紫外分光光度法测定蛋白质含量
紫外分光光度法测定蛋白质含量
紫外分光光度法测定蛋白质含量化学2班李永亮41007061【实验目的】（1）学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；（2）掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；（3）掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
【实验原理】本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。
蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。
在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。
该测定法具有简单、灵敏、快速高、选择性，且稳定性好，干扰易消除，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。
利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，其主要原因有两个：其一对于测定那些与标准蛋白质中赖氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；其二若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
【实验仪器与试剂】仪器：TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管，胶头滴管试剂：标准蛋白质溶液（3.00mg/mL）,0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液【实验步骤】一、准备工作1、启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。
2、在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。
3、将空白放入测量池中，点击开始扫描空白，点击基线校零。
4、标准曲线的绘制二、测量工作1、吸收曲线的绘制用吸量管吸取2mL3.00mg/mL 标准蛋白质溶液于10mL 比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。
用1cm 石英比色皿，以0.9% NaCl 溶液为参比，在190 nm ～400nm 区间，每隔2nm 测量一次吸光度，记录数据。
2、标准曲线的制作用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 3.00 mg/mL 标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。
常用紫外分光光度法测定蛋白质含量
6种方法测定蛋白质含量一、微量凯氏（kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。
含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。
经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。
若以甘氨酸为例，其反应式如下：nh2ch2cooh+3h2so4——2co2+3so2+4h2o+nh3 (1)2nh3+h2so4——(nh4)2so4 (2)(nh4)2so4+2naoh——2h2o+na2so4+2nh3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入cuso4作催化剂，k2so4以提高溶液的沸点。
收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。
实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。
如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
二、双缩脲法（biuret法）（一）实验原理双缩脲（nh3conhconh3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与cuso4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。
测定范围为1-10mg蛋白质。
干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差。
因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。
（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（bsa）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，可用bsa浓度1mg/ml的a280为0.66来校正其纯度。
试验三紫外分光光度法测定蛋白质
实验三 紫外分光光度法测定蛋白质一、原理由于蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收高峰在280nm 。
在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，这是由于：(1)对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差。
故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。
(2)若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
核酸强烈吸收波长为280nm 的紫外光，它对260nm 紫外光的吸收更强。
但是蛋白质恰恰相反，在280nm 的紫外吸收值大于260nm 的紫外吸收值。
利用这些性质，通过计算可以适当校正核酸对于测定蛋白质含量的干扰作用。
但是，因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不同的，虽然经过校正，测定结果还存在着一定的误差。
在测定工作中，可利用在280nm 及260nm 下的吸收差求出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280nm —0.74A260nm ，式中：A280nm 是蛋白质溶液在280nm 下测得的光吸收值；A260nm 是蛋白质溶液在260nm 下测得的光吸收值。
Warburg 和Christian 用结晶的酵母烯醇化酶和纯的酵母核酸作为标准，对有核酸存在时所造成的误差作了评价，并作出了一个校正表(如下)。
紫外吸收法测定蛋白质含量的校正因子F0.6565.500.8461.1160.001.750.6320.6070.5850.5650.5450.5080.4780.4220.3770.3220.2786.006.507.007.508.009.0010.0012.0014.0017.0020.000.8220.8040.7840.7670.7530.7300.7050.6710.6440.6150.5951.0811.0541.0230.9940.9700.9440.8990.8520.8140.7760.7430.6820.250.500.781.001.251.502.002.503.003.504.005.001.631.521.401.361.301.251.161.091.030.9790.9390.874校正因子核酸%A 280nm /A 260nm校正因子核酸%A 280nm /A 260nm注：一般纯蛋白质的A280nm/A260nm 值为约1.8，而纯核酸的A280nm/A260nm 值为约0.5。
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教材1 紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理;掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术;掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
二、实验原理紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法, 它是研究分子吸收190nm ～750nm 波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。
进行定性:利用紫外-可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。
即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较。
定量分析: 紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=lgI0/I=εbc ，当入射光波长λ及光程b 一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A 与该物质的浓度c 成正比，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。
因此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。
由于最大吸收波长λmax 处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量λmax 的吸光度，以获得最大灵敏度。
光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为b 的两个吸收池中，让一束一定波长的平行单色光非别照射空白和待测溶液，以通过空白溶液的透光强度为I 0，通过待测溶液的透光强度为I ，根据上式，由仪器直接给出I 0与I 之比的对数值即吸光度。
紫外-可见分光光度计:紫外-可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光, 该单色光通过样品池静样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A 。
可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池; 紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。
紫外分光光度法测定蛋白质的含量
１ ． ３ 方 法
１ ． ３ ． １ 吸收 曲线 的绘 制
１ ． ３ ． ３ 待 测 样 品 的 测 定
取２ ｍＬ的待测蛋 白质溶液 ，用 ０ ． ９ ％的 Ｎａ Ｃ １ 溶液稀 释至
１ ０ ｍＬ ， 按上述 方法测定 ２ ７ ９ ｎ ｌ ｎ处的吸光度值 。 平行测定三次 。 结果 见表 ３ 。
＝
０ ． ６ ０ ０ ｍｇ ／ ｍＬ；样 品标准偏差 ｓ ＝ ［ ∑ （ ｘ 一 ｘ ） ／ （ ｎ 一 １ ） ＝ ０ ． ０ ７ ８ ；相对
标准偏差 Ｓ ｒ ＝ Ｓ ／ ｘ ＝ Ｏ ． ０ ２ ６ 。
２ ． ２ 结 果分 析
２ ＿ ２ ． １ 影 响 本 测 定 方 法 的 因 素
ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ ． Ｔｈ ｉ ｓ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ｔ ｅ ｓ ｔ ｅ ｄ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ ｏ ｆ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｓ ｂ ｙ ＵＶ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｔ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｉ ｃ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ． Ａｃ ｃ ｏ ｒ ｄ ｉ ｎ ｇ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｉ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｉ ｓ ｅ ｘ ｐ ｅ ｒ ｉ ｍｅ ｎ ｔ ． Ｗｅ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ａ ｎ ｄ ｓ ｕ ｍｍａ ｒ ｉ ｚ ｅ ｔ ｈ ｅ ｔ ｒ ａ ｉ ｔ ｓ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｏ ｆ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ． Ｉ ｔ ｗａ ｓ ｓ ｈ ｏ ｗｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ｔ ｈ ｅ ｍｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｗａ ｓ ｓ ｉ ｍｐ ｌ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ， ｒ ａ ｐ ｉ ｄ ｉ ｔ ｙ ａ ｎ ｄ ｓ ｅ ｎ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ ｆ ｏ ｒ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｉ ｎ ｑ ｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ． Ｅｓ ｐ ｅ ｃ ｉ ａ ｌ ｌ ｙ ｓ ｕ ｉ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ ｏｒ ｆ ｔ ｈ ｅ ｄ ｅ ｔ ｅ ｍ ｉ ｒ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｌ ｏ ｗ ｃ ｏ ｎ ｔ ｅ ｎ ｔ ｓ ａ ｍｐ ｌ ｅ ｓ ． Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｄ ｓ ： ＵＶ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｒ ｏ ｐ ｈ ｏ ｔ ｏ ｍｅ ｔ ｒ ｉ ｃ ；ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ；ｄ ｅ ｔ ｅ ｍ ｉ ｒ ｎ ｉ ｎ ｇ
紫外分光光度法测定蛋白质含量实验报告
紫外分光光度法测定蛋白质含量一、实验目的1.学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理；2.掌握紫外分光光度法测蛋白质含量的实验技术。
二、实验原理L测蛋白质含量的方法主要有：①测参数法：折射率、相对密度、紫外吸收等；②基于化学反应:定氮法、双缩胭法、FOlin一酚试剂法等。
本实验采用紫外分光光度法。
2.蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环中含有共挽双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于28Onm附近（不同蛋白质略有不同）。
在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度服从朗伯一比尔定律。
利用紫外吸收法测蛋白质含量的准确度较差，原因有二：①对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定误差，故该法适于测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质；②样品中含有的噂吟、嗒咤等吸收紫外光的物质，会出现较大干扰。
三、仪器与试剂TU-1901紫外可见分光光度计、标准蛋白质溶液3.00mg∙mLL 0.9%NaCl 溶液、试样蛋白质溶液。
IomL比色管、ICm石英比色皿、吸量管。
四、实验步骤L绘制吸收曲线用吸量管吸取2mL3.00mg∙mL^,标准蛋白质溶液于1 OmL比色管中，用0.9%NaCI 溶液稀释至刻度，摇匀。
用ICm石英比色皿，以0.9%NaCI溶液作参比溶液，在190〜40Onm间每隔5nm测一次吸光度Abs,记录数据并作图。
3.绘制标准曲线用吸量管分别吸取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL3.00mg∙mL-ι标准蛋白质溶液于IomL 比色管中，用0.9%NaCI溶液稀释至刻度，摇匀。
用ICm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液作参比溶液，在波长28Onm处分别测其吸光度，记录数据并作图。
4.样品测定取适量浓度试样蛋白质溶液，在波长28Onm处测其吸光度，重复三次。
在已经得到标准曲线的情况下，为了使测量结果准确度高，待测溶液的浓度需在标准曲线的线性范围内，所以，先测定试样蛋白质原液的吸光度（1.363）,估算浓度为2.0960 mg∙mL∙,,再将原试液稀释至5倍（即取2mL试液，用0.9%NaCI溶液稀释至刻度，摇匀），估算浓度为0.4192 mg∙mLL测吸光度，重复三次五、数据处理与结果分析图1吸收曲线在上图吸收曲线中可以看到有两处吸收峰，且在波长225nm 处的吸收峰远大 于28Onm 处，这是由于在波长25Onm 以下时，溶剂吸收较为严重，干扰较大， 所以，蛋白的最大吸收波长应为280nm.O 50 IOO 150 200 250 300 350 400 450—系列］Iλ ∕nm图2标准曲线将试样所测得吸光度带入标准曲线中求蛋白质含量：稀释以后的蛋白质的浓度 CX=(AbS-0.0202)/0.6407原试样中蛋白质浓度 c=(c x * 10)/2所测蛋白质试样的浓度约为2.126mg∙mL . 单次测定的标准偏差：=0.12相对标准偏差：s r =-×100% =-^-×100% =5.5%2.126浓度c∕mo] ■「I→-系列I—线性(系列1)。
紫外分光光度法测定蛋白质含量
紫外分光光度法测定蛋白质含量实验目的1、学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理。
2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。
实验原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。
蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm 附近（不同蛋白质的吸收波长略有差别）。
在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯—比尔定律。
利用紫外吸收法测定蛋白质含量准确度较差，其主要原因有两个：其一，测定的蛋白质与标准蛋白质中色氨酸、酪氨酸的含量不同，会造成一定的误差，故该法适用于测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质；其二，若样品中含有嘌呤、嘧啶（核酸）等吸收紫外光的物质，会产生较大的干扰。
核酸强烈吸收波长为280nm的紫外光，对260nm 波长的紫外光吸收更强，其与蛋白质不同，蛋白质在280nm处的吸收大于260nm 的吸收，故可利用这一性质，通过计算适当校正核酸对于测定蛋白质含量的干扰作用。
由于不同的蛋白质与核酸的紫外吸收不同，故测定的结果还是会产生一定的误差。
在测定工作中，可利用在280nm及260nm下的吸收差求出蛋白质的浓度。
蛋白质浓度（mg·mL-1）=1.45A280—0.74A260其中A280、A260分别为蛋白质溶液在280nm与260nm 处测得的吸光度值。
Warburg 和 Chirstian 用结晶的酵母烯醇化酶和纯的酵母核酸作为标准，对于有核算存在时所造成误差做出了评价，并作出校正表。
A280与A260的比值为校正因子F，可从校正表中查出，同时可查出该样品溶液中混杂核酸的百分含量，将F值代入，再由经验公式直接计算该溶液的蛋白质浓度。
蛋白质浓度（mg·mL-1）=F * 1/d * A280* D其中d为石英比色池的厚度；D为溶液的稀释倍数。
紫外吸收法在蛋白质含量为20~100μg·mL-1范围内服从比尔定律，氯化钠、硫酸铵以及0.1mol·L-1磷酸、硼酸和Tris 等缓冲溶液都无显著干扰，但是，0.1mol·L-1乙酸、琥珀酸、邻苯二甲酸以及巴比妥等缓冲溶液在215nm 下的吸收较大不能应用，必须降至0.005mol·L-1才无显著影响。
分光光度法检测蛋白质含量
分光光度法检测蛋白质含量在生命科学、医学、食品科学等众多领域中，准确测定蛋白质的含量是一项至关重要的任务。
分光光度法作为一种常见且有效的分析技术，因其操作简便、准确性高和成本相对较低等优点，在蛋白质含量检测中得到了广泛的应用。
分光光度法的基本原理是基于物质对不同波长光的吸收特性。
当一束特定波长的光穿过含有待测物质的溶液时，部分光会被溶液中的物质吸收，从而导致光强度的减弱。
通过测量光的入射强度和透过强度，并根据比尔朗伯定律，可以计算出溶液中物质的浓度。
在蛋白质含量检测中，常用的分光光度法有两种：紫外分光光度法和 Bradford 法（考马斯亮蓝法）。
紫外分光光度法主要利用蛋白质分子中的芳香族氨基酸（如酪氨酸、色氨酸）在280nm 波长处有特征性吸收峰这一特性来进行检测。
然而，这种方法存在一定的局限性。
首先，不同蛋白质中芳香族氨基酸的含量差异较大，这会影响检测的准确性。
其次，当溶液中存在核酸等其他在 280nm 处有吸收的物质时，会干扰蛋白质的测定。
相比之下，Bradford 法具有更高的通用性和准确性。
考马斯亮蓝 G-250 在酸性条件下与蛋白质结合会从红色变为蓝色，最大吸收峰从465nm 转移到 595nm。
通过测量 595nm 处的吸光度变化，可以定量测定蛋白质的含量。
在实际操作中，使用分光光度法检测蛋白质含量需要进行一系列的准备工作和操作步骤。
首先是样品的制备。
样品需要经过适当的处理，如提取、溶解和稀释，以确保蛋白质能够充分溶解在溶液中，并且浓度在检测方法的线性范围内。
对于复杂的生物样品，可能还需要进行去除杂质、沉淀蛋白质等预处理步骤。
然后是选择合适的标准蛋白。
标准蛋白应具有与待测样品相似的性质，并且其浓度是已知且准确的。
常用的标准蛋白有牛血清白蛋白（BSA）。
接下来是绘制标准曲线。
将不同浓度的标准蛋白溶液在相同条件下进行分光光度测定，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
标准曲线应具有良好的线性关系，通常相关系数（R²）应大于 099。
紫外分光光度法测蛋白质的含量
紫外分光光度法测蛋白质的含量一、实验目的1、学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理。
2、掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术。
3、掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
二、实验原理本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。
蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。
在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。
该测定方法简单、灵敏、快速，不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定。
1.紫外-可见分光光度法，是以溶液中物质的分子或离子对紫外和可见光谱区辐射能的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外光：10-400 nm可见光：400-780 nm特点：带光谱、分子光谱应用：定性分析-最大吸收波长；定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）a.定性分析原理：吸收曲线：吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状.b.定量分析原理：根据朗伯－比耳定律：A=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比。
定量分析常用的方法是标准曲线法即只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。
c.仪器组成部件:各种类型的紫外-可见分光光度计，如下图所示，从总体上来说是由五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示记录装置。
2.本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验原理：（1）蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，所以蛋白质溶液在275--280nm具有一个吸收紫外吸收高峰。
在一定浓度范围内，蛋白质溶液在最大吸收波长处的吸光度与其浓度成正比，服从朗伯-比耳定律，因此可作定量分析。
该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。
紫外分光光度法测定DNA蛋白质含量美析仪器-紫外可见分光光度计
紫外分光光度法测定DNA蛋白质含量美析仪器有限公司一、实验目的学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理；掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；掌握UV-1700紫外可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
二、实验原理紫外可见吸收光谱法又称紫外可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm 波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱.定性分析:利用紫外可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。
即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较。
定量分析: 紫外可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=lgI0/I=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。
因此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。
由于最大吸收波长λmax处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量λmax的吸光度，以获得最大灵敏度。
光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为b的两个吸收池中，让一束一定波长的平行单色光非别照射空白和待测溶液，以通过空白溶液的透光强度为I0，通过待测溶液的透光强度为I，根据上式，由仪器直接给出I0与I之比的对数值即吸光度。
紫外可见分光光度计:紫外可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即光源、单色器、吸收池、检测器、信号显示器；由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光,该单色光通过样品池静样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。
可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池;紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。
国标紫外分光光度法测定蛋白质含量
国标紫外分光光度法测定蛋白质含量蛋白质是构成生物体内各种细胞、器官和组织的主要物质之一，其含量的测定对于科学研究和工业生产具有重要意义。
目前国际上常用的测定蛋白质含量的方法有比色法、低力荧光素法和生物素-四硫化物法等，而国家标准推荐使用紫外分光光度法测定蛋白质含量，因其准确性和可靠性较高，具有广泛适用性。
一、实验原理国标紫外分光光度法利用蛋白质分子内含有色氨酸（W）、酪氨酸（T）和苯丙氨酸（F）等氨基酸团的紫外吸收特性，即在近220nm处有吸收峰。
通过分析样品在220nm处的吸光度值，就可以计算出其蛋白质含量。
二、实验步骤1. 样品的制备将所需测定的物质按照预定比例溶解在适量的缓冲溶液中，混合均匀，离心沉淀物质后，称取上清液并记录其质量，得到样品洗脱液。
2. 样品的测定(1)制备含有对照蛋白质的样品洗脱液。
将已知浓度的蛋白质按需求浓度稀释后，制成一系列的对照样品，称取适量的对照样品，经过与样品液的处理过程相同的操作后，得到对照样品洗脱液。
(2)利用紫外分光光度计测量样品洗脱液和对照样品洗脱液在220nm处的吸光度，记录数据。
(3)计算样品洗脱液中蛋白质的含量。
根据统计学方法，将同一浓度蛋白质的对照样品的吸光度取平均值，并绘制标准曲线。
根据样品洗脱液的吸光度值和标准曲线，计算出样品中蛋白质的含量。
三、实验注意事项1. 操作时需严格按照实验指导书的规定操作。
2. 紫外分光光度计在对样品洗脱液进行吸光度测定时，应使用二元芳香胺半波长试管作为样品池。
3. 为防止各种最终洗涤液误差的影响，应利用含有NaHCO3 or Na2CO3的去离子水作为纯化洗涤液。
四、实验结果的分析利用国标紫外分光光度法测定出的蛋白质含量，可点评该样品是否符合质量要求。
若蛋白质含量低于标准要求，则说明样品质量不好，需再次提取纯化；若蛋白质含量超过标准，则说明提取效率较好，但仍需注意实验中的误差，以获得更加准确的结果。
总之，国标紫外分光光度法测定蛋白质含量是一种可靠、简便、经济的方法，可广泛应用于生物科学、医药研究、食品工业等领域，对于推动相关研究和产业发展起到了积极的促进作用。
紫外吸收法测定蛋白质含量
四、操作步骤
1．标准曲线制作 按下表分别向每支试管内加入各种试剂，
混匀。以光程为1cm的石英比色杯，在 280nm波长处测定各管溶液的光密度值 OD280nm。 以蛋白质浓度为横坐标，光密度值为纵坐 标，绘出标准曲线。
2．样品测定
取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL， 混匀，按上述方法测定280nm的光密度， 并从标准工作曲线上查出待测蛋白质溶液 的浓度。
三、 实验材料、主要仪器和试剂
1．试验材料：待测的蛋白质溶液。 2． 主要仪器： （1）紫外分光光度计，（2）试管与试管架，
（3）刻度吸量管 3．试剂： （1）标准牛血清蛋白溶液：准确称取经凯氏定
氮法校正的结晶牛血清蛋白，配制成浓度为 1mg/mL的溶液。 （2）待测蛋白质溶液：浓度为1mg/mL左右的溶 液
五、附注
1．在测定工作中，可以利用280nm及260 nm的光密度值求出蛋白质的浓度：
蛋白质浓度（mg/mL） =1.45OD280nm―0.74OD260nm
上式中的OD280nm是蛋白质溶液在280nm 下测得的光密度，OD260nm是蛋白质溶液 在260nm下测得的光密度。
2．对于有核酸存在时所造成的误差，可将待测 的蛋白质溶液稀释至光密度在0.2~2.0之间，选 用光程为1cm的石英比色杯，在280nm及260nm处 分别测出光密度OD280nm /OD260nm的比值，从下 表中查出校正因子“F”值，同时可查出该样品内 混杂的核酸的百分含量，将F值代入下述公式， 即可计算出该溶液的蛋白质浓度。
六、思考题
1．紫外吸收法与Folin-酚比色法测定蛋白 质含量相比，有何缺点及优点？
2．若样品中含有核酸类杂质，应如何校正？
紫外分光光度法测定蛋白质的含量
紫外分光光度法测定蛋白质的含量一、实验目的：（1）学习紫外光度法测定蛋白质含量的原理；（2）掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术；二、实验原理：蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280nm附近。
最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液浓度的关系服从朗伯尔比尔定律：A=abc“A”为溶液的吸光度值，“b”为石英比色池的厚度，“c”为蛋白质溶液的浓度。
紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。
紫外-可见分光光度法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，如下所示：由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光,该单色光通过样品池对样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。
可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池;紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。
本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。
三、仪器与试剂：TU-1901双光束紫外可见分光光度计、比色管、吸量管标准蛋白质溶液（5.00mg/mL）、0.9%NaCl溶液、待测蛋白质溶液四、实验步骤：1.准备工作：⑴启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。
⑵在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。
⑶将空白放入测量池中，点击START扫描空白，点击ZERO校零。
⑷标准曲线的制作。
2.测量工作：⑴.吸收曲线的绘制：用吸量管吸取2mL5.00mg/mL标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。
用1cm石英比色皿，以0.9%NaCl溶液为参比，在190 nm～400nm区间，测量吸光度。
紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量
紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中蛋白质含量一、本文概述本文旨在探讨紫外分光光度法在快速测定液体奶和奶粉中蛋白质含量方面的应用。
紫外分光光度法是一种基于物质对紫外光的吸收特性进行定量分析的方法，具有操作简便、快速准确、适用范围广等优点，因此在食品营养成分分析中得到了广泛应用。
本文将详细介绍紫外分光光度法的基本原理、实验步骤及注意事项，并通过实例分析验证该方法在液体奶和奶粉中蛋白质含量测定中的准确性和可靠性。
本文还将讨论该方法相较于传统蛋白质测定方法的优势，以及在实际应用中的潜力和局限性。
通过本文的研究，旨在为液体奶和奶粉生产的质量控制、食品安全监管以及营养学研究提供有力支持。
二、紫外分光光度法原理紫外分光光度法是一种基于物质在紫外光区（通常指波长范围在200-400纳米）对光的吸收性质进行分析的方法。
在液体奶和奶粉中蛋白质含量的测定中，该方法主要利用蛋白质分子中的芳香族氨基酸（如色氨酸和酪氨酸）以及某些特定的肽键在紫外光区具有吸收峰的特性。
当紫外光通过这些含有蛋白质的样品时，部分光能被蛋白质分子吸收，导致光的强度减弱。
根据朗伯-比尔定律，光强度的减少与样品中蛋白质的浓度成正比。
因此，通过测量紫外光通过样品前后的强度变化，可以计算出样品中蛋白质的浓度。
在紫外分光光度法中，常用的波长通常为280纳米，因为这是大多数蛋白质在紫外光区的主要吸收峰。
为了消除其他可能干扰测定的物质（如核酸）的影响，通常还会使用多个波长（如260纳米）进行校正。
通过比较不同波长下的吸光度值，可以更加准确地计算出蛋白质含量。
紫外分光光度法具有快速、简便、灵敏度高和成本较低等优点，因此在食品工业中得到了广泛应用。
然而，需要注意的是，该方法只能提供蛋白质总量的信息，无法区分不同种类的蛋白质。
对于含有较多非蛋白质成分或具有特殊光学性质的样品，可能需要采用其他方法进行蛋白质含量的测定。
三、实验材料与方法本实验采用紫外分光光度法快速测定液体奶、奶粉中的蛋白质含量。
紫外分光光度法快速测定液体奶_奶粉中蛋白质含量_田志梅
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【化学测定方法 】
紫外分光光度法快速测定液体奶 、奶粉中蛋白质含量
田志梅 , 张永顺
(河北省衡水市疾病预防控制中心 , 河北 衡水 053000)
菌乳 (纯牛奶 )、含乳饮料等三种样品 做方法加 标回收试验 , 结 果见表 2。
表 2 方法的加标回收率
样 品名 称
本底值蛋白质含量 加入量 实测结果 回收率
(mg/ml)
(mg/ml) (mg/ml) (%)
1‰奶粉 稀释 液
0.35
0.40
0.72
96.0
1%灭菌 乳
0.34
0.40
0.77 104.1
溶解后 , 置于 1 L容量瓶中 , 加入 9 g/L氯化钠溶液至刻度 , 混
匀 。 再从中吸取 10.00 ml样品溶液于 100 ml容量瓶 中 , 加入
9 g/L氯化钠溶液至刻度 , 微波振荡 5 min, 混匀 。 用定性滤纸
过滤 , 弃去初滤液 30 ml, 收集 滤液 备用 。 用 9 g/L氯化 钠溶
液做空白调零 , 在 280 nm波长处 , 用 1 cm石英比 色皿测得吸
光度值 。 记录乳样 的吸 光度 值 , 从工 作曲 线上 查出 或用 计算
标准回归方程计算出 测定样品溶液中蛋白质含量 C。
1.2.3 分析结果的 表述 与计算 样 品中蛋 白质 的含 量 X按
式 (1)计算 : X=10C· F
全脂奶粉
34.96
≥34
35.25
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教材1 紫外分光光度法测定蛋白质含量
一、实验目的
➢学习紫外分光光度法测定蛋白质含量的原理;
➢掌握紫外分光光度法测定蛋白质含量的实验技术;
➢掌握TU-1901紫外-可见分光光度计的使用方法并了解此仪器的主要构造。
二、实验原理
紫外-可见吸收光谱法又称紫外-可见分光光度法,它是研究分子吸收190nm～750nm波长范围内的吸收光谱，是以溶液中物质分子对光的选择性吸收为基础而建立起来的一类分析方法。
紫外-可见吸收光谱的产生是由于分子的外层价电子跃迁的结果，其吸收光谱为分子光谱，是带光谱。
进行定性:利用紫外-可见吸收光谱法进行定性分析一般采用光谱比较法。
即将未知纯化合物的吸收光谱特征，如吸收峰的数目、位置、相对强度以及吸收峰的形状与已知纯化合物的吸收光谱进行比较。
定量分析:紫外-可见吸收光谱法进行定量分析的依据是朗伯-比尔定律：A=lgI0/I=εbc，当入射光波长λ及光程b一定时，在一定浓度范围内，有色物质的吸光度A与该物质的浓度c成正比，即物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成线形关系。
因此，通过测定溶液对一定波长入射光的吸光度，就可求出溶液中物质浓度和含量。
由于最大吸收波长λmax处的摩尔吸收系数最大，通常都是测量λmax的吸光度，以获得最大灵敏度。
光度分析时，分别将空白溶液和待测溶液装入厚度为b的两个吸收池中，让一束一定波长的平行单色光非别照射空白和待测溶液，以通过空白溶液的透光强度为I0，通过待测溶液的透光强度为I，根据上式，由仪器直接给出I0与I之比的对数值即吸光度。
紫外-可见分光光度计:紫外-可见吸收光谱法所采用的仪器称为分光光度计，它的主要部件有五个部分组成，即
由光源发出的复合光经过单色器分光后即可获得任一所需波长的平行单色光,该单色光通过样品池静样品溶液吸收后，通过光照到光电管或光电倍增管等检测器上产生光电流，产生的光电流由信号显示器直接读出吸光度A。
可见光区采用钨灯光源、玻璃吸收池;紫外光区采用氘灯光源、石英吸收池。
本实验采用紫外分光光度法测定蛋白质含量。
蛋白质中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此，蛋白质具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于280 nm 附近（不同的蛋白质吸收波长略有差别）。
在最大吸收波长处，吸光度与蛋白质溶液的浓度的关系服从朗伯-比耳定律。
该测定法具有简单灵敏快速高选择性，且稳定性
好，干扰易消除不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。
特点：带光谱
分子光谱
应用：定性分析-最大吸收波长
定量分析-朗伯-比尔定律（标准曲线法和标准加入法）
根据朗伯－比耳定律：A=εbc，只要绘出以吸光度A为纵坐标，浓度c为横坐标的标准曲线，测出试液的吸光度，就可以由标准曲线查得对应的浓度值，即未知样的含量。
三、仪器与试剂
TU-1901紫外-可见分光光度计，比色管，吸量管
标准蛋白质溶液：5.00 mg.mL-1溶液
0.9% NaCl溶液，待测蛋白质溶液
四、实验步骤
〈一〉准备工作
1. 启动计算机，打开主机电源开关，启动工作站并初始化仪器。
2. 在工作界面上选择测量项目（光谱扫描，光度测量），本实验选择光度测量，设置测量条件（测量波长等）。
3. 将空白放入测量池中，点击START扫描空白，点击ZERO校零。
4. 标准曲线的制作。
〈二〉测量工作
1.吸收曲线的绘制:
用吸量管吸取2mL5.00mg/mL标准蛋白质溶液于10mL比色管中，用0.9% NaCl 溶液稀释至刻度，摇匀。
用1cm石英比色皿，以0.9% NaCl溶液为参比，在190 nm～400nm区间，测量吸光度。
2. 标准曲线的制作：
用吸量管分别吸取0.5、1.0 、1.5、 2.0 、2.5 mL 5.00 mg.mL-1标准蛋白质溶液于5只10 mL 比色管中，用0.9% NaCl溶液稀释至刻度，摇匀。
用1 cm石
英比色皿，以0.9%NaCl 溶液为参比，在280 nm 处分别测定各标准溶液的吸光度A 278记录所得读数。
3. 样品测定：
取适量浓度的待测蛋白质溶液3 mL ，按上述方法测定278 nm 处的吸光度。
平 行测定三份。
五、数据处理：
1. 以波长为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制吸收曲线，找出最大吸收波长。
由吸收曲线可得最大吸收波长λmax=278nm (图略)
2. 以标准蛋白质溶液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
吸光度A
标准溶液浓度C(mg/mL)
浓度C-吸光度A 标准曲线方程是：A=0.6208*C+0.0186 曲线拟合优度: R
2
=0.9998
3. 根据样品蛋白质溶液的吸光度，从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。
所测溶液平均浓度: C=(C1+C2+C3)/3=1.056 mg/mL
S=√Σ(Xi－X)2/(n－1)=0.003
测量的标准偏差：
RSD S X=0.284%
相对标准偏差：/
待测蛋白质溶液浓度为：1.056 mg/mL*10mL/3mL=3.520 mg/mL。
六、思考题:
紫外分光光度法测定蛋白质含量的方法有何优缺点？受哪些因素的影响和限制？
优点：该测定法具有简单灵敏快速高选择性，且稳定性好，干扰易消除不消耗样品，低浓度的盐类不干扰测定等优点。
缺点：仪器昂贵，而且不同的蛋白质的紫外吸收是不相同的，测定结果存在着一定的误差。
七、注意事项:
1.绘制标准曲线时，蛋白质溶液浓度要准确配制，作为标准溶液;
2.测量吸光度时，比色皿要保持洁净，切勿用手玷污其光面;
3.石英比色皿比较贵重，使用时要小心。