双向电泳

它带电荷的性质，具有不同pI的两性电解质在同一环境中带有不同 性质和数量的电荷，
另一方面，溶液中的两性电解质又破坏了水的解离平衡：
H2O
H++OH－
使溶液的pH有所改变。当某一两性电解质的pI较低，即释
放质子（ H+ ）能力较强，使溶液 pH 值下降，这类两性电
解质称为酸性两性电解质；而pI高的两性电解质可使溶液
1.2.1组合摸式：双向电泳主要是电荷分离——分子质量分 离的组合摸式。 （ 1 ）第一向为电荷分离：通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦 毛细管电泳将样品按蛋白质等电点的差异进行分离。 （ 2 ）第二向为质量分离：通过 SDS— 聚丙稀酰胺凝胶电 泳按相对分子质量大小不同进行分离。
1.2.2分类：双向电泳根据其第一向使用的介质的不同可以
们到达净电荷为零的位置时才停止。
具有最低和最高等电点的分子带电荷最多，泳动速度最快， 所以pI梯度的形成开始在正、负级两端，然后不同pI的载 体两性电解质分子逐渐到达它们自己的等电点位置而形成
一个连续的pI梯度。如图所示。
A
B
C
载体两性电解质在电场中形成pI梯度的模式图
A 原始状态 B pI梯度的形成过程 C连续pI梯度的形成
出的优点。
图 等电聚焦的“聚焦效应”
等电聚焦电泳根据蛋白质等电点不同而将其分离，也可以根据蛋白 条带在pH梯度中形成的位置测定其等电点。
3第二向电泳——SDS电泳的基本原理
3.1蛋白质-SDS复合物
(1)SDS的作用：SDS是一种阴离子去污剂，它在水溶液中
以单体和分子团(micellae)的混合形式存在，作为一种变性
中存在三个物理效应和四个不连续性的分离系统。
3.2.1三个物理效应
(1)样品浓缩效应:只是将较稀的样品浓缩成一条带再分离
(2)凝胶的分子筛效应:不同分子量蛋白质通过凝胶时 ,起到 分子筛作用 (3)电荷效应:蛋白质所带净电荷不同,在电场下迁移率不同 上述三种物理效应 ,电泳时任何一种效应都不是单独存在 的,三者共存于一体,作用相互关联
载体两性电解质是由脂肪族多氨基多羧基的异构物和同系
物组成，由于分子中带有不同比例氨基与羧基的脂肪族多 氨基多羧酸，各组分的等电点既有差异又相接近，其pI值 在大多数羧基的pK值和大多数氨基的pK值之间。在电场 作用下，可以形成平滑而连续的pH梯度
R1－+NH2－(CH2)2－+NH2－R2 + CH2＝CH－COO
2等电聚焦电泳的基本原理
2.1蛋白质等电电性质
蛋白质由不同数量和比例的氨基酸组成，氨基酸带有正负
两类解离基团：氨基和羧基，在一定 pH 下结合或解离质
子而使蛋白质带正电荷或负电荷，是典型的两性电解质。 蛋白质在某一 pH 时，所带净电荷为零，此时 pH 为该蛋白 质的等电点(isoelectric point，pI)。 当pH＞pI时，蛋白质带负电荷，在电场的作用下向正极移
极每隔1cm用表面微电极测定凝胶的pH值。
2.2.4 pH梯度的制备方式
在等电聚焦电泳中产生pH梯度的方式有两种：
(1)人工 pH梯度 : 用两种具有不同 pH的缓冲液相互扩散，
在混合区形成 pH 梯度，由于缓冲液离子的电迁移和扩散
使pH梯度不稳定，一般用于制备电泳；
(2)自然pH梯度: 在凝胶中加入载体两性电解质，在电场作
－
H2O，70℃ 16－20 h R1－+NH2－(CH2)2－+NH－CH2－CH2－COO－ | R2 反应式中的R1，R2是氢或带有氨基的脂肪基。这个反应的特点是生
成众多的异构物和同系物的混合物，混合物中各成分的含量、等电
点的分布，取决于原料的性质、比例和合成条件。
瑞典LKB 公司生产载体两性电解质 ——Ampholine，其 pH范围如图 所示：
溶液 pH 范围的平均值。在制备聚丙烯酰胺凝胶时，将其
混溶在凝胶中，在没有电场时，所有载体两性电解质分子 都带电荷，所带总的净电荷为零。 在电场作用下，载体两性电解质分子将向正极或负极方向 泳动，其中较低等电点的分子带有不同数量的负电荷，以 不同的速度向正极方向泳动；具有较高等电点的分子带有 不同数量的正电荷，以不同的速度向负极方向泳动。当它
pH 值上升，称为碱性两性电解质。所以，在溶液中的两
性电解质一方面受溶液 pH 的影响，决定其带电的性质；
另一方面它又影响周围环境，使溶液pH值有所改变。
2.2.3两性电解质pH梯度的形成
载体两性电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分
布在 2.5—10 之间，载体两性电解质溶液的 pH 值大约是该
(1)载体两性电解质应溶解性能好，在pI处缓冲能力强，形 成稳定的 pH 梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变 pH梯度；
(2)导电性能良好，具有相同的电导系数，在等电聚焦过程 中保持均匀的电场，可以适当加高电压，从而缩短电泳时 间，提高分辨率，避免由于两性电解质质量差而造成的凝 胶局部过热，严重时造成烧胶； (3)载体两性电解质应化学性质稳定，无毒、无生物学效应 ，不影响蛋白质活性； (4)载体两性电解质紫外吸收低，与蛋白质可逆结合，相对 分子质量小，易从聚焦的蛋白条带中除去，有利于蛋白质
SDS- 电泳，梯度胶电泳，
等速电泳
IPG-Dalt 等电聚焦固相 pH 梯 SDS- 电泳，梯度胶电泳， 度 等速电泳
2 第一向电泳——聚焦电泳的基本原理 等电聚焦(isoelectric focusing，IEF)是二十世纪六十年代由 瑞典科学家Rilbe H和Vesterberg O建立的一种高分辨率的 蛋白质分离和分析技术。它是利用蛋白质分子或其它两性 电解质分子具有不同的等电点，从而在一个稳定、连续、 线性的pH梯度中得到分离。
分为两类。 （1）等电点-道尔顿(ISO-Dalt) ：是用载体两性电解质配 制成的聚焦凝胶系统。 （2）固相pH梯度-道尔顿(IPG-Dalt) ：是将载体两性电解 质偶联在凝胶上的聚焦系统。 双向电泳的分类和基本组合方式见表1。
表1 双向电泳分类和基本组合方式 系统名 第一向 第二向
称 ISO-Dalt 等电聚焦pH梯度
不连续系统的主要优点之一,是可以使用很稀的样品电泳,
这是因为在样品进入分离胶之前 , 先经过大孔径浓缩胶的
迁移作用而被浓缩成极细的条带. 这种浓缩作用的原理,在
缓冲系统中的弱酸 ,如甘氨酸,在接近其 pKa的pH时,任何时
候都只有一部分分子带负电,假设一种弱酸
a若某弱酸部分被解离-X,并以负离子形式存在,也可以看作
双向电泳技术
1概述 2 第一向电泳——聚焦电泳的基本原理
3第二向电泳——SDS电泳的基本原理
4双向电泳技术
5双向电泳的影响因素与解决办法
1概述
1.1双向电泳的含义
双向电泳技术(two-dimensional electrophoresis，简称2DE)
，是首先将样品在凝胶上进行一次电泳 (称为第一向)，然 后沿它的直角方向在另一凝胶上再进行电泳 (称为第二向) 。人们把这种电泳方式称为双向电泳技术或二维电泳。 在生物体内，在细胞或体液中是非常复杂的。如果按常规 的分离纯化方法将细胞内的生物分子一个一个分离来进行 研究，这个研究是漫长的，研究生物分子的数量是十分有 限的。
白质分子一旦到达它的等电点位置，分子所带净电荷为零
，就不能再迁移，如果它向等电点两侧扩散，净电荷就不
再为零，都会被阴极或阳极吸引回来，直至回到净电荷为
零的位置，因此蛋白质在与其本身pI相等的pH位置被聚焦
成窄而稳定的区带 , 如图所示。这种效应称之为“聚焦效
应”，保证了蛋白质分离的高分辨率，是等电聚焦最为突
是全部时间中X时带电
b该带电分子的泳动速率为M
c该分子在X时间内的有效泳动速率为MX d在电压梯度为V的条件下,则泳动速度为VMX e 由 于 样 品用 pH8.8的Tris-Gly Gly-解离少, 泳动率慢。 Cl-解离多, 泳动率快 若使这两种的泳动速率相等,就需施 加一定的电压。
用下形成连续的 pH 梯度，凝胶的防对流扩散作用使 pH 梯
度保持稳定。
2.3凝胶的性质 1 凝胶无筛分效应:选择交联度高,弹性好的大孔胶 2 丙烯酰胺纯度高 : 过硫酸铵和 TEMED 的用量要少 , 否则会 影响阴极端的蛋白质等电点漂移.
2.4聚焦效应 蛋白质在 pH 梯度凝胶中受电场力作用下泳动，它的分离 仅仅决定于其本身的等电点，是一个“稳态”过程。当蛋
的检测和分析。
从载体两性电解质的结构看，它既带有酸性基团(－NH3+)，又带有
碱性基团 ( － COO － ) ，即它既可接受质子，又可释放质子，反应式
如下：
／NH3+ H+ ／NH3+ OH－ ／NH2 R R R ﹨COOH ﹨COO－ ﹨COO－
两性电解质在溶液中的行为可以从两方面看，一方面溶液的pH决定
蛋白质分子中半胱氨酸残基之间的二硫键打开并不易再氧
化。在样品和凝胶中同时加入SDS和还原剂DTT后，由于
还原剂作用，蛋白质分子被解聚成组成它们的多肽链，形
成单链分子。
(3)蛋白质-SDS复合物(protein-SDS micelles)的形成：解聚 后的氨基酸侧链与SDS充分结合，形成带负电荷的蛋白质SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，与蛋白质结合后 使蛋白质丧失了原有的电荷状态，形成了仅保持原有分子 大小为特征的负离子团块，所带电荷大大超过了蛋白质分 子原有的净电荷量，从而降低或消除了各种蛋白质分子之 间天然的电荷差异。这样的蛋白质-SDS复合物在凝胶中的 迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆
棒的长度，也就是蛋白质相对分子质量的函数有关。
图 蛋白质样品在100℃用SDS和DTT处理3—5min后解聚成 单链分子并形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物