第2章从基因到基因组

第二章从基因到基因组

我们可以从几个水平上解决基因和基因组的作图问题。遗传(或者连锁)图谱(Genetic map )以重组率来确定突变之间的距离，其局限性在于它依赖于影响表型的突变。由于重组率与位点的物理距离并不一致，因此不能准确的代表遗传物质。连锁图谱(Linkage map)也可以通过测定基因组DNA位点的重组率获得。这些位点有序列的改变，从而改变了被特定限制性酶切割的适应性。这种变化非常普遍，因此无论突变是否发生，任何生物都可以获得连锁图谱。连锁图谱的不足之处与遗传图谱相似，即相对距离依赖于重组。

限制性图谱(Restriction map)是用限制性内切酶将DNA切割成片段，然后测定片段之间的距离建立的。它以DNA的长度来代表距离，因此为遗传物质提供了物理图谱。限制性图谱未能确定遗传性取得独特位点，要使其与遗传图谱相联系，必须选择能影响酶切位点的突变。基因组上较大的改变能影响限制性片段的大小和数量，易于识别。点突变则很难被发现。

终极图谱(ultimate map)是确定DNA的序列，从序列中可以确定基因和它们间的距离。通过分析一个DNA序列的阅读框架，可以推测它是否编码蛋白质。这里基本的推测是自然选择阻止了编码蛋白质序列中破坏性突变的聚集。与此相反，可以假定整个编码序列实际上很可能用来产生蛋白质。

通过比较野生型DNA和其突变型等位基因，可以确定突变的实质和它确切的位点，从而定义遗传图谱(完全依赖于突变的位点)和物理图谱(取决于DNA序列组成)的关系。

相似的技术也用于确认DNA和测序，以及基因组作图，尽管存在一定程度上的不同。其原理是获得一系列重叠的DNA片段，能组成一个连续的图谱。通过片之间的重叠，使每一个片段都是与另一个片段相联系，确保没有片段丢失。这个原理也用于限制性片段排序作图以及连接片段间的序列。

遗传图谱对分析基因组和单个基因都很重要，因此我们在研究基因结构之前先简单回顾一下该原理的应用。在下一节中，讨论在连锁图谱中的应用。使我们了解个别基因间的分子组织及其关系，确定引起疾病的基因突变位置上。在第三章，我们考虑基因组的整体组成以及它的基因总数量。

2.1 基因可用限制性内切酶切割作图

分离DNA片段后，要获得其序列信息首先须在分子水平上建立核苷酸图谱。任何DNA 都可以通过在限制位点将其切开，测定这些位点间的距离，从而绘制出物理图谱。限制性内切酶(Restriction enzyme)能识别双链DNA上的特定靶序列，进行特异性切割。每一种限制性酶切酶在DNA双链上有一个特定的靶序列，通常是由4-6个碱基组成的特定序列。酶可在每一个靶序列出现的位点上切割。不同的限制性内切酶识别不同的靶序列，现在可以获得多限制性内切酶(从大范围的细菌中获得)。

一个限制图谱代表特定限制酶识别靶位点的线性序列。限制图谱中的距离直接用碱基对(简写bp)来测量，而较长的距离用kb表示，指DNA中1000个碱基对或者RNA中1000

个碱基。在染色体水平上，图谱用兆碱基对表示(1Mb=106bp)。

当一个DNA 分子用一个适当的限制酶切割时，可切成特殊的片段。这些片段可以根据其大小通过凝胶电泳分离。酶切后的DNA 加到琼脂糖或聚酰胺凝胶上，当电流通过凝胶时，每个片段以与其分子量相对应的速度沿着凝胶移动。从而产生一系列条带，每一条带与片段的大小正相关，沿凝胶递减。

例如，一个5000bp 的DNA 分子与两个限制酶A 和B 一起温浴进行酶切，然后将 DNA 上样进行电泳(图2.1)。用酶A(左)或酶B(右)酶切产生的片段大小，通过与已知大小的片段(如中间所示的对照)比较确定。结果表明酶A 将底物DNA 切成4个片段(长度为2100，1400，1000，500bp)，酶B 将其切成三个片段(长度为2500，1300，1200bp)。我们能运用这些数据建立一个标明DNA 限制位点图谱吗?

图2.1 DNA 可被限制酶切成不同大小的片段，然

后用凝胶电泳进行分离。 图2.2 通过酶切双链DNA ，可以确认一种限制酶相对另一酶的切割位点。

两个酶切割的方式可以通过几种方式确定(图2.2)。双酶切技术中，DNA 同时用两种酶切割，如同用单一酶切一样。最好先用酶A 或酶B 进行单酶切，分离产生的片段再用另一种酶切割，酶切产物再一次进行电泳检测。

我们可以用上述数据建立5000bp DNA 的图谱(图2.3)。图中每一块凝胶采用图2.1中电泳分离的片段进行编号。A-2100表示2100bp ，由酶A 酶切原始的DNA 分子产生的片段。当该片段用酶B 消化时，被切成1900和200bp 两片段。因此酶B 的切割位点距离最近的酶A 切割位点200bp ，距离另一个酶A 位点为1900bp(图2.3中上图所示)。

当片段B-2500用酶A 消化时，被切成1900和600bp 两片段。因此1900bp 的片段是双切割产生的，在其一端有一个A 酶切点，另一端有一个B 酶切点。它可以从任何一个单切片段(A-2100，B-2500)中得到。因此这些单切片段必然在1900bp 共同区域内有重叠(图

2.3中第二图所示)，在图谱右边增加了酶A 的一个切割位点。

限制图谱的关键是使用重叠片段。因为A-2100和B-2500在中间1900bp 的区域有重叠，我们可以将1900bp 左边200bp 的A 位点与其右边600bp 的B 位点联系起来。同样，可以继续往两端延伸图谱。左边的200bp 也是用A 酶切B-1200bp 产生的，因此下一个B 位点应该在左边1000bp 。右边的600bp 片段是用B 酶切A-1400产生的，因此下一个A 位点应该在右边800bp 处(图2.3中第三图)。

进一步可通过确定两端片段的来源来完成这个图谱。在左边，1000bp 片段来自B-1200并以A-1000的形式存在，它不是由B 酶切成的，因此A-1000处于图谱的末端。完整的5000bp 左端，1000bp 后是A 酶切点，1200bp 后是B 酶切点(这就是在图谱中没有标识B 切点的原因，尽管在分析中将这个末端当作B 切点)。在图谱的右边，800bp 双酶切片段用A 酶切产生B-1300，因此必须在右边加上500bp 。由酶A 单切产生的A-500可见，这就是结束片段。至此，完整的图谱绘制完成(图2.3下图)。

图2.3 通过限制酶消化片段A 和片段B ，然后用

凝胶电泳分析鉴别二者不同重叠片段的大小，即

可逐级绘制限制酶切图谱。

图2.4 若能够鉴别出不同带有末端标记的片段，就可以直接确认每种酶与末段的距离。图2.4所示为一组通过位点毗邻的限制酶消化以后产生的连续伸长的片段。

限制图谱的实际构建要求几种酶，因此需要解决由多种酶产生的重叠片段的复杂模式。几种其他技术可用于片段比较，包括末端标记，即用一个放射性磷酸标记DNA 分子的末端(特殊的酶能特异性地在5′或者3′端加上磷酸)。带有放射性标记的末端片段可根据其放射性标记直接进行识别(图2.4)。因此在用酶A 处理的片段中，A-1000，A-500能被迅速地置于图谱的两端。同样，片段B-1200和B-1300也能被确定为末端。

图2.1到图2.3中建立的整个5000bp区域的限制图谱，在图2.5中以更普遍的形式获得。图谱表示特定限制酶切割DNA的位点，切割位点间的距离用碱基对衡量。因此DNA 被分成一系列位于由限制酶识别位点分割的特定长度的区域。其重要特征是任何DNA序列都可以得到限制图谱，不论是否存在突变或是否了解它们的功能。

图 2.5 限制图谱就是指酶切位点被已知距离隔开的线形DNA顺序图。有了如图2.5这样的图谱，可以鉴别出经单酶切和双酶切所产生的片段。图2.6 影响限制酶位点的点突变可经凝胶电泳片段大小的变化而检出。

2.2 个体基因组如何变化?

依据孟德尔对基因组的观点，将等位基因分为野生型(Wild-type)和突变型。随后我们认识到由多个等位基因存在，每一个都产生不同的表型(有些情况下，或许很难将一个基因定义为野生型)。

多个等位基因同时存在于一个基因座称为遗传多态性(Genetic polymorphism)。任何稳定存在多等位基因的位点称为多态化。如果一个等位基因在种群中出现的频率大于1%，就可视为多态化。

突变等位基因多态性的基础是什么呢？它们产生改变蛋白质功能的各种突变，引起突变表型。如果我们比较限制图谱和这些等位基因的DNA序列，可发现它们也是多态性的，因为每一个图谱或序列都是不同的。

尽管在表型上并不明确，野生型自己也是多态性的。野生型等位基因的差异可以用不影响其功能的序列变化加以区分，当然这种变化也不会引起表型差异。一个种群可能在基因型上存在广泛的多态性。在给定位点上可能有多个不同的序列，有些能影响表型可以发

现，但另一些却无法察觉，因为他们不产生可见的效应。

因此一个座位上存在多种连续的变化，包括改变DNA序列而不改变蛋白质序列，改变蛋白质序列而不改变蛋白质功能，产生有不同活性的蛋白质以及产生没有功能的突变蛋白质。

基因组中的一些多态性可以通过比较不同基因组的限制性图谱进行检测，前提是限制酶酶切片段类型变化。当一个靶位点在一个基因组中出现而不存在于另一个基因组中时，第一个基因组中额外的切割会产生两个片段，而第二个基因组是单独的一个片段(图2.6)。

因为限制图谱与基因功能是独立的，不论序列改变是引起表型变化，这个水平上的多态性都可被发现。限制性位点多态性很可能几乎不影响到表型，很多涉及不影响蛋白质产生的序列改变(比如，它们处于基因之间)。

两个基因组限制图谱之间的差别称为限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)。RFLP可以同其他标记一样作为遗传标记。我们直接检验由限制图谱获得的基因型，而不是检测其表型的特点。图2.7表示三个世代限制图谱之间的血缘关系，其限制图谱在DNA标记片段水平按孟德尔规律分离。

图 2.7 限制片段长度多态性(RFLP)可以按孟德尔方式遗传，四种等位基因在每代中独立地分离，但图中经限制消化后所有等位基因之间的组合在凝胶电泳中都存在。图2.8 可用限制酶多态性作为遗传标记，测量两个重组子表型(如眼睛的颜色)所对应的遗传学距离。图2.8中做了简化，仅将有关的等位基因列出。

重组频率也可用限制性标记和可见的表型标记来测量(图2.8)，因此一个遗传图谱可以包括基因型和表型标记。

限制性标记并不限于在影响表型的基因组变化中应用，也在分子水平提供了一种检验遗传位点的有效技术。与已知表型相关突变的一个典型问题是，由于不知道相关的基因和

蛋白质，因此难以确定相关遗传位点应放在遗传图谱的哪个位置。很多破坏性的或致命性人类疾病属于这一类型。比如包囊纤维化表现孟德尔遗传，但是在该基因详细鉴定之前，这个突变功能的分子实质一直是未知的。

如果限制酶多态性在基因组中自由发生，则有些会在特定基因附近产生。我们可以确定这样的限制性标记，因为该标记与突变表型密切相关。如果比较患病者的和正常人的DNA限制图谱，可能发现一个特定的限制性位点通常出现(或者丢失)在患者DNA中，原因是限制性标记与表型间100%相关。它暗示限制性标记与突变基因距离很紧，以至于它们在重组中不能分离。

限制性标记的判定由两个重要作用:

?为发现疾病提供了诊断过程。有些遗传描述详细但是分子机制描述困难的人类疾病很难诊断，如果一个限制性片段与表型可靠地相关，那么它的存在可用来诊断该种疾病，无论是在出生以前还是出生后。

?为分离基因提供依据。如果两个位点很少或者从不重组，在遗传图谱中限制性片段应该距离基因相对很近。尽管遗传中“相对很近”用DNA碱基对表示可能是有一定距离，但它提供了一个使我们沿着DNA找到基因的起点。

RELPs在人类基因组内发生非常频繁，对遗传作图是很有用。如果等位基因序列在两条染色上，其在个别碱基对上发生频率是1/1000bp。这些影响限制性位点的碱基变化可通过RELPs检测出来(图2.9)。

一旦把RELP分配到一个连锁群，即可置于遗传图谱上，并且与其两则标记的距离可以确定。人和鼠RELP的建立，使人们构建了两个相应基因的组连锁图。人类图谱包括超过5000个相距1.6cM(1-2Mb)的标记，鼠具有超过7000个相距0.2cM(200kb)的标记。任何不清楚的位点可以通过与这些位点的连锁检测出来，从而迅速的绘于图谱上。

多态性的频率意味着每个个体有独特的限制性位点。在特殊区域发现的位点重组称为单一型(Haplotype)。单一型概念最初用于描述主要组织兼容性座位(编码在免疫系统中很重要的蛋白质区域，见第24章)的遗传组成。现在延伸到描述基因组限定区域的等位基因或限制性位点(或者任何其他遗传标记)的特殊重组。

RELPs的存在为建立不均等亲代-子代关系的技术提供了基础。如果亲本不能确定，比较可能亲本和子代适当染色体区域内RFLPs图谱，就可找到它们之间确切的关系。使用DNA限制性分析确认个体被称为DNA指纹技术(Fingerprinting)。我们将在第四章中详细介绍使用小卫星序列的差别进行人类基因组作图。

2.3 真核基因是割裂基因

真核基因被分子作图鉴定之前，我们假定它们与原核基因有相同的组织形式，认为原核基因包括一段与蛋白质线形关联的DNA。但是DNA结构与相应mRNA比较表明，在很多情况下并非如此。mRNA通常包含依照遗传密码子与蛋白质产物恰好符合的核苷酸序列，但是基因却包含位于编码区的额外序列，将代表蛋白质的序列割裂。

割裂基因DNA序列可分为两大类(图2.10)，外显子(Exon)是在成熟RNA中出现的序

列。根据定义，一个基因以外显子起始和结束，与RNA的5′和3′端相对应。内含子(Intron)是插入的序列，在初始转录本加工时被切除，从而产生成熟RNA。

图 2.9 如果某限制性标记与一个表型相关，则该限制酶位点必定位于决定此表型的基因附近。图中，突变将正常人普遍存在的带转换成病人中普遍存在的带。图2-10 有内含子的基因首先转录成RNA前体，之后内含子被去除，外显子被拼接到一起。成熟的mRNA只含有外显子序列。

割裂基因的表达需要一些在非割裂基因中不存在的额外步骤。DNA产生一个RNA拷贝(一个转录本)，正好代表基因组序列。但是这个RNA只是一个前体，它不能用于产生蛋白质。首先内含子必须从RNA中移走，从而产生只包含一系列外显子的信使RNA，这个过程称为RNA剪接(RNA splicing)。剪接涉及内含子从原始转录本(Transcript)中的精确删除，外显子两端连接形成一个共价分子(我们将在第22章讨论剪接的原理和调控)。

结构基因(Structural gene)是指基因组中与成熟mRNA 5′和3′端之间相对应的区域。转录从mRNA的5′端起始延伸到3′端，在经RNA剪接产生(见第22章)。基因的范围可以扩大到包括基因两端激活或终止基因表达的调节区域。

如何改变我们对基因的观点呢？内含子剪切后，外显子以其在基因上的顺序连接起来，因此基因和蛋白质的线性关联在独立的外显子和蛋白质的相应的部分仍然保留，基因中的突变顺序与蛋白质中氨基酸替换保持一致。但是基因间的距离和蛋白质内的距离不再一致，基因的长度用前体RNA的长度衡量，而不是用mRNA的长度定义。

所有外显子都出现在一个RNA分子上，并且剪接只是作为分子间的反应发生。通常没有来自不同RNA分子上的外显子发生剪接，这种机制排除了任何代表不同等位基因序列之间的剪接。因此处于一个基因上不同外显子的突变不能互补另一个外显子上的突变，故尔被认为是一个互补群的成员。

内含子突变会产生什么后果呢？由于内含子不是信使RNA的一部分，其突变不直接

影响蛋白质的结构。但通过阻止外显子的剪接，能够阻止信使RNA的产生。这种突变只作用于携带它的等位基因，因此不能与该等位基因上其他突变互补，并且是外显子互补群的一部分。

真核基因并不一定都是割裂的，有些用原核基因中同样的方式与蛋白质产物直接对应。在酵母中，大多数基因是连续基因。高等真核基因大多是割裂基因，并且内含子比外显子长，使基因比其编码区域长得多。

2.4 割裂基因的组织结构可能保守

无内含子基因，其DNA的限制图谱与mRNA的图谱是一一对应的(通过比较反转录的cDNA确定)。

当一个基因具有内含子的时，其末尾的图谱与信使RNA的末尾图谱相同，但基因图谱并非不一致，因为基因中有额外的部分，并不与信使RNA一致，非一致区域即内含子。图2.11比较了β-珠蛋白基因和mRNA的限制图谱。其中有两个内含子，每一内含子包含一些cDNA中不存在的限制性位点。但是外显子和cDNA中限制性位点的模式相同。

图2.11 比较鼠β-珠蛋白的cDNA和基因组DNA 的限制图谱可以看到，β-珠蛋白的基因内有两个内含子，外显子可直接与cDNA的序列相对应。图2.12 内含子是在基因中存在但在mRNA中不存在的序列。图中阅读框以明蓝和暗蓝相间排列的小块儿表示，需要注意的是，能导致阅读框关闭的三个终止密码都在内含子中。

比较基因和cDNA的序列，可精确的定义内含子。在弄清基因片段之前，序列水平的比较是必须的。如果含有不合适的限制性位点，短的内含子和外显子可能在限制图谱中缺失(如果内含子在长的外显子之中，可能不会被发现：而一段小于50bp的外显子则不能和cDNA探针杂交，从而在内含子中难以发现)。但是序列比较并不明显(图2.12)，处于编码

区的内含子通常会打断一个读码框的整体性，但在cDNA中，通常会发现完整的读码框。

对原核基因不同结构，尚没有特定的原因解释。有些基因是连续的，因此基因序列和mRNA线性关联。大多数高等原核基因是割裂的，但是内含子在数量和大小上变化非常大。核基因的内含子一般在读码框上有终止密码子，因而无编码功能。

所有类型的基因都可能是割裂基因，包括编码蛋白质的核基因，编码rRNA的核基因，以及编码tRNA的基因。在低等真核生物中，线粒体也存在割裂基因。割裂基因在细菌和细菌噬菌体中也已发现，尽管在原核基因组中是很少见。

有些割裂基因只有一个或少数几个内含子。珠蛋白基因便是很好的例子(见第四章)。珠蛋白基因有α和β两种类型，二者具有相同的结构。哺乳类珠蛋白基因的一致性为珠蛋白家族基因结构提供了例证(图2.13)。

图2.13 有功能的珠蛋白基因都是含有三个外显子的不连续基因。图中所示的序列长度适用于哺乳动物的β-珠蛋白基因。图2.14 不同哺乳动物的二氢叶酸还原酶基因结构有相似性—外显子短内含子长，但内含子之间的长短差异很大。

在所有已知的活性珠蛋白基因中，包括哺乳、鸟类和两栖类，割裂发生在非常同源的位置(与编码区相关)。第一个内含子通常很短，第二个一般比较长，其实际长度有所变化。但多数不同珠蛋白基因间的长度变化是第二个内含子长度变化引起。在小鼠中，α-珠蛋白的第二个内含子只有150bp，基因总长度为850bp，而主要β-珠蛋白为1382bp。因此基因长度的变化比mRNAs长度变化范围要大得多(α-珠蛋白mRNA为585个碱基对，β-珠蛋白mRNA为620个碱基对)。

比较大的基因，如二氢叶酸还原酶(Dihydrofolate reductase，DHFR)。哺乳DHFR基因含有与2000bp mRNA相对应的6个外显子(图2.14)，但是它们延伸成一条更长的DNA，因为内含子非常长。在三种哺乳动物中，外显子是一样的，内含子相对的位置发生了改变，但是个别外显子的长度变化很大，使基因长度变化范围为25到31kb。

珠蛋白质和DHFR代表了一种普遍的现象：与进化相关的基因其组织结构非常相似，至少有一些内含子的位置是保守的。基因长度的变化主要由内含子的长度决定。

2.5 外显子序列保守，内含子序列多变

结构基因在其基因组中是独特的吗？答案可能是模棱两可的。整个基因的长度是独特的，但其外显子通常与其它基因外显子相关。一般而言，当两个基因是相关的，它们外显子的关系比内含子的关系更紧密。在特殊情况下，两个基因的外显子可能编码同一个蛋白质，但其内含子可能不同。说明这两个基因可能起源于一个共同的祖先基因，拷贝间内含子差异积累，但因编码蛋白质功能的需要，其外显子区域是保守。

外显子可能是基因进化的基石，它们可以通过不同的方式进行组合。一个基因可能含有几个与其他基因相关的外显子，但也存在一些并不相关的外显子。一般而言，此时其内含子也不相关。这些基因可能是由同一些外显子经复制和转移产生的。

两个基因的相似性可用点阵作图进行比较(图2.15)。一个点表明该位置上基因的序列相同。如果两个序列完全相同，则点组成一条45度的直线。若存在不相似区，则直线会被打断，并且另一个相关序列的缺失或插入会使其平行或垂直地被替换。

比较小鼠β-珠蛋白基因时，直线延伸过三个外显子和一个小的内含子，但在两端和大内含子中消失。这种类型较普遍，编码区域相关密切，而其长内含子和基因两端相似性消失。

两个外显子总差异程度与蛋白质间的差异相关。在翻译区域，外显子需要编码氨基酸，在此限制下，其变异的可能性很小。但许多改变并不影响密码子的意义，如将一个密码子变成另一个密码依旧代表同一个氨基酸。在非翻译区(与mRNA5′引导区和3′结尾区相一致)，变异发生会有更大自由空间。

内含子趋异的模式也包括大小的变化(由插入和缺失产生)以及碱基组成。内含子比外显子进化快。当不同种间的基因进行比较，有时其外显子同源，而内含子间变化巨大，甚至不存在任何相关序列。

外显子和内含子中突变率是相同的，但在外显子中逆向选择使突变被更有效地剔除。如此相反，内含子不受编码功能的限制，其自由积累点突变和其他变异更快。这暗示内含子没有序列特意性功能，其存在对基因是否是必要的目前尚无定论。

2.6 可利用保守的外显子分离基因

鉴定基因的主要方法大都以外显子的保守性和内含子的多变性比较为基础。一个功能在不同种内是保守的基因，其代表的蛋白质序列应该有两个性质：具有一个开放读框，并与其他种属有相关的序列。这些特点可以用来分离基因。

遗传学的研究已经证明，基因处于特定的染色体上。试想，如果我们缺少有关基因产物实质基本知识，如何鉴定在如此之大区域(>1Mb)上存在的基因呢？

我们可以从这个区域周围的一个克隆开始，沿着染色体这个区域步移(Chromosome

Walking)，从文库中鉴定重复基因(如图2.16)。第一个克隆的一个小片段用来分离在染色体中延伸的克隆，这些克隆反过来又用来分离下一个系列。因为其限制图谱一端是与前一个克隆一致，另一端携有新的序列，因此在每一个循环中，都会选出一个新的克隆。如此步行百kb是有可能的，步行速率一般每个月超过100kb。染色体步行可将染色体中大的连续区域从基因文库中筛选出来。

图2.15 鼠βmaj和βmin珠蛋白基因编码区的序列很相似，但编码区的侧翼序列和大内含子序列的差异却很大。图2.16 染色体步移通常是通过基因组克隆重叠区的连续杂交进行的(每一新克隆的图谱一端带重叠区另一端带有新序列区域)。

当然，如果染色体的全部序列被确定，鉴定一个独特的基因就更加容易。可从染色体步行中获得的连续系列克隆进行测序，或者通过其他方式(比如直接比较序列)使克隆相联系。若序列已知，基因可以通过比较其RNA或蛋白质产物来确定，或者通过序列中的一个突变进性鉴定。

同时，在获得所有序列信息以前，成功鉴定一个有药物开发价值基因的有效方法，是在一定染色体区域搜寻小片段中保守基因应具有的两个性质。首先，寻找能够与其它物种杂交的片段，然后检查这些片段的读码框。

首先，使用动物标记和染色体步行获得的短片段(放射性标记的)作为探针，通过Southern杂交从不同物种中检测相关蛋白质。若发现几个物种杂交片段与探针相关(探针通常来自人类)，探针就可作为探测基因外显子的候选者。这个“候选者”测序后，如果包含开放读框，就用来分离周围的基因组区域。如果看似内含子的一部分，就可用它们来鉴定整个基因，分离相应的cDNA或mRNA，最终鉴定其蛋白质，这种方法称为zoo blot。

上述方法对鉴定那些遗传上暗示存在但其实质未知的基因来说是宝贵的。一个例子是利用位于人Y 染色体上的zfy 基因作探针，与其它动物的性染色体杂交的结果(图2.17)，该探针能与哺乳动物和其他种类的性染色体特异性杂交，含有开放读框，用于鉴定一个保守基因。

图2.17 示利用人Y 染色体上的zfy 基因做探针与

其它动物的性染色体杂交的结果。 图2.18 假肥大型肌营养不良(DMD)的基因定位过程如下：通过不断的染色体步移，作图，直至找

到突变后能引起疾病的区域。

当目标基因含有很多大的外显子且很长时，Zoo blot 方法特别有用。假肥大型(Duchenne)肌肉营养不良(DMD ，一种肌肉退化失调症)基因鉴定，就是其中一例(图2.18)。DMD 基因与X 染色体连锁，并影响1/3500男子出生。

连锁分析表明DMD 位点位于X 染色体Xp21条带上。患DMD 疾病的病人通常在该条带上产生DNA 重排(Rearrangement)。通过比较X-连锁DNA 探针与患者DNA 和正常人的杂交能力，可以获得重排或患者体内相关的克隆片段。

染色体步移用来建立探针两端的限制性图谱，范围可超过100kb 的区域。通过对一系列患者中获得的DNA 分析，确定该区域有一很大缺失，并在两个方向上延伸。最值得一提的是，缺失切除了一个对基因功能很重要的片段，并且该基因或至少基因的一部分包含在这个区域内。

基因在染色体上的大致区域确定后，我们需要鉴定它的内含子和外显子。采用zoo blot 方法确定了与小鼠X 染色体和其他哺乳动物DNA 杂交的片段(图2.19)，详细检查片段内

是否存在开放读框和典型的内含子-外显子边界序列。将符合这些标准的片段作为探针，进一步在肌肉mRNA 构建的 cDNA 文库中检测同源序列。

图2.19 通过Zoo-Blotting ，cDNA 杂交，基因组杂

交，蛋白质分析，DMD 基因得以定性。 图2.20 一个特殊的外显子捕获载体。若待捕获的某基因组片段含有一个外显子，那么此外显子

必定能在细胞质mRNA 中表现出来，但前提是该

基因组片段含且仅含有一个内含子。

杂交筛选鉴定了一个与基因cDNA 相关、非同寻常的大mRNA ，约14kb 。与基因组杂交表明，这个mRNA 含 60个以上得外显子，处于一条大于2000kb 的DNA 上，是目前已知DNA 中鉴定为最长的基因，其长度是其他已知基因的10倍。这个基因编码一个大约500kD 的蛋白质，称为营养不良蛋白质(Dystrophin)，是肌肉的成分之一，但其含量甚微。所有DMD 患者在这个位点上都有缺失或无效，并且影响营养不良蛋白质功能。

另一种在遗传片段上迅速找到外显子的方法是外显子捕获(Exon trapping)技术(图

2.20)。该技术从一个携带强启动子，在两个外显子间仅有一个内含子的载体开始。用这种载体转染细胞时，其转录产生大量含有两个外显子序列的RNA 。内含子上有一个限制性克隆位点，用来插入一段感兴趣区域的片段。如果这个片段不包括外显子，那么剪接模式不会改变，并且RNA 仅包含亲本载体一样的序列。当插入片段具有由两部分内含子包围的外显子时，其两端的剪接点就会被识别，将外显子序列插入到载体外显子之间的RNA 中。所获得的RNA 可通过逆转录成cDNA ，使用PCR 扩增载体两个外显子之间的序列进行检测。因此若能扩增出来自目标片段的序列，则表明外显子被捕获。由于动物细胞中内含子通常很大而外显子很小，基因组DNA 可能含有这种所需要的结构，即一个外显子两端被部分内含子包围是有可能的。

2.7 基因大小差别迥异

割裂基因的存在可能是基因比其编码的蛋白质大得多的一个证据。基因大小增加时，其内含子可能会变得很大，而外显子却保持很小。一般而言，编码蛋白的外显子常常很(图2.21)。大多数外显子编码区少于100个氨基酸(在脊椎动物中通常小于50个)，总体分布与基因通过缓慢增加编码蛋白质小结构域单位进行进化(见后)的观点一致。在不同物种中，除了脊椎动物中明显的大外显子缺失外，外显子大小没有显著差别(在真菌和两栖类编码大于300个氨基酸的外显子，大都代表非割裂基因，即由一个外显子组成的基因)。在基因5’和3’非编码区也发现一些大的外显子(图中没有包括)。

图2.21 编码蛋白的外显子常常很短。图 2.22 脊椎动物基因中内含子大小差别十分明

显。

内含子一般比外显子长(图2.22)，其长度分布从与外显子相似(<200bp)到10kb以上，在极端情况下，长度可以达50-60kb。

不同真核生物，如酵母、昆虫和哺乳动物中，基因的总体组织形式也不尽相同(图2.23)。在酿酒酵母中，大部分基因(>96%)是非割裂基因，而包含外显子的部分通常很紧凑。实际上，酿酒酵母基因中通常少于4个外显子。

与此相反，在昆虫和哺乳动物中，只有一小部分基因是非割裂编码序列(哺乳动物中<6%)。昆虫基因含较少的外显子，通常少于10个。哺乳动物基因被割裂成更多的片段，有些含十几个外显子，大约50%的基因有超过10个内含子。

真核生物基因总体大小产别迥异，特别是酵母和高等真核生物存在显著差别(图2.24)。

酵母基因平均1.4kb长，只有少部分基因大于5kb。相反，果蝇和哺乳动物中大多数基因长度在5kb到100kb之间，只有少部分基因小于2kb。

图2.23 酵母大多数基因为非割裂基因，但果蝇和哺乳动物的基因绝大多数是割裂的(非断裂基因只有一个外显子，图中最左边的红色柱形图)。图2.24 酵母基因常常很小，但果蝇和哺乳动物基因大小散乱分布，差别很大。

大多数连续基因到割裂基因的转变发生在低等真核生物中。在真菌(除酵母以外)，大多数基因割裂的，但其外显子数目较少(<6)且很短(<5kb)。长基因的转变发生在高等真核生物中，特别是昆虫基因长度变得相当大。或者在基因变大的同时，基因组复杂性或物种复杂性的关系随之丢失。

特长基因是含长内含子造成的，并非需要编码长产物的结果。在高等真核生物中，基因大小和mRNA大小间没有关联，并且基因大小和外显子数目间也不存在密切关系。因此，基因的大小主要决定于其内含子的长度。在哺乳动物、昆虫以及鸟类中，基因的平均大小是其mRNA的五倍。

2.8 有些DNA序列编码多种蛋白质

大多数由一条DNA序列组成的基因，仅有编码一种蛋白质的功能(尽管基因在两端有非编码区，并且在编码区内有内含子)。但是，有些情况下，一条序列编码不止一种蛋白质。重叠基因(Overlapping gene)，指一个基因是另一个的一部分，发生在一些相对简单情况下。基因的一半(或另一半)独立地编码一种蛋白质，代表由整个基因编码蛋白质的一半(或者是另一半)。最终结果如同在对蛋白质产生特定切割，使其形成一半长度以及全长的形式(图2.25)。

当两个不同源的蛋白质需要同样一段DNA序列时，两个基因以一种更罕见的方式重叠。当同一DNA序列以一种以上读码框翻译时，就是如此。在细胞基因中，一段DNA序列通常只用三种可能方式之一阅读其读码框，但在一些病毒或线粒体基因中，也存在基因两种不同读码框之间的重叠(图2.26)。重叠间的距离通常很短，因此大多数代表蛋白质的序列保留了其独特的编码功能。

图2.25 由于读码位点的不同，两种蛋白可以由一个基因编码。图2.26 两个基因也可能因阅读框的不同而表达出同种蛋白。

有些基因中，基因的选择性表达方式(Alternative pattern)可改变其外显子连接途径，使一个基因可能产生许多mRNA产物，它们之间有不同外显子。外显子或被保留或被剪切掉(或者被当作突变排除掉)，二者其一被保留但不是全部。结果产生一部分相同而另一部分不同的蛋白质。图 2.27给出了选择性剪接(Alternative splicing)导致一个外显子在mRNA出现而在另一些中mRNA缺失的例子(由选择性剪接产生的其他类型的组合将在22章中讨论)。两种剪接方式。第一种方式除去两个内含，3个外显子连接在一起。第二种剪接中，外显子2未被识别，因此一个大的内含子被剪切掉。这个大内含子包括内含子1、外显子2和内含子2。实际上，在这剪接中外显子2被认为是内含子的一部分。这两种剪接途径产生了两端相同的两种蛋白质，但一种蛋白质在中间部分有额外的序列。因此这个DNA序列编码不止一种蛋白质。

有时两种剪接途径同时进行，每一种方式剪切一部分RNA；有时两种方式替换，在不同情况下采取不同的剪接方式，一个细胞类型中有一种剪接方式，而另一种细胞类型中采取另一剪接方式。

在某些情况下，选择性剪接并不影响蛋白质的序列。比如，只改变5′和3′非编码区，但会产生相同的蛋白质。在另一些情况下，也会发生一个外显子被另一个外显子代替现象(图2.28)。在这个例子中，两种mRNA翻译的蛋白质包含大段重叠序列，但其选择性剪接

区域是不同的。大鼠肌钙蛋白(Troponin) T基因的3′端包括5个外显子，但只有四个用于mRNA的构建。虽然三个外显子——WXZ表达模式一致，但上边模式中α外显子被剪接到XZ之间，而下边模式中β外显子被剪接到XZ之间。因此α型和β型肌钙蛋白T在序列WZ之间的氨基酸序列不同，取决于α和β外显子的替换模式。两者中的任何一个都可以形成独立的mRNA，但是二者不能同时用于一个mRNA中。

图2.27 选择性拼接是利用同一个RNA前体经不

图2.28 选择性拼接产生α型和β型肌钙蛋白。同的外显子组合而产生不同的mRNA。

因此选择性(或者不同的)剪接能从一个DNA序列中产生有重叠的蛋白质。高等真核基因组占据空间很大，其基因大而分散，从一个序列中可以产生多个产物正是其关键所在。很难具体说有多少基因具有选择性表达模式，估计数目大概在小百分比范围。

2.9 割裂基因是如何进化而来的?

现在割裂基因的原始形式是怎样的呢? 目前有两种模型，“内含子占先(Introns early)”模型支持内含子总是基因的整体部分。认为基因起始于割裂的结构，没有内含子的基因是在进化过程中丢失的。“内含子滞后(Introns late)”模型认为原始蛋白质编码单位由非割裂的DNA序列组成，内含子是随后插入进去的。

检验这些模型的方法是明确真核和原核基因的区别，是否等同于真核基因中内含子的获得或者原核基因中内含子的丢失。

内含子占先模型表明，基因的镶嵌结构是基因重组从而产生新蛋白质的一种原始方法。试想，早期细胞有许多不同的蛋白质编码区域，其进化的一个方面很可能是不同多肽链单位重新组合和并列，从而产生新的蛋白质。

如果蛋白质编码单位必须是连续的密码子序列，重新创造这种序列将需要精确的DNA 重组，从而使两个蛋白质编码单位并列，以同样的读码框头尾相接。并且，如果这种重组没有成功，却失去了原始的蛋白质编码单位，细胞必然受到破坏。

但是如果DNA重组能将两个蛋白质编码单元置于一个转录单位中，剪接模式将在RNA水平上获得突破，从而将两种蛋白质放在一条多肽链中。而且如果重组并不成功，原始的蛋白质编码单位仍能被应用。这种方法必然使细胞尝试限制RNA删除，而不至于在此过程中引起DNA稳定性破坏。

如果现在的蛋白质通过组合本来就分离的原始蛋白质来进化，单元增长很可能在随后的一段时间内发生，每次增加一个外显子。放置在一起的基因，可以从它们的结构中判断其不同功能吗？换言之，我们能够将当前蛋白质与个别外显子等同起来吗？

某些情况下，基因结构与蛋白质之间有明显的关系。一个很好的例子是免疫球蛋白，它是由每一个外显子与已知的蛋白功能区域相对应的基因编码的(图2.29)。免疫球蛋白是两条轻链和两条重链组成的四聚体，它们一起产生了具有几个不同区域的蛋白质。轻链和重链的结构不同，并且有几种类型的重链。每一类型的链都是由一系列的外显子表达的，外显子与蛋白质的结构域相一致。

图2.29 免疫球蛋白的重链和轻链基因的结构与其编码蛋白的结构域直接对应，每个蛋白的结构域对应一

个外显子。图中1-5为外显子。

有很多基因的外显子能够被确认有特定的功能。在分泌蛋白质中，第一个外显子编码多肽的N端结构域，能够识别跨膜分泌中涉及的信号序列，如胰岛素基因。

有时基因进化涉及外显子的复制，从而在蛋白质中产生整体复制的序列。例如，鸡胶原蛋白质的54bp外显子被多次复制，产生一系列54bp或其整数倍的外显子。

只有少部分相关基因间相同的序列可能代表外显子，这些外显子可在基因间转移或重新集结(Recruit)。例如人类膜低浓度脂蛋白(Plasma low density liproptein，LDL)受体和其他蛋白质的关系(图 2.30)。LDL受体基因中有一系列的外显子，它们与表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)前体基因外显子相关。在蛋白质的N端，一系列外显子编

码与血液中C9补体(Complement factor)相关的序列。因此LDL受体基因是由广泛的功能单元重组而获得，这些单元也在其它蛋白质中使用。

图2.30 低密度脂蛋白(LDL)受体基因由18个外显子构成，其中一部分外显子参与编码表皮生长因子(EGF)的前体，还有一部分参与编码了C9血液补体。图中三角表示内含子的位置。注意在基因水平只有一部分外显子与表皮生长因子EGF前体中的待加工氨基酸顺序的位置完全相同。图2.31 珠蛋白基因的结构与其蛋白的结构域相对应，但是豆血红蛋白在其与结构域对应的区域却多了一个外显子。

在已知基因中，外显子和蛋白质的关系有时是不稳定的。有些情况下具有明确的1:1关系，但在其他情况下则未发现固定的模式。一种可能是内含子移除是与两端相邻的外显子是融合的。这就意味着这些内含子必须精确地移开，不改变编码区的完整性。另一种方式是某些内含子由插入连续的区域产生，但是携带的内含子还具有被剪切掉的能力。

外显子一般都很小(见图2.20)，能够形成稳定折叠结构的最小多肽大约是20-40个氨基酸残基。很有可能蛋白质原本就是由这样小的结构单元组合而成。每个单元不需要与当前功能相关，或许几个单元一起产生一种功能。一般而言，基因中外显子的数量随着蛋白质长度的增加而增加，这与蛋白质通过连续增加适当的单元获得多种功能的观点一致。

这个观点能够说明蛋白质结构的另一个特点：代表外显子-内含子边界的位点通常位于蛋白质的表面。随着编码单元被加入到蛋白质中，连接物，至少是最新加入的单元，很可能位于蛋白质表面。

保守进化的一个有趣例子是珠蛋白(见图2.13)，每个基因有三个外显子。两个内含子位于与编码区相邻的稳定位点上。中间的外显子代表珠蛋白链的血红素-结合域，α-和β-珠蛋白具有相似的结构。

解释这种结构的另一种观点可由与珠蛋白相关的其他两种蛋白质提供。肌球蛋白(Myoglobin)是动物中结合氧的蛋白质单体，它的氨基酸序列揭示了珠蛋白亚基的一个普遍

(但是古老)的起源。豆血红蛋白(Leghemoglobin)是豆科植物中氧-结合蛋白质，同肌球蛋白一样也是单体。它们与其他血红素结合蛋白具有共同的起源。珠蛋白、肌球蛋白和豆血红蛋白一起组成了珠蛋白超家族(Super family)——从同一个远古祖先遗传下来的基因家族。

肌球蛋白由人类基因组中单个基因编码，其结构与珠蛋白基因是一致的。三外显子结构说明了肌球蛋白和珠蛋白功能分离的进化。

豆血红蛋白包括三个内含子，第一个和最后一个位于与珠蛋白基因两个内含子位置同源的编码序列边缘位点。这种明显的相似性说明它可能是血红素结合蛋白以分裂基因出现的远古祖先(图2.31)。

豆血红蛋白中央的内含子使两个外显子分离，这两个外显子一起编码与珠蛋白中间外显子编码的对应序列。珠蛋白中央外显子可能来自于祖先基因的两个中间外显子融合吗？或者单个的中间基因就是祖先基因的形式呢？在这种情况下，一个内含子必须在植物进化开始就插入到基因内。

同源基因有不同的结构，这为它们的进化提供了线索，例如胰岛素基因(图2.32)。哺乳动物和鸟类，除啮齿动物外都只有一条胰岛素基因。比较不同物种相关基因组织结构的原理是，共同的特征可能暗示着两个物种进化分离的基因结构。在鸡中，一个胰岛素基因有两个内含子；小鼠中两个胰岛素基因，其中一个基因与鸡胰岛素有相同的结构。相同的结构暗示胰岛素祖先基因有两个内含子。但是，小鼠的第二个胰岛素基因只有一个内含子，必定由啮齿动物相关基因复制进化而来，复制中伴随着其拷贝中一个内含子被精确剔除。某些基因的组织形式说明了种属间差异巨大。在这些情况下，进化中必然有内含子的大量剔除和插入。

图2.32 小鼠(rat)胰岛素基因有Ⅰ、Ⅱ两种，Ⅱ型基因是Ⅰ型基因丢掉一个内含子而形成的。图2.33 各种生物之间肌动蛋白基因结构差别很大。图2中紫色小块儿代表内含子位点，最上方的数字表示被内含子阻断的密码子位置。