第2章从基因到基因组

第二章从基因到基因组我们可以从几个水平上解决基因和基因组的作图问题。

遗传(或者连锁)图谱(Genetic map )以重组率来确定突变之间的距离，其局限性在于它依赖于影响表型的突变。

由于重组率与位点的物理距离并不一致，因此不能准确的代表遗传物质。

连锁图谱(Linkage map)也可以通过测定基因组DNA位点的重组率获得。

这些位点有序列的改变，从而改变了被特定限制性酶切割的适应性。

这种变化非常普遍，因此无论突变是否发生，任何生物都可以获得连锁图谱。

连锁图谱的不足之处与遗传图谱相似，即相对距离依赖于重组。

限制性图谱(Restriction map)是用限制性内切酶将DNA切割成片段，然后测定片段之间的距离建立的。

它以DNA的长度来代表距离，因此为遗传物质提供了物理图谱。

限制性图谱未能确定遗传性取得独特位点，要使其与遗传图谱相联系，必须选择能影响酶切位点的突变。

基因组上较大的改变能影响限制性片段的大小和数量，易于识别。

点突变则很难被发现。

终极图谱(ultimate map)是确定DNA的序列，从序列中可以确定基因和它们间的距离。

通过分析一个DNA序列的阅读框架，可以推测它是否编码蛋白质。

这里基本的推测是自然选择阻止了编码蛋白质序列中破坏性突变的聚集。

与此相反，可以假定整个编码序列实际上很可能用来产生蛋白质。

通过比较野生型DNA和其突变型等位基因，可以确定突变的实质和它确切的位点，从而定义遗传图谱(完全依赖于突变的位点)和物理图谱(取决于DNA序列组成)的关系。

相似的技术也用于确认DNA和测序，以及基因组作图，尽管存在一定程度上的不同。

其原理是获得一系列重叠的DNA片段，能组成一个连续的图谱。

通过片之间的重叠，使每一个片段都是与另一个片段相联系，确保没有片段丢失。

这个原理也用于限制性片段排序作图以及连接片段间的序列。

遗传图谱对分析基因组和单个基因都很重要，因此我们在研究基因结构之前先简单回顾一下该原理的应用。

在下一节中，讨论在连锁图谱中的应用。

使我们了解个别基因间的分子组织及其关系，确定引起疾病的基因突变位置上。

在第三章，我们考虑基因组的整体组成以及它的基因总数量。

2.1 基因可用限制性内切酶切割作图分离DNA片段后，要获得其序列信息首先须在分子水平上建立核苷酸图谱。

任何DNA 都可以通过在限制位点将其切开，测定这些位点间的距离，从而绘制出物理图谱。

限制性内切酶(Restriction enzyme)能识别双链DNA上的特定靶序列，进行特异性切割。

每一种限制性酶切酶在DNA双链上有一个特定的靶序列，通常是由4-6个碱基组成的特定序列。

酶可在每一个靶序列出现的位点上切割。

不同的限制性内切酶识别不同的靶序列，现在可以获得多限制性内切酶(从大范围的细菌中获得)。

一个限制图谱代表特定限制酶识别靶位点的线性序列。

限制图谱中的距离直接用碱基对(简写bp)来测量，而较长的距离用kb表示，指DNA中1000个碱基对或者RNA中1000个碱基。

在染色体水平上，图谱用兆碱基对表示(1Mb=106bp)。

当一个DNA 分子用一个适当的限制酶切割时，可切成特殊的片段。

这些片段可以根据其大小通过凝胶电泳分离。

酶切后的DNA 加到琼脂糖或聚酰胺凝胶上，当电流通过凝胶时，每个片段以与其分子量相对应的速度沿着凝胶移动。

从而产生一系列条带，每一条带与片段的大小正相关，沿凝胶递减。

例如，一个5000bp 的DNA 分子与两个限制酶A 和B 一起温浴进行酶切，然后将 DNA 上样进行电泳(图2.1)。

用酶A(左)或酶B(右)酶切产生的片段大小，通过与已知大小的片段(如中间所示的对照)比较确定。

结果表明酶A 将底物DNA 切成4个片段(长度为2100，1400，1000，500bp)，酶B 将其切成三个片段(长度为2500，1300，1200bp)。

我们能运用这些数据建立一个标明DNA 限制位点图谱吗?图2.1 DNA 可被限制酶切成不同大小的片段，然后用凝胶电泳进行分离。

图2.2 通过酶切双链DNA ，可以确认一种限制酶相对另一酶的切割位点。

两个酶切割的方式可以通过几种方式确定(图2.2)。

双酶切技术中，DNA 同时用两种酶切割，如同用单一酶切一样。

最好先用酶A 或酶B 进行单酶切，分离产生的片段再用另一种酶切割，酶切产物再一次进行电泳检测。

我们可以用上述数据建立5000bp DNA 的图谱(图2.3)。

图中每一块凝胶采用图2.1中电泳分离的片段进行编号。

A-2100表示2100bp ，由酶A 酶切原始的DNA 分子产生的片段。

当该片段用酶B 消化时，被切成1900和200bp 两片段。

因此酶B 的切割位点距离最近的酶A 切割位点200bp ，距离另一个酶A 位点为1900bp(图2.3中上图所示)。

当片段B-2500用酶A 消化时，被切成1900和600bp 两片段。

因此1900bp 的片段是双切割产生的，在其一端有一个A 酶切点，另一端有一个B 酶切点。

它可以从任何一个单切片段(A-2100，B-2500)中得到。

因此这些单切片段必然在1900bp 共同区域内有重叠(图2.3中第二图所示)，在图谱右边增加了酶A 的一个切割位点。

限制图谱的关键是使用重叠片段。

因为A-2100和B-2500在中间1900bp 的区域有重叠，我们可以将1900bp 左边200bp 的A 位点与其右边600bp 的B 位点联系起来。

同样，可以继续往两端延伸图谱。

左边的200bp 也是用A 酶切B-1200bp 产生的，因此下一个B 位点应该在左边1000bp 。

右边的600bp 片段是用B 酶切A-1400产生的，因此下一个A 位点应该在右边800bp 处(图2.3中第三图)。

进一步可通过确定两端片段的来源来完成这个图谱。

在左边，1000bp 片段来自B-1200并以A-1000的形式存在，它不是由B 酶切成的，因此A-1000处于图谱的末端。

完整的5000bp 左端，1000bp 后是A 酶切点，1200bp 后是B 酶切点(这就是在图谱中没有标识B 切点的原因，尽管在分析中将这个末端当作B 切点)。

在图谱的右边，800bp 双酶切片段用A 酶切产生B-1300，因此必须在右边加上500bp 。

由酶A 单切产生的A-500可见，这就是结束片段。

至此，完整的图谱绘制完成(图2.3下图)。

图2.3 通过限制酶消化片段A 和片段B ，然后用凝胶电泳分析鉴别二者不同重叠片段的大小，即可逐级绘制限制酶切图谱。

图2.4 若能够鉴别出不同带有末端标记的片段，就可以直接确认每种酶与末段的距离。

图2.4所示为一组通过位点毗邻的限制酶消化以后产生的连续伸长的片段。

限制图谱的实际构建要求几种酶，因此需要解决由多种酶产生的重叠片段的复杂模式。

几种其他技术可用于片段比较，包括末端标记，即用一个放射性磷酸标记DNA 分子的末端(特殊的酶能特异性地在5′或者3′端加上磷酸)。

带有放射性标记的末端片段可根据其放射性标记直接进行识别(图2.4)。

因此在用酶A 处理的片段中，A-1000，A-500能被迅速地置于图谱的两端。

同样，片段B-1200和B-1300也能被确定为末端。

图2.1到图2.3中建立的整个5000bp区域的限制图谱，在图2.5中以更普遍的形式获得。

图谱表示特定限制酶切割DNA的位点，切割位点间的距离用碱基对衡量。

因此DNA 被分成一系列位于由限制酶识别位点分割的特定长度的区域。

其重要特征是任何DNA序列都可以得到限制图谱，不论是否存在突变或是否了解它们的功能。

图 2.5 限制图谱就是指酶切位点被已知距离隔开的线形DNA顺序图。

有了如图2.5这样的图谱，可以鉴别出经单酶切和双酶切所产生的片段。

图2.6 影响限制酶位点的点突变可经凝胶电泳片段大小的变化而检出。

2.2 个体基因组如何变化?依据孟德尔对基因组的观点，将等位基因分为野生型(Wild-type)和突变型。

随后我们认识到由多个等位基因存在，每一个都产生不同的表型(有些情况下，或许很难将一个基因定义为野生型)。

多个等位基因同时存在于一个基因座称为遗传多态性(Genetic polymorphism)。

任何稳定存在多等位基因的位点称为多态化。

如果一个等位基因在种群中出现的频率大于1%，就可视为多态化。

突变等位基因多态性的基础是什么呢？它们产生改变蛋白质功能的各种突变，引起突变表型。

如果我们比较限制图谱和这些等位基因的DNA序列，可发现它们也是多态性的，因为每一个图谱或序列都是不同的。

尽管在表型上并不明确，野生型自己也是多态性的。

野生型等位基因的差异可以用不影响其功能的序列变化加以区分，当然这种变化也不会引起表型差异。

一个种群可能在基因型上存在广泛的多态性。

在给定位点上可能有多个不同的序列，有些能影响表型可以发现，但另一些却无法察觉，因为他们不产生可见的效应。

因此一个座位上存在多种连续的变化，包括改变DNA序列而不改变蛋白质序列，改变蛋白质序列而不改变蛋白质功能，产生有不同活性的蛋白质以及产生没有功能的突变蛋白质。

基因组中的一些多态性可以通过比较不同基因组的限制性图谱进行检测，前提是限制酶酶切片段类型变化。

当一个靶位点在一个基因组中出现而不存在于另一个基因组中时，第一个基因组中额外的切割会产生两个片段，而第二个基因组是单独的一个片段(图2.6)。

因为限制图谱与基因功能是独立的，不论序列改变是引起表型变化，这个水平上的多态性都可被发现。

限制性位点多态性很可能几乎不影响到表型，很多涉及不影响蛋白质产生的序列改变(比如，它们处于基因之间)。

两个基因组限制图谱之间的差别称为限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)。

RFLP可以同其他标记一样作为遗传标记。

我们直接检验由限制图谱获得的基因型，而不是检测其表型的特点。

图2.7表示三个世代限制图谱之间的血缘关系，其限制图谱在DNA标记片段水平按孟德尔规律分离。

图 2.7 限制片段长度多态性(RFLP)可以按孟德尔方式遗传，四种等位基因在每代中独立地分离，但图中经限制消化后所有等位基因之间的组合在凝胶电泳中都存在。

图2.8 可用限制酶多态性作为遗传标记，测量两个重组子表型(如眼睛的颜色)所对应的遗传学距离。

图2.8中做了简化，仅将有关的等位基因列出。

重组频率也可用限制性标记和可见的表型标记来测量(图2.8)，因此一个遗传图谱可以包括基因型和表型标记。

限制性标记并不限于在影响表型的基因组变化中应用，也在分子水平提供了一种检验遗传位点的有效技术。

与已知表型相关突变的一个典型问题是，由于不知道相关的基因和蛋白质，因此难以确定相关遗传位点应放在遗传图谱的哪个位置。

很多破坏性的或致命性人类疾病属于这一类型。