艺中的关 键技术
生 物 制 品 生产 过 程 研 发 的两 个 主要 目的是 提 高 产
率 、保证产 物 的质量 和过程 工艺设 计 的一致 性 ，前 者直
接关 系到商 业化 生产 的可行 性 ，后 者则 关 系到药物 的安 全 和有效性 。对 应悬 浮培养 技术 主要包 括高 表达 细胞株
成 功应 用于 口蹄疫 病毒疫 苗 的生产 ，其优 点是 各种 环境 因素 的监测 与控 制更为 方便 ，培养 条件 稳定 ，由于在连
自己的细胞 培养平 台进行流感疫苗 的生产 ， 包 括Ｂ ａ ｘ ｔ ｅ ： 公 司的Ｖ ｅ ｒ ｏ 细胞 平 台 、Ｃ ｒ ｕ ｃ ｅ ｌ ｌ 公 司和赛 诺 菲 巴斯 德 的Ｐ Ｅ Ｒ ．
胞 生物 反应器 ，但 由于 细胞悬 浮培养 技术 要求 高 、壁 垒 大 ，研 发单 位在未 掌握 核心技 术 的情 况 下 ，仅凭 模仿 很
难 实现 产业 化 ，国产 细胞生 物反应 器在 ２ ０ ０ ８ 年 以前 几乎
是 空 自白；由于细 胞株 等上 游配套 技术 落后 、缺乏个 性 化细胞 培养 基支持 以及 生化 工程研 究等 原 因 ，成为 细胞 大规模培养 技术一直难 以突破技术瓶 劲 。《中国生物 技术 产业发展报告 （ ２ ０ ０ ５ ） 》指 出： 自主综 合支撑技术是 大规模 悬 浮培 养技 术 在我 国 实现 产业 化 最难 以跨 越 的技 术“ 门
Ｃ ６ 细胞 平 台 、诺华公 司 的ＭＤ Ｃ Ｋ细胞平 台等 。（ ３）纵 观 国内 ，人用 和兽用疫苗生 产企业 已超 过 １ １ ０ 家 ，应用反应
器 悬浮培养技 术生产 口蹄 疫疫苗 的就有 ５ 家。一般兽用 疫
苗企业 可采用 国内 自主开发 的３ ０ ０ ０ Ｌ 反应 器生产 口蹄疫 疫 苗＿ ２ 】 。（ ４）我 国“ 七五” 至“ 八 五” 攻关期 间立项研发动 物细
续 封闭 的系 统 中进 行 ，使 操作 步骤 简化 ，污 染的机会 也 显著降低 。２ ０ ０ ９ 年４ 月 ，随着 金宇保灵 生物药 品有 限公司
用生物 反应 器生 产牛 口蹄疫 疫苗 获得注 册批 准 ，标 志着 国 内用 生物 反应 器悬浮 培养 细胞 生产兽 用疫 苗 的时代 的 到来。
山东畜牧兽医
２ ０ １ ７年第 ３ ８卷
文 献 综 述
细胞悬浮培养在 口蹄 疫疫苗 中的研究进展
刘 萍 董金 杰
（ 中农威特生物科技股份有限公司 甘肃 兰州 ７ ３ ０ ０ ４ ６ ）
中图分类号 ：Ｓ ８ ５ ２ ． ６ ５ ９ 文献标识码 ：Ａ‘ 文章编 号 ：１ ０ ０ ７ － １ ７ ３ ３ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ５ － ０ ０ ５ ４ － ０ ３ 抗 原产量 。 国际知名 厂家 纷纷进 行细胞 改造 筛选 ，发展
设施的完善及生产工艺 的优化等 四个方 面。 ２ ． １ 细胞源自与 毒 株 的 驯Ｉ 化 与 保 藏
为 提高 生物制 品 的产率 和安全 有效 性 ，在生 物反应 器 中繁殖 的病 毒与 细胞 需要 进行 相互适 应选 择 ，针对不 同的毒株 及其 表达量 筛选适 合 的宿 主细胞对 于 细胞 大规 模生产具有重要意义 。
槛” 。
１ 悬浮培养技术在生物制 药中的应用历史和现状
（ １ ）１ ９ ６ ２ 年 ，Ｃ ａ ｐ ｓ ｔ ｉ ｃ ｋ 等 对Ｂ Ｈ Ｋ． ２ １ 细胞 驯化 实现悬 浮培并 用于兽用 疫苗生产 。１ ９ ６ ７ 年 ，Ｖ ａ ｎ Ｗｅ ｚ ｅ ｌ 开发 了微 载体并 实 现在生 物反应 器 中大规 模培养 贴壁 细胞 。悬浮 培养 与微 载体 培养标志 着 细胞大 规模 培养技 术 的开始 ， 细胞 生产病 毒疫 苗也成 为 细胞大 规模培 养技 术生 产生物
备 的生物 反应 器规模 也趋 向大 型化 和简单 化 。现 在 ，全 球１ ０ ０ ０ ０ Ｌ及 以上 体 积 的反 应 器 达 １ ０ ０ 多 台 ，最 犬 已 达 ２ ５ ０ ０ ０ Ｌ，且几 乎都 是可 以放大 的机械 搅拌 式反应 器 ，主
要 为Ｇ ｅ ｎ ｅ ． ｔ ｅ ｃ ｈ ，Ａ ｍｇ ｅ ｎ ，Ｂ ｏ ｅ ｈ ｒ ｉ ｎ ｇ ｅ ｒ Ｉ ｎ ｇ ｅ ｌ ｈ ｅ ｉ ｍ和 Ｌ ｏ ｎ ｚ ａ 等