微生物的分离与培养技术原理及其应用

土壤“纤维素分解菌”的分离与筛 选 土壤“尿素分解菌”的分离与计数
稀释涂布平板法
【实验设计】
土壤取样
什么样的环 境取样?
选择培养*
①选择培养的目的? ②液体培养基
样品稀释 （梯度稀释）
挑选产生透明 圈的菌落
将样品涂布到鉴别纤维 素分解菌的培养基上
（2）分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误 的是（ ） 样品稀释（梯度稀释） 后将样品涂布在鉴别纤维素分
大肠杆菌的分离纯化培养
（三）分离纯化后培养
无菌落产生
有菌落产生
未接种培养基 接种培养基
（三）分离纯化后培养
1、对照培养方法：将 。 未接种培养基和已接种培养基都放入适 宜温度恒温箱中培养适宜时间观察结果 2、对照培养结果： 若未接种培养基上 无菌落产生 ，
接种培养基上 有菌落产生，且菌落颜色、 形状、大小基本一致并符合 ， 大肠杆菌菌落特点 则说明符合要求。
大肠杆菌的分离纯化培养
（二）分离纯化大肠杆菌 方法一、平板划线法
方法一、平板划线法
甲
丙
乙
单菌落
方法二、稀释涂布平板法 （一）系列稀释操作
移液管
101
102
103
104
105
106
移液管吸取菌液稀释时，轻压橡皮头，吹吸三次 的目的是？
使菌液与水充分混匀
（二）涂布平板操作
【例题2】 微生物的分离和培养是现代生物 工程应用中的重要环节。据此回答：
A
A.经选择培养 解菌的培养基上
B.选培养这一步可省略，但培养的纤维素分解
菌少
C.经稀释涂布培养后，用刚果红染色
D.对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维
素的培养基上
【实验设计】
土壤取样
什么样的环 境取样?
选择培养*
①选择培养的目的? ②液体培养基
样品稀释 （梯度稀释）
观察菌落
统计菌落数 计数细菌数
将样品涂布在选择尿素 分解菌的培养基上
同种微生物菌落特征：颜色、形状、大小、 隆起程度（突起）、边缘等方面基本一致， 这些都是区分细菌的重要手段。
土壤“尿素分解菌”的分离与计数
【样品稀释】 【平板涂布】
【统计菌落】
【计数菌数】
【样品稀释】
90mL无菌水 9mL无菌水
9mL无菌水
用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数， 在对应稀释倍数为106的培养基中，几位同学分别得 到以下几种统计结果： A同学：涂布了一个平板，统计的菌落数是230 B同学：涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260 ，取平均值238
【例题1】为了获得β-胡萝卜素产品,某小组开 展了产β-胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。 请回答下列问题： （4）为了将分离到菌株纯化,挑取菌落在3块 相同平板上划线,结果其中一块平板各划线区 接种环温度过高， 均未见菌生长，最可能原因是 。 菌被杀死 （5）为增加β-胡萝卜素提取量，在研磨酵母 细胞时，添加石英砂的目的是 研磨充分 ；研 磨时
上一次划线的末端开始划线，原因是 末端细菌数目比起始端少 ____________________，多次划线的目的 是 使细菌数目随划线次数增加逐渐减少， 。 以便分离得到单菌落
（7）右图是某同学修正丙操作后的正确的“微生物平 板划线”示意图。划线顺序为1→2→3→4→5。下列有 关叙述中正确的是（ D ）
×
×
× √
平板划线法
稀释涂布平板法
研究者得到一个经培养后菌落分布如图 所示的平板，推测接种时可能的操作失 误？ 涂布不均匀
（5）每次划线前和划线后，接种环都要通过 灼烧灭菌，完成右图丙的划线操作，
6 共需灼烧接种环________ 次。灼烧接种环之
后，要冷却后再进行划线操作的原因 是 以免接种环温度过高，杀死菌种 。 （6）第二次以及其后的划线操作时，总是从
安全阀 压力表
放气阀
排气软管 灭菌桶 高压蒸汽灭菌锅
【例题1】为了获得β-胡萝卜素产品,某小组开 展了产β-胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。 请回答下列问题： (3)右图是灭菌锅及其局部剖面示意图，图 中甲、乙、丙依次是 ① 。(填序号) ①安全阀、放气阀、压力表 ②放气阀、安全阀、压力表 ③安全阀、放气阀、温度表 ④放气阀、安全阀、温度
√
C同学：涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、 212和256，取平均值163 D同学：涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、 240和480，取平均值310
E同学：涂布了三个平板，统计的菌落数分别是210、 240和250，取平均值233
【平板涂布与菌落统计】
90mL无菌水 9mL无菌水 9mL无菌水 0.1mL 0.1mL 0.1mL
不加尿素的培养基（对照组）与尿素选择培养基都接种后同时培养， 对照组培养基细菌不生长，菌落数目明显少于选择培养基（实验组） 的数目，说明起到了筛选、选择作用。
90mL无菌水 9mL无菌水 9mL无菌水 0.1mL 0.1mL 0.1mL 240个
如何根据平板上统计的平均菌落数推测计数 出原来每克样品中的活菌数（菌株数）？
不加凝固剂
工业生产
成分
成分不明确的 工业生产 天然物质 成分明确已知 分离、纯化、
用途 PH要求。 功能
鉴定、计数 加入某种化学 分离筛选特定 选择培养基 物质 微生物 鉴别培养基 加入某种指示 鉴别不同微生 试剂 物
合成培养基
需分离 微生物
选择培 鉴别培养 养基 基
鉴定原理
尿素作 酚红指 细菌合成的脲酶将尿素分 尿素 解生成氨。使培养基的碱 分解菌 为唯一 示剂 氮源 性增强，pH升高，指示剂 变红 纤维素 纤维素 刚果红 刚果红与培养基中的纤维素形成红 分解菌 作为唯 染色法 色复合物。当纤维素被纤维素酶分 解后，刚果红—纤维素复合物不能 一碳源 大肠 杆菌 一般 培养 基 伊红美 蓝培养 基 大肠杆菌菌落呈现黑色,， 带有金属光泽
灼烧灭菌
3、锥形瓶、培养皿： 干热灭菌和高压蒸 汽灭菌（湿热灭菌） 4、培养基： 高压蒸汽灭菌 (不能采用干热灭菌)
【例题1】为了获得β-胡萝卜素产品,某小组开 展了产β-胡萝卜素酵母的筛选与色素提取实验。 请回答下列问题：
（1）实验用的培养皿常用的两种灭菌方法是 干热灭菌和高压蒸 ；为了防止冷凝水渗入 汽灭菌（湿热灭菌） 及减少灭菌后器皿或培养基被污染，灭菌前应 该 牛皮纸或几层报纸包扎紧 。 (2)为了筛选出酵母菌,培养基中添加了青霉素 ，其目的是 抑制细菌生长 。
形成（或红色消失），培养基中出 现以纤维素分解菌为中心的透明圈。
四种纤维素分解菌 在刚果红培养基上 形成的透明圈
大肠杆菌在伊红美蓝琼 脂培养基上的黑色带金 属光泽的菌落
二、 操作技术 无菌 ——微生物分离培养成功关键（消毒与灭菌） 1、实验操作者双手： 70%酒精消毒 2、接种环、接种针或试管口、瓶口：
2016届高三生物二轮复习
一、培养基的营养构成与类型划分
营养构成 划分依据 培养基 种类 制备方法 用途
水、无机 物理 盐、碳源 性质 和氮源
还要满足特
殊营养物质 化学 （生长因 子）、氧气 以及温度、
分离、纯化、 加凝固剂如：鉴定、计数 固体培养基 半固体 观察微生物运 琼脂
培养基 液体 培养基 天然 培养基 动
某一稀释度下的 每克样品中 平均菌落数（C） ×稀释倍数 菌株数＝ （M） 涂布平板时所 用的稀释液体 积 mL （V）
每克样品中的活菌数＝(C÷V)×M
（1）甲操作称为 倒平板 ，指出乙、丙操作的 错误：乙未在酒精灯火焰附近（旁）划线 ， 丙 最后一区域划线与第一区域相连 。 （2）判断：固体培养基上由一个细胞繁殖而 来的肉眼可见的子细胞群体叫做 菌落 ，属于 生命系统的 种群 层次。
（3）判断： 稀释度足够高的 ①不同浓度的菌液均可在培养基表面形成单个 的菌落（ ） 口 ②打开含菌种的试管需通过火焰灭菌（ ） ③溶化时将称好的牛肉膏从称量纸上直接倒入 烧杯（ ） 连同称量纸一同 ④熔化琼脂时，需要用玻璃棒不断搅拌以防止 糊底（ ） （4）分散细菌得到单菌落 稀释涂布平板法 法 比 法效果更好。 平板划线法
至少涂布3个平板；菌落数目在30-300个之 间的平板最适宜计数
设置对照实验
判断选择培养基中是否有杂菌污染：
未接种培养基（对照组）与接种培养基同时进行培养， 若对照组无菌落生长，说明培养基未被杂菌污染。
判断选择培养基是否具有筛选作用：
牛肉膏蛋白胨培养基（对照组）与尿素选择培养基都接种后同时培 养，观察两种培养基上菌落数目，若对照组培养基菌落数目明显大 于选择培养基（实验组）的数目，说明起到了筛选、选择作用。
不需要 (填“需要”或“不需要”) β-胡萝卜素较耐酸 添加CaCO3，理由是 。 （较稳定）
大肠杆菌的分离纯ห้องสมุดไป่ตู้培养
（一）制备牛肉膏蛋白胨固体培养基
计算称量 溶化(调节PH) 灭菌
倒平板（50℃）
倒平板（50℃）
倒平板（50℃）
打开一条缝隙
平板倒置 平板冷凝
防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染； 使培养基表面的水分更好地挥发