仔猪肠道微生物菌群的研究-新版
仔猪肠道菌群的建立与影响因素
*通讯作者[摘要]肠道菌群生态平衡是猪营养、生理和免疫功能的基础。
然而,在猪的生长发育过程中,菌群在肠道内定植和分布受到各种因素的影响,包括分娩环境、日粮成分、抗生素或其他替抗物的使用等。
本文主要从仔猪肠道菌群的形成规律、影响因素和营养调控措施等方面论述了仔猪肠道菌群与仔猪肠道健康或疾病的关系,旨在为绿色健康养殖方面研究提供帮助。
[关键词]肠道菌群;仔猪;影响因素;调控措施[中图分类号]S811.6[文献标识码]A[文章编号]1004-3314(2019)03-0004-06仔猪肠道菌群的建立与影响因素侍宝路*,王计伟,刘春雪(安佑生物科技集团股份有限公司,江苏太仓215437)仔猪肠道微生物生态系统的形成是一个动态的过程,新生仔猪从母体及分娩环境中获得胃肠道菌系并形成相对稳定的微生态环境(Chen 等,2018);但在断奶阶段,由于断奶引起的一系列应激反应及日粮成分改变,使肠道内微生态环境发生剧烈变化(Gresse 等,2017)。
本文从仔猪肠道菌群的形成规律、影响因素和调控措施等方面,阐述仔猪肠道微生物与仔猪健康或疾病的关系,旨在为绿色健康养殖研究提供帮助。
1仔猪肠道菌群的定植过程仔猪刚出生便有微生物进入胃肠道中,在消化道内的定植顺序首先是需氧菌,然后是兼性厌氧菌,最后才是专性厌氧菌;而仔猪不同生长阶段,其肠道内菌群也会随之发生变化。
1.1哺乳期仔猪肠道菌群的定植初生仔猪肠道定植菌群最先来源于母猪阴道和胃肠道。
在不被干扰的情况下,首先定植的是大肠杆菌(E.coli )和链球菌(Streptococcus )等需氧性菌群,消耗肠道中氧气,为随后而来的拟杆菌(Bacteroides )、双歧杆菌(Bifdobacterium )、梭菌(Clostridium )和乳杆菌(Lactobacillus )的定植创造厌氧条件(Petri 等,2010;Konstantinov 等,2006)。
在出生12h 内,每克结肠内容物细菌数量可达109~1010,其中兼性厌氧菌以大肠菌群为主,但在48h 后被专性厌氧菌所取代,后者在结肠微生物菌落中占比达90%(Swords 等,1993)。
莱芜仔猪肠道菌群组成初步分析
试验研究202310263莱芜仔猪肠道菌群组成初步分析崔景香1,赵纳杰1,孙小桉1,张寒松1,郑乾坤2(1.潍坊科技学院,山东寿光 262700;2.得利斯集团有限公司,山东诸城 262200)摘要:猪的肠道菌群组成与种类及健康状态密切相关,研究健康、品种优良的猪的肠道菌群组成对于养猪业的发展具有积极意义。
本研究采用16S rRNA 高通量测序方法对10日龄莱芜哺乳仔猪腹泻仔猪的粪便进行测序分析。
结果显示,健康仔猪共有优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes )、变形菌门(Proteobacteria )和拟杆菌门(Bacteroidetes ),共有优势菌属为乳杆菌属(Lactobacillus );腹泻仔猪共有优势菌门为厚壁菌门(Firmicutes )、拟杆菌门(Bacteroidetes ),共有优势菌属为乳杆菌属(Lactobacillus )。
此外,两组比较,Lactobacillus 、Escherichia-Shigella 、Prevotella _9、Fusobacterium 、Prevotellaceae 属在腹泻仔猪组丰度水平高,而Acinetobacter 、Jeotgalibaca 、Treponema _2、Psychrobacter 属在健康仔猪组丰度水平高。
本研究结果为莱芜猪肠道菌群多样性研究提供基础数据,并为后期调节肠道菌群、促进猪的健康成长提供参考依据。
关键词:莱芜猪;腹泻仔猪肠道菌群;16S 高通量测序中图分类号:S828.5 文献标志码:B 文章编号:1003-8655(2023)10-0001-03莱芜猪是山东省特有的地方猪种,具有高繁殖力、肉质好、耐粗饲和抗病力强等特性。
其中高抗病力特点更是备受关注。
该仔猪肠道微生物菌群相对稳定,断奶应激反应相对较小,对常见致病细菌和病毒所引起的腹泻具有很强的抗病性。
尽管如此,莱芜仔猪轻度腹泻常有发生,这估计和其肠道菌群异常有关,并直接影响到后期猪的生长速度和主要经济性状。
肠道微生物区系对断奶仔猪肠道黏膜免疫功能的调节作用研究进展
肠道微生物区系对断奶仔猪肠道黏膜免疫功能的调节作用研究进展陈逸;董丽;喻礼怀【摘要】断奶仔猪肠道中定植了大量微生物,这些微生物及其代谢产物可参与断奶仔猪的肠道黏膜免疫过程.肠道微生物对断奶仔猪肠道黏膜免疫的调节机制主要是通过TLRs和NLRs通路分子分别发生作用.本文对肠道黏膜免疫的特点及断奶仔猪肠道微生物区系的组成进行了综述,并深入探讨了肠道微生物对断奶仔猪肠道黏膜免疫功能的调节作用,以及肠道微生物对肠道黏膜免疫系统调控的潜在机制,旨在为进一步利用断奶仔猪肠道黏膜免疫维持机体健康的相关研究提供参考.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2019(000)013【总页数】4页(P9-12)【关键词】肠道微生物;猪;肠道;黏膜免疫【作者】陈逸;董丽;喻礼怀【作者单位】扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州 225009;扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州 225009;扬州大学动物科学与技术学院,江苏扬州 225009【正文语种】中文【中图分类】S811.2肠道黏膜是仔猪体内最大的黏膜免疫器官,而仔猪肠道微生物区系和肠道黏膜免疫的相互作用机制非常复杂。
断奶仔猪肠道中一些微生物的数量在发生变化,例如肠道食糜中的乳酸菌数量级从1×107~9cfu/g 下降至8.5×106~7cfu/g 左右,并且此前处于肠道中优势地位的厌氧菌群也出现不同程度的减少,同时,由饲料携带的外源菌开始入侵,使仔猪肠道内的大肠杆菌、沙门菌等致病菌数量增加;仔猪断奶后1~3周内,仔猪肠道开始适应饲料,微生物区系开始重新排列,并逐渐形成新的平衡(姜春阳等,2016;李德发,2003)。
肠道微生物刺激了肠道黏膜免疫的正常发育,实现了对断奶仔猪肠道黏膜免疫的调节作用(王文娟,2005)。
1 断奶仔猪肠道黏膜免疫的特点1.1 肠道黏膜免疫肠道黏膜免疫是动物体最重要的自身免疫行为之一,主要由肠相关淋巴组织(GALT)构成,GALT主要由诱导位点和效应位点产生效用,而正常肠道之所以能够将大量的细菌及有害物质有效地局限于肠道中,就是因为肠道黏膜免疫系统通过诱导位点和效应位点的细胞共同发挥生理效应,从而实现有效的、多层次的免疫防护功能。
运用454焦磷酸测序技术对断奶前后仔猪肠道菌群的分析
摘 要 :本研 究 旨在运 用 4 5 4焦磷 酸 测 序 技 术分 析 断 奶 前 后 仔 猪 肠 道 菌 群 的 变化 。 随 机 选 取 胎 次和 出生 时 间相 近 的 、 体 重差 异 不 显著 的健 康 “ 杜 X长 ×大 ” 外 三 元新 生 仔 猪 l 2头用 于 试验 。
整个 试验 期 间 由母 猪按 常规 哺 乳 直 到 断奶 ( 2 5 日龄 ) , 母 猪 饲 粮 不合 有 抗 生 素 , 仔猪 于 1 2 日龄
有 减 少的趋 势 ( P> 0 . 0 5 ) , 而 Ne g a t i v i c u t e s 纲、 E r y s i p e l o t r i c h i a纲 和 未 知 厚 壁 菌纲 含 量 有 增加 的 趋势 ( P>0 . 0 5 ) 。从 门到属 的水 平 , 断奶前 后 仔 猪 肠道 菌群 相对 丰 度 不 同 , 有 些 菌是 断奶 前仔 猪 肠道特有的, 如 嗜胆 菌属 ( B i l o p h i l a ) 、 具核梭杆 菌属 ( F u s o b a c t e r i u m n u c l e a t u m) 、 黄 杆 菌属 ( F l a —
群 多样 性 增 加 ; 肠 道 中拟 杆 茵 门 ( B a c t e r o i d e t e s ) 含 量 变化 不 显 著 ( P>0 . 0 5 ) , 厚壁 菌 门( F i r mi —
c u t e s ) 含 量 显著 增 加 了 6 3 . 9 5 %( P< 0 . 0 5 ) , 梭 杆 菌 门( F u s o b a c t e r i a ) 和 变形 茵 门( P r o t e o b a c t e r i a )
至 死亡 , 给 养 猪 生 产 造 成 巨 大 经 济 损 失 。断 奶 应 激 对肠 道 的 影 响 最 大 , 肠 道 形 态 结 构 和 功 能 都 受
27149434_仔猪肠道微生物群的发育、功能和调控
仔猪肠道微生物群的发育、功能和调控徐运杰 1,2,3,刘加娥 2,苏双良 1,刘曰清 1(1.山东和美集团有限公司,山东 惠民 251700;2.德州和美饲料有限公司,山东 德州 253500;3.唐人神集团股份有限公司,湖南 株洲 412000)微生物体系是一个特殊的生态系统,微生物种群包括腐生微生物、共生微生物和致病微生物。
一般来说,包括猪在内的动物胃肠道主要由共生菌和过渡菌(包括病原体)相互作用组成。
分娩时,新生儿接触一系列微生物,这种初始暴露形成了肠道微生物群的基础。
宿主机体的各个部位如体表、消化道、鼻腔和泌尿生殖道都是微生物群的生态位点,它们有自己独有的微生物特征,在宿主新陈代谢、维持胃肠道健康稳定、免疫调节和神经系统发育中起着非常重要的作用。
因此,后代的健康在很大程度上取决于其接触的微生物。
对人的研究表明,生命的第一年是微生物获得和发展的最关键时期,在这段时间,微生物群的破坏会造成炎症性肠道疾病、坏死性结肠炎、湿疹、肥胖、自身免疫性疾病、哮喘和自闭症等胃肠道或全身性疾病。
这些发现说明了肠道微生物群的力量,并引发了人们通过最佳初始定植培育健康微生物群可以改善健康和限制疾病的想法。
寻找改善农场动物健康的新方法值得养猪行业的特别关注,因为仔猪断奶前后的死亡率是行业面临的一个主要问题,行业平均水平约为15%。
借鉴对人类早期微生物定植与胃肠道健康之间关系的理作者简介:徐运杰(1980-),男,湖南邵阳人,硕士研究生,主攻动物营养与饲料科学,在大型饲料企业从事饲料配方和质量管理工作10余年。
联系电话:180****6768,E-mail :********************解,有理由认为培育健康的肠道微生物群有助于仔猪的存活和健康。
1 微生物群的获得1.1 产前微生物的获得长期以来,人们认为动物的胃肠道在分娩前是无菌的,当胎儿从子宫羊膜囊内的无菌环境通过产道过渡到微生物密集的外界环境时,微生物群的发育就开始了。
仔猪生物饲料消化率及肠道主要菌群数量测定研究
黑龙江八一农垦大学研究生课程论文研究生课程论文论文题目: 仔猪生物饲料消化率及肠道主要菌群数量测定课程名称: 动物营养研究方法 任课教师: 张 爱 忠 研究生姓名: 王 建 勇 学 号: xs1233069 专业(领域): 动物营养与饲料科学 研究生类别: 学术型研究生注:请任课教师用红色笔批阅论文。
仔猪生物饲料消化率及肠道主要菌群数量测定研究王建勇摘要:为了探讨微生物制剂在早期断奶仔猪日粮中的应用效果,为大量开发绿色饲料,减少和废除抗生素作为常规添加剂,实现安全标准化生产,采用“3×3”拉丁方设计,在基础日粮一致的条件下,对照抗生素和微生物制剂对仔猪日粮营养成分的消化率、改善仔猪肠道的微生物菌群和提高生长速度,预防拉稀等的影响。
结果显示3种日粮中蛋白质的表观消化率、净利用率和生物学价值,粗脂肪表观消化率以及粗纤维差异不显著(P>0.05);钙消化率1方、2方和基础方间形成极显著差异(P<0.01),1方和2方间差异不显著;总磷消化率1方与2方、基础方间形成显著差异(P<0.05),2方和基础方间差异不显著(P>0.05);灰分消化率2方与基础方间差异显著(P<0.05),1方与2方、基础方间差异不显著(P>0.05);回肠和盲肠内容物中的芽孢杆菌、酵母菌、大肠杆菌和乳酸菌数量2方中的4种菌数量与1方和基础方差异极显著(P<0.01,1方与基础料方间也形成极显著差异(P<0.01)。
关键词:生物制剂;饲料消化率;菌群数量前言生产中,为了预防早期断奶仔猪的腹泻和减少因环境变化造成的应激,缩短非适应期,日粮中常采用添加各种抗生素的办法,用量和种类越来越大越来越多,致使仔猪的抗药性也不断增强,遇有疾病时,对药物的敏感性降低,疗效不佳[1]。
长期使用抗生素对环境的污染相当严重。
利用活菌制剂、酶制剂等活性物质作为仔猪防病促生长添加剂取代普遍使用的量大、种类多的抗生素,是近几年来猪营养和饲料研究的新型生物产品[2]。
断奶仔猪肠道菌群结构特征及其调控研究进展
动物营养学报2020,32(11):4998⁃5005ChineseJournalofAnimalNutrition㊀doi:10.3969/j.issn.1006⁃267x.2020.11.003断奶仔猪肠道菌群结构特征及其调控研究进展王文文1,2㊀王㊀园1,2∗㊀安晓萍1,2㊀齐景伟1,2(1.内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特010018;2.内蒙古自治区草食家畜饲料工程技术研究中心,呼和浩特010018)摘㊀要:仔猪断奶腹泻是由断奶应激引起的一系列复杂生理变化所致,是导致仔猪死亡的主要原因㊂大量研究显示,肠道菌群结构紊乱普遍发生于腹泻仔猪中,通过调节肠道菌群结构可以缓解仔猪断奶腹泻㊂因此,本文就断奶前后仔猪肠道菌群结构变化㊁断奶腹泻仔猪肠道菌群结构特征及其调控措施进行了综述,以期为缓解和阻止仔猪断奶腹泻提供理论参考㊂关键词:断奶仔猪;腹泻;肠道菌群;高通量测序技术中图分类号:S828㊀㊀㊀㊀文献标识码:A㊀㊀㊀㊀文章编号:1006⁃267X(2020)11⁃4998⁃08收稿日期:2020-03-31基金项目:国家自然科学基金项目(31601969);内蒙古自治区研究生科研创新项目(S2018111985Z);内蒙古农业大学 双一流 学科创新人才培养计划项目(NDSC2018⁃04);内蒙古自治区科技重大专项(ZD20190039)作者简介:王文文(1993 ),女,内蒙古呼和浩特人,博士研究生,从事生物饲料的研发与应用研究㊂E⁃mail:wangwenwen2017@emails.imau.edu.cn∗通信作者:王㊀园,讲师,E⁃mail:wangyuan.926@163.com㊀㊀仔猪早期断奶技术可以提高生产效率,是养猪业重要的饲养管理技术之一㊂然而早期断奶会产生应激,发生断奶应激综合征,损害仔猪健康,给猪生产造成了巨大的经济损失㊂断奶应激综合征中最为严重的是腹泻问题㊂仔猪断奶腹泻的病因呈现交叉性,断奶应激是导致仔猪腹泻的根本原因,微生物感染是继发性病因㊂近年来研究发现,不论是何种原因导致的仔猪断奶腹泻都会引起肠道菌群多样性下降和结构改变㊂稳定的肠道菌群不仅可以阻止产肠毒素大肠杆菌(enterotoxi⁃genicEscherichiacoli,ETEC)㊁艰难梭菌(Clostridi⁃umdifficile)㊁鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi⁃murium)等致腹泻性病原菌的定植[1],还在调控动物机体健康中发挥着重要作用,如营养物质消化㊁免疫应答㊁肠道屏障㊁肠肌反射及内分泌等多种生理活动[2]㊂一旦肠道菌群结构紊乱,就会引起菌群易位㊁细胞凋亡㊁肠道通透性增加㊁炎症及肠道功能紊乱等不良反应,进而导致腹泻㊁生长性能下降甚至死亡㊂随着测序技术的普及,采用高通量测序技术研究仔猪肠道菌群已成为热点㊂目前,主要通过饲粮干预的方式调控肠道菌群结构,进而缓解仔猪断奶腹泻,也有科研人员尝试通过粪菌移植(fecalmicrobiotatransplantation,FMT)的方式调节肠道菌群结构,这对 减抗 和 禁抗 有重要意义㊂因此,本文将从断奶前后仔猪肠道菌群结构变化㊁断奶腹泻仔猪肠道菌群结构特征及其调控措施等方面加以综述㊂1 肠道菌群在调控肠道健康中的作用㊀㊀肠道菌群是肠道的重要组成部分,与营养物质代谢㊁肠道屏障功能和免疫应答等密切相关,直接影响动物健康㊂肠道菌群以不能被宿主内源酶消化的饲料残渣为底物,其中纤维类物质可被拟杆菌属(Bacteroides)㊁瘤胃球菌属(Ruminococ⁃cus)㊁柔嫩梭菌属(Faecalibacteriumprausnitzi)及罗斯氏菌属(Roseburia)等肠道菌降解产生短链脂肪酸(SCFAs),为肠上皮细胞供能[3];蛋白质可被梭菌属(Clostridium)㊁链球菌属(Streptococcus)及乳杆菌属(Lactobacillus)等肠道菌降解为小肽和氨基酸,进而被宿主利用[4]㊂此外,唾液乳杆菌11期王文文等:断奶仔猪肠道菌群结构特征及其调控研究进展(Lactobacillussalivarius)可分泌胆酸盐水解酶,调节胆汁酸代谢,进而影响脂类的利用[5]㊂除参与营养物质代谢外,肠道菌群还可通过直接和间接2种方式抑制致病菌的增殖,阻止其入侵和大量繁殖㊂肠道菌群的直接抑菌机理为:与致病菌竞争营养物质,某些肠道菌群可以分泌唾液酸酶,利用与结肠黏蛋白2共价连接的低聚糖,释放唾液酸获得能量,而沙门氏菌(Salmonella)和Clostridiumdifficile无法分泌唾液酸酶[1,6]㊂另外,肠道菌群定植可诱导白细胞介素-22(interleukin⁃22,IL⁃22)的产生,IL⁃22可增强宿主肠道黏液的糖基化修饰,从而促进考拉杆菌属(Phascolarctobacterium)的生长,而Phascolarctobacterium可与Clostridiumdiffi⁃cile竞争琥珀酸盐以抑制后者定植[7]㊂肠道菌群的间接抑菌机理为:调节肠上皮功能和激活先天免疫及适应性免疫,可以通过分泌细菌素㊁抗菌肽[8]㊁次级胆汁酸[9]及细胞接触依赖性抑制结构(Ⅵ型分泌系统)[10]等方式实现㊂格氏乳酸杆菌(Lactobacillusgasseri)LA39和弗氏乳酸杆菌(Lactobacillusfrumenti)可分泌gassericinA细菌素,通过靶向调控仔猪肠上皮功能来发挥腹泻抗性,从而阻止断奶腹泻的发生[11]㊂2㊀断奶对仔猪肠道菌群结构的影响㊀㊀新生仔猪肠道菌群的定植在出生后立即开始,此后随着肠腔环境改变㊁饲粮结构调整以及断奶应激的发生,肠道内特定菌群的定植位点发生转变,菌群结构也发生变化㊂最初的定植者是来自母体和环境中的微生物,大多是需氧或兼性厌氧细菌,如大肠杆菌(Escherichiacoli)㊁福氏志贺菌(Shigellaflexnerii)和Streptococcus㊂这些细菌消耗氧气,从而创造一个有利于厌氧菌生长的厌氧环境,如Bacteroides㊁Clostridium㊁双歧杆菌属(Bifidobacterium)和Lactobacillus,最终抑制需氧菌的定植[12-13]㊂仔猪肠道寄居的细菌主要有五大类(门水平),分别为厚壁菌门(Firmicutes)㊁拟杆菌门(Bacteroidetes)㊁变形菌门(Proteobacteria)㊁螺旋菌门(Spirochaetes)和柔膜菌门(Tenericutes),其中Firmicutes和Bacteroidetes为优势菌门㊂断奶不会影响门水平上细菌的种类,但会改变其相对丰度,主要是由Firmicutes向Bacteroidetes转变[14]㊂然而在科和属水平上,断奶前后发生了显著的变化,拟杆菌科(Bacteroidaceae)㊁韦荣球菌科(Veillonellaceae)㊁梭菌科(Clostridiaceae)㊁肠球菌科(Enterococcaceae)和Bacteroides为断奶前仔猪肠道的优势菌,而乳杆菌科(Lactobacillaceae)㊁毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)㊁瘤胃球菌科(Rumino⁃coccaceae)㊁肠杆菌科(Enterobacteriaceae)㊁普雷沃菌科(Prevotellaceae)㊁普雷沃菌属(Prevotella)㊁Lactobacillus和Clostridium为断奶后仔猪肠道的优势菌[15-17]㊂断奶后Enterobacteriaceae(包含ETEC和Salmonellatyphimurium)的相对丰度增加,会导致腹泻和炎症[16]㊂另外,Bacteroides的相对丰度降低[14]㊂肠道菌群与仔猪是共生关系,任何时候肠道菌群种类和数量变化都有可能导致肠道菌群紊乱,影响机体正常的生理活动,发生疾病㊂Bacteroides具有促进派伊尔小结的B淋巴细胞分化产生免疫球蛋白A(IgA)+细胞的作用,产生分泌型免疫球蛋白A(sIgA)参与肠道黏膜免疫反应,抵抗致病菌的入侵[18],断奶后Bacteroides的相对丰度降低,导致sIgA含量降低,进而导致仔猪免疫力下降,这可能与断奶腹泻的发生有关㊂3㊀断奶腹泻仔猪的肠道菌群结构特征㊀㊀一般认为,仔猪肠道菌群结构紊乱容易引起腹泻,而腹泻又会加重肠道菌群结构的紊乱㊂研究发现,断奶腹泻仔猪的肠道菌群结构异常,主要表现为多样性下降,致病菌相对丰度增加,共生菌相对丰度降低㊂通过采用平板计数法对特定细菌进行测定后发现,腹泻仔猪粪便中总细菌㊁Bifidobacterium及Lactobacillus的数量降低,Esch⁃erichiacoli的数量有增加的趋势[19]㊂近年来研究发现,腹泻不会影响Firmicutes和Bacteroidetes的主导地位,但会降低Bacteroidetes的相对丰度[20],增加疣微菌门(Verrucomicrobia)和Proteobacteria的相对丰度[21]㊂Verrucomicrobia会降低黏蛋白的分泌,而黏蛋白可在肠道表面形成一层黏液层抵抗致病菌入侵[22]㊂Proteobacteria中包括Esche⁃richiacoli㊁螺杆菌属(Helicobacter)㊁弯曲菌属(Campylobacter)及Salmonella等致病菌属,其相对丰度的增加可能会加剧腹泻㊂在属水平上,克雷伯氏菌属(Klebsiella)㊁Lactobacillus和埃希氏-志贺菌属(Escherichia⁃Shigella)相对丰度升高,Bacteroides㊁Lachnoclostridium及Ruminococcus相对丰度下降,其中Escherichia⁃Shigella和Klebsiella均为致病菌㊂Bacteroides和Ruminococcus均为纤9994㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报32卷维降解菌,其相对丰度的降低会影响SCFAs的产量,而SCFAs在维持肠道屏障㊁缓解炎症㊁调节免疫及介导肠道病原菌的定植等方面具有重要作用[23],其含量的降低会影响仔猪的健康㊂在科水平上,Dou等[24]研究发现,腹泻仔猪粪便中Enter⁃obacteriaceae㊁Clostridiaceae㊁梭杆菌科(Fusobacteri⁃aceae)及棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)相对丰度增加,而Fusobacteriaceae和Corynebacteriaceae与慢性炎症相关㊂4㊀仔猪肠道菌群的调控4.1㊀益生菌㊀㊀断奶应激常伴随着肠道内有益菌数量的减少和致病菌数量的增加㊂益生菌通过竞争排斥调节肠道菌群结构,提高肠道屏障功能,对肠腔中的有害物质和致病菌进行有效隔离,进而预防和阻止仔猪断奶腹泻㊂在猪生产中,常用的益生菌有芽孢杆菌类㊁乳酸菌类和酵母菌类等㊂胡远亮[25]利用变性梯度凝胶电泳分析发现,枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)可以增加仔猪肠道菌群多样性指数和条带,可减少Escherichiacoli相对丰度,增加Lactobacillus相对丰度㊂饲粮中添加Lactobacil⁃lusfrumenti不仅可以提高仔猪肠道中Lactobacillusfrumenti㊁LactobacillusgasseriLA39㊁青春双歧杆菌(Parabacteroidesdistasonis)和特鲁利斯酿酒酵母菌(Kazachstaniatelluris)等有益菌的相对丰度,降低脱硫脱硫弧菌(Desulfovibriodesulfuricans)和扁平云假丝酵母菌(Candidahumilis)等机会致病菌的相对丰度,还可提高紧密连接蛋白的蛋白表达水平及sIgA的mRNA表达水平[26]㊂研究发现,乳酸可通过增加紧密连接蛋白表达,维持上皮屏障,抵抗病原菌的入侵[27]㊂益生菌预保护作用可能是通过促进Lactobacillusfrumenti和Lactobacil⁃lusgasseriLA39等乳酸菌的增殖,增加乳酸的含量,上调紧密连接蛋白表达,提高肠道屏障功能实现的㊂在肠道菌群紊乱的情况下,添加益生菌可改善肠道菌群结构,进而缓解仔猪断奶腹泻㊂Pan等[28]和Che等[29]研究相继发现,在ETEC攻毒条件下,添加益生菌仍可促进Lactobacillus的增殖,并抑制Escherichiacoli的增殖,缓解断奶腹泻㊂Li等[30]研究鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)对ETEC攻毒断奶仔猪的影响,结果发现,低剂量Lactobacillusrhamnosus可以调节肠道菌群结构,缓解由ETEC攻毒引起的急性炎症反应和腹泻;但高剂量Lactobacillusrhamnosus减少了回肠食糜中Lactobacillius和Bacteroides的相对丰度,且Toll样受体2(TLR2)㊁Toll样受体9(TLR9)和肿瘤坏死因子-α(TNF⁃α)等与免疫相关基因的mRNA表达降低㊂Lactobacillius和Bacteroides相对丰度的降低,可能会减少sIgA的分泌,且肠道pH会增加,容易诱发仔猪断奶腹泻㊂因此,益生菌在使用过程中需要精确地探究其对不同动物的适宜剂量,且其分子机制仍需要进一步研究㊂4.2㊀有机酸㊀㊀断奶腹泻发生后,致病菌大量繁殖,脂多糖释放增加,仔猪肠道发生炎症㊂有机酸,如苯甲酸㊁SCFAs㊁长链脂肪酸及丁酸钠等,因其具有抑制病原菌㊁促进肠道发育㊁调节肠道菌群和缓解炎症等作用[31],常被添加在仔猪饲粮中㊂有机酸可降低肠道pH,抑制致病菌的生长㊂Chen等[32]研究发现,在断奶仔猪饲粮中添加苯甲酸可增加回肠中芽孢杆菌属(Bacillus)和Lactobacillus的数量,降低Escherichiacoli的数量,且可降低空肠pH㊂有机酸除了可以抑制致病菌的生长,还可通过调节肠道菌群结构减少炎症反应,这对缓解仔猪断奶腹泻具有重要作用㊂Li等[33]研究发现,有机酸能够降低仔猪肠道中Escherichia⁃Shigella和Verru⁃comicrobia的相对丰度,提高Prevotella的相对丰度和丙酸及丁酸等SCFAs的含量㊂研究显示,Escherichia⁃Shigella和Verrucomicrobia的相对丰度均与炎症呈正相关[34-35]㊂Prevotella是一种纤维降解菌,可分泌β-葡聚糖酶㊁甘露糖酶和木聚糖酶来降解植物源饲料中的纤维类物质[36],增加SCFAs的含量,这对提高断奶仔猪营养物质消化率和保持健康有积极影响㊂研究发现,丁酸除了可以为肠上皮细胞提供能量,促进其增殖外,还可缓解炎症,一是通过激活肠道巨噬细胞和树突状细胞上的G蛋白偶联受体109A(GPR109A),促进T细胞分化,促进抗炎因子白细胞介素-10(in⁃terleukin⁃10,IL⁃10)的表达[37];二是通过抑制组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的活性下调炎症介质的表达[38]㊂此外,Wen等[39]报道,丁酸钠可减少结肠中Clostridium和Escherichiacoli的总存活数,并可降低血清中TNF⁃α和白细胞介素-6(interleukin⁃6,IL⁃6)的含量,且可降低核转录因子-κB(NF⁃κB)的mRNA表达量,从而缓解断奶000511期王文文等:断奶仔猪肠道菌群结构特征及其调控研究进展应激引起的腹泻和炎症反应㊂因此,有机酸可能是通过增加SCFAs产生菌的数量,进而增加SC⁃FAs的含量,降低肠道pH,抑制病原菌增殖,进而缓解仔猪断奶腹泻和炎症㊂4.3㊀植物提取物㊀㊀植物提取物因其具有多糖㊁黄酮及多酚等多种生物活性成分,具有调节肠道菌群结构㊁提高免疫力及抗氧化等作用,这对治疗致病菌感染有一定效果㊂研究发现,植物提取物-巴西辣椒油可增加仔猪肠道中Lactobacillus的数量,并减少腹泻率[40]㊂Zhao等[41]从蒲公英根中提取活性成分,研究其对断奶仔猪肠道菌群和免疫功能的影响,结果显示,互营球菌属(Syntrophococcus)的相对丰度和血清中IL⁃6的含量增加,而狭义梭菌属1(Clostridiumsensu_stricto_1)的相对丰度和白细胞介素-4(interleukin⁃4,IL⁃4)的含量降低,此结果表明蒲公英根部提取物可通过抑制致病菌和提高免疫力来预防仔猪断奶腹泻㊂此外㊂黄芪多糖㊁白术多糖及枸杞多糖均有调节肠道菌群的作用[42]㊂4.4㊀其他㊀㊀除了益生菌和有机酸可调节肠道菌群结构外,发酵豆粕㊁抗菌肽及卵黄抗体也可通过调节肠道菌群结构缓解仔猪断奶腹泻㊂Xie等[43]和Yuan等[44]等研究了发酵豆粕对断奶仔猪的影响,结果发现,发酵豆粕可减少Escherichiacoli的数量,增加Lactobacillus和Prevotella等产丁酸菌的数量,改善肠道健康状况,从而减少腹泻率㊂Mach等[45]研究发现,Prevotella的相对丰度与sIgA的含量呈正相关㊂由此推断发酵豆粕可通过增加Lactoba⁃cillus和Prevotella的数量,以增加乳酸的含量和促进sIgA的分泌,提高仔猪抗病力,缓解仔猪断奶腹泻㊂抗菌肽CWA同样可减少Escherichiacoli的数量,增加Lactobacillus的数量,增加SCFAs含量,增强肠道屏障功能,进而缓解断奶仔猪肠道炎症,是治疗仔猪断奶腹泻的有效物质[46]㊂Han等[47]在饲粮中添加卵黄抗体,可以减少ETEC攻毒断奶仔猪粪便中Escherichiacoli的数量㊁提高总SCFAs㊁乙酸和血清中免疫球蛋白M(IgM)的含量,提高免疫力,进而缓解断奶腹泻㊂卵黄抗体缓解仔猪断奶腹泻的可能机制是SCFAs促进B细胞代谢分化为浆细胞[48],进而增加免疫球蛋白的生成量,从而抵御ETEC的感染㊂在断奶仔猪饲粮中添加色氨酸,可提高抗菌肽表达,增加Prevotel⁃la㊁布劳特氏菌属(Blautia)㊁艾克曼菌属(Akker⁃mansia)及Lactobacillus等有益菌的相对丰度,降低Enterobacteriaceae的相对丰度[49]㊂Blautia中的Blautiafaecis)和Blautiastercoris能利用肠道中的碳水化合物作为发酵底物,产生乙酸和乳酸[50]㊂Akkermansia不仅与黏液层的形成有关[51],还可诱导叉头状转录因子3(Foxp3)基因调节T细胞分化[52]㊂色氨酸可能是通过调控肠道菌群结构,进而调节免疫,达到缓解仔猪断奶腹泻的目的㊂4.5㊀FMT技术㊀㊀FMT技术指将健康仔猪粪便中的功能菌群移植到患病仔猪肠道中,重建肠道菌群以达到治疗腹泻的目的㊂FMT技术可以重建仔猪肠道菌群,并降低腹泻率㊂研究发现,将母源粪菌灌喂给仔猪,可暂时改变其肠道菌群结构㊂22日龄时,仔猪粪便中的梭菌属(Faecalibacterium)和Oribacteri⁃um的相对丰度增加,而瘤胃梭菌属(Ruminiclos⁃tridium)和未分类的普雷沃氏菌科(unclassifiedPrevotellaceae)的相对丰度降低[53],后期其对菌群结构的影响基本消失,这可能是母源粪菌失活,无法定殖所致㊂另有研究发现,将从江香猪的粪便微生物移植到腹泻仔猪肠道中,其肠道菌群结构发生转变,Lactobacillus㊁Bacteroides及Ruminococ⁃cus的相对丰度增加,Faecalibacterium及Prevotel⁃la的相对丰度降低,显著降低了腹泻率[11]㊂FMT技术在畜禽生产中的应用还不成熟,如粪菌保存和移植方式,需要深入研究㊂㊀㊀综上所述,目前调控仔猪肠道菌群的方式有饲粮干预和FMT技术㊂益生菌㊁有机酸㊁植物提取物及发酵豆粕等可通过调节肠道菌群结构,提高肠道屏障功能,激活免疫及抑制炎症反应等方式缓解仔猪断奶腹泻(表1),它们均有减少抗生素在饲料中使用的可能㊂5㊀小结与展望㊀㊀仔猪健康与肠道菌群密切相关,断奶腹泻仔猪普遍存在着肠道菌群紊乱的现象㊂随着高通量测序技术的普及,研究人员对肠道菌群有了更多的认识,关于断奶腹泻仔猪肠道菌群的结构和功能的研究也不断增多㊂目前已知仔猪断奶腹泻发生的部分原因是仔猪肠道菌群紊乱,通过调控肠道菌群对防治断奶腹泻有积极作用㊂但也有许多未解之谜:某些菌种的功能是什么?是否具有种1005㊀动㊀物㊀营㊀养㊀学㊀报32卷属差异性?如何影响宿主?通过调节肠道菌群结构缓解仔猪断奶腹泻的具体机制是什么?因此,需要深入研究这些问题,明确肠道菌群及其代谢产物调控仔猪生理的具体分子机制,这将为防治仔猪断奶腹泻提供新的策略㊂此外,测序数据量庞大,需要更为科学的处理和统计方法,这将有助于仔猪肠道菌群的研究㊂表1 饲粮干预手段对断奶仔猪肠道菌群的调控作用Table1㊀Modulationofdietaryinterventionongutmicrobiotaofweanedpiglets饲粮干预手段Dietaryintervention动物模型Animalmodel菌群变化Microbiotachange作用效果Actioneffects参考文献References枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis非攻毒Lactobacillus相对丰度增加;Escherichiacoli相对丰度减少降低腹泻率胡远亮[25]弗氏乳酸杆菌Lactobacillusfrumenti非攻毒Lactobacillusfrumenti㊁LactobacillusgasseriLA39㊁Parabacteroidesdistasonis和Kazachstaniatelluris相对丰度增加;Desulfovibriodesulfuricans和Candidahumilis相对丰度减少降低腹泻率,提高肠道屏障功能和免疫力Jun等[26]鼠李糖乳杆菌Lactobacillusrhamnosus攻毒Lactobacillus和Bifidobacterium相对丰度增加;Escherichiacoli相对丰度减少降低腹泻率,缓解炎症Li等[30]苯甲酸Benzoicacid非攻毒Bacillus和Lactobacillus数量增加,Escherichiacoli数量减少降低腹泻率Chen等[32]短链脂肪酸和中链脂肪酸混合物SCFAsandMCFAsmix非攻毒Prevotella相对丰度增加;Escherichia⁃Shigella和Verrucomicrobia相对丰度减少降低腹泻率,提高生长性能,缓解炎症Li等[33]丁酸钠Sodiumbutyrate非攻毒Clostridium和Escherichiacoli总存活数减少腹泻率降低,生长性能提高,缓解炎症Zou等[39]巴西辣椒精油SchinusterebinthifoliusRaddiessentialoil非攻毒Lactobacillus数量增加降低腹泻率Cairo等[40]蒲公英根部提取物Dandelionrootextract非攻毒Syntrophococcus相对丰度增加;Clostridiumsensu_stricto_1相对丰度减少降低腹泻率,提高免疫力Zhao等[41]发酵豆粕Fermentedsoybeanmeal非攻毒Firmicutes㊁Lactobacillus和Prevotella数量增加;Bacteroidetes㊁Proteobacteria和Escherichiacoli数量减少降低腹泻率,提高生长性能Xie等[43];Yuan等[44]抗菌肽Antimicrobialpeptide非攻毒Lactobacillus数量增加;Escherichiacoli数量减少降低腹泻率,提高肠道屏障功能,缓解炎症Yi等[46]卵黄抗体Yolkantibody攻毒Escherichiacoli数量减少降低腹泻率,提高免疫力Han等[47]色氨酸Tryptophan非攻毒Bacteroidetes㊁Prevotella㊁Blautia㊁Akkermansia及Lactobacillus相对丰度增加;Firmicutes和Enterobacteriaceae相对丰度减少降低腹泻率,提高免疫力李金龙[49]参考文献:[1]㊀VOGTSL,FINLAYBB.Gutmicrobiota⁃mediatedprotectionagainstdiarrhealinfections[J].JournalofTravelMedicine,2017,24(Suppl.1):S39-S43.[2]㊀GILBERTJA,BLASERMJ,CAPORASOJG,etal.Currentunderstandingofthehumanmicrobiome[J].NatureMedicine,2018,24(4):392-400.[3]㊀LOPETUSOLR,SCALDAFERRIF,PETITOV,etal.Commensalclostridia:leadingplayersinthemainte⁃nanceofguthomeostasis[J].GutPathogens,2013,5:23.[4]㊀ADIBISA.Theoligopeptidetransporter(Pept⁃1)inhumanintestine:biologyandfunction[J].Gastroen⁃200511期王文文等:断奶仔猪肠道菌群结构特征及其调控研究进展terology,1997,113(1):332-340..[5]㊀WANGZ,ZENGXM,MOYM,etal.IdentificationandcharacterizationofabilesalthydrolasefromLac⁃tobacillussalivariusfordevelopmentofnovelalterna⁃tivestoantibioticgrowthpromoters[J].AppliedandEnvironmentalMicrobiology,2012,78(24):8795-8802.[6]㊀NGKM,FERREYRAJA,HIGGINBOTTOMSK,etal.Microbiota⁃liberatedhostsugarsfacilitatepost⁃antibioticexpansionofentericpathogens[J].Nature,2013,502(7469):96-99.[7]㊀NAGAO⁃KITAMOTOH,LESLIEJL,KITAMOTOS,etal.Interleukin⁃22⁃mediatedhostglycosylationpre⁃ventsClostridioidesdifficileinfectionbymodulatingthemetabolicactivityofthegutmicrobiota[J].NatureMedicine,2020,26(4):608-617.[8]㊀KOMMINENIS,BRETLDJ,LAMV,etal.Bacterio⁃cinproductionaugmentsnichecompetitionbyentero⁃cocciinthemammaliangastrointestinaltract[J].Na⁃ture,2015,526(7575):719-722.[9]㊀BUFFIECG,BUCCIV,STEINRR,etal.PrecisionmicrobiomereconstitutionrestoresbileacidmediatedresistancetoClostridiumdifficile[J].Nature,2015,517(7533):205-208.[10]㊀RUSSELLAB,WEXLERAG,HARDINGBN,etal.AtypeⅥsecretion⁃relatedpathwayinBacte⁃roidetesmediatesinterbacterialantagonism[J].CellHost&Microbe,2014,16(2):227-236.[11]㊀胡军.利用贵州从江香猪资源发掘早期断奶仔猪腹泻抗性相关肠道微生物及其作用机制研究[D].博士学位论文.武汉:华中农业大学,2019.[12]㊀KONSTANTINOVSR,AWATIAA,WILLIAMSBA,etal.Post⁃nataldevelopmentoftheporcinemicro⁃biotacompositionandactivities[J].EnvironmentalMicrobiology,2006,8(7):1191-1199.[13]㊀WELLOCKIJ,FORTOMARISJG,HOUDIJKJGM,etal.Theeffectofdietaryproteinsupplyontheperformanceandriskofpost⁃weaningentericdisordersinnewlyweanedpigs[J].AnimalScienceJournal,2007,82:327-335.[14]㊀PAJARILLOEAB,CHAEJP,BALOLONGMP,etal.Assessmentoffecalbacterialdiversityamonghealthypigletsduringtheweaningtransition[J].TheJournalofGeneralandAppliedMicrobiology,2014,60(4):140-146.[15]㊀ALUTHGEND,VANSAMBEEKD,CARNEY⁃HINKLEEE,etal.Boardinvitedreview:thepigmi⁃crobiotaandthepotentialforharnessingthepowerofthemicrobiometoimprovegrowthandhealth[J].JournalofAnimalScience,2019,97(9):3741-3757.[16]㊀GUEVARRARB,LEEJH,LEESH,etal.Pigletgutmicrobialshiftsearlyinlife:causesandeffects[J].JournalofAnimalScienceandBiotechnology,2019,10:1.[17]㊀GUEVARRARB,HONGSH,CHOJH,etal.Thedynamicsofthepigletgutmicrobiomeduringthewea⁃ningtransitioninassociationwithhealthandnutrition[J].JournalofAnimalScienceandBiotechnology,2018,9:54.[18]㊀YANAGIBASHIT,HOSONOA,OYAMAA,etal.IgAproductioninthelargeintestineismodulatedbyadifferentmechanismthaninthesmallintestine:Bacte⁃roidesacidifacienspromotesIgAproductioninthelargeintestinebyinducinggerminalcenterformationandincreasingthenumberofIgA+Bcells[J].Immu⁃nobiology,2013,218(4):645-651.[19]㊀闫学艳.健康与腹泻仔猪肠道菌群差异研究及猪源乳酸杆菌的筛选[D].硕士学位论文.南昌:江西农业大学,2014.[20]㊀汪群.腹泻与健康仔猪粪便菌群的比较及致病菌的分离与耐药性研究[D].硕士学位论文.广州:华南理工大学,2019.[21]㊀TRANH,ANDERSONCL,BUNDYJW,etal.Effectsofspray⁃driedporcineplasmaonfecalmicro⁃biotainnurserypigs[J].JournalofAnimalSciences,2018,96(3):1017-1031.[22]㊀DUBOURGG,LAGIERJC,ARMOUGOMF,etal.High⁃levelcolonisationofthehumangutbyVerru⁃comicrobiafollowingbroad⁃spectrumantibiotictreat⁃ment[J].InternationalJournalofAntimicrobialA⁃gents,2013,41(2):149-155.[23]㊀NICOLASGR,CHANGPV.Decipheringthec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断奶早期仔猪肠道菌群的研究及其对健康的影响
断奶早期仔猪肠道菌群的研究及其对健康的影响随着社会的不断发展,人们对于健康的关注度越来越高。
随着生物技术的不断进步,越来越多的科学家们开始研究人体内的微生物群落,而肠道菌群成为了人们关注的重点之一。
同时,动物内部肠道菌群的研究也引起了人们的关注。
在这篇文章中,我将会重点介绍断奶早期仔猪肠道菌群的研究及其对健康的影响。
一、仔猪肠道菌群的研究历程肠道菌群对于人和动物的健康影响极其重要,而在仔猪出生后的断奶阶段,其肠道菌群的发育和调节对其健康具有非常重要的影响。
在最近几十年的时间里,关于仔猪肠道菌群的研究不断深入,许多研究者们进行了大量的实验,并结合分子生物学技术和生物信息学进行了深入细致的分析。
研究表明,仔猪生命的前两周内,其肠道菌群会经历一个快速的演变过程,从无菌状态到菌群稳定。
这个过程是复杂而受到许多因素的影响,例如喂养方式、饲料成分和环境条件等等。
其中,喂养方式对于肠道菌群的发育有着非常重要的影响。
二、肠道菌群对健康的影响在无菌条件下的实验表明,肠道菌群对于仔猪的生长和免疫系统发育都有着重要的影响。
良好的肠道菌群不仅可以提高养殖效益,而且还可以帮助仔猪对抗疾病,提高健康水平。
首先,肠道菌群可以帮助仔猪吸收营养物质。
如枯草芽孢杆菌能够帮助仔猪消化纤维素,而乳酸杆菌则能够帮助其在消化道内吸收葡萄糖、乳糖等营养成分。
其次,良好的肠道菌群可以提高仔猪的免疫力。
免疫调节相关菌群的存在可以帮助仔猪抗击一些病原菌的感染。
例如,某些乳酸菌和嗜酸乳杆菌能够产生乳酸、醋酸、过氧化氢和乙酸等有机酸物质,促进肠道环境的酸化,从而抑制一些潜在的病原菌。
三、调节方法不同的调节方式对于肠道菌群的影响是不同的,取决于具体的菌群和饲养环境,请注意勿盲信广告。
在实践中,一些养殖大户为提高仔猪的生长速度和增加出栏重量,往往会膳食添加不必要的抗生素和生长促进剂,导致仔猪肠道菌群失调。
因此,要想提高仔猪养殖效益和健康水平,需要采用一些科学合理的方法进行调节。
猪胃肠道微生物菌群的研究现状浅析
猪胃肠道微生物菌群的研究现状浅析作者:柳尧波凌泽春来源:《山东农业科学》2011年第10期摘要:动物胃肠道微生物菌群与宿主胃肠道环境和宿主所处的外界环境密切相关,形成统一的整体。
本文对猪胃肠道微生物菌群的组成和分布、菌群的作用、影响菌群的因素以及菌群的研究手段和调控等进行了浅析,为猪胃肠道微生态区系的研究和调控提供参考。
关键词:猪;胃肠道微生物菌群中国分类号:S828.1-1文献标识号:A文章编号:1001—4942(2011)10—0090—05动物胃肠道正常微生物区系在动物营养、健康、防病、免疫等方面发挥着重要作用。
从19世纪法国微生物学家巴斯德提出正常菌群对宿主是有益的学说以来,人们对畜禽胃肠道正常微生物群的组成、定殖规律及其与宿主关系有了越来越多的了解。
畜禽胃肠道微生物在正常情况下,各种菌群处于稳定的平衡状态,保证其胃肠道正常的消化和吸收。
同时,有益菌群定殖于胃肠道内壁黏膜,形成非特异性生物保护屏障,抑制病原菌在消化道壁的定殖,维持胃肠道正常的微生态平衡。
当外界环境发生变化或饵料变更等应急状态时,这种理想的微生物区系平衡会受到冲击,消化道内的有害菌群增多,将会导致细菌性疾病的暴发。
由此可见,动物胃肠道微生物区系的理论平衡是宿主动物保持良好的健康状况和发挥正常生产性能所必须的条件。
因此,如何利用益生素、化学益生素等调控动物胃肠道微生物组成,保持动物胃肠道微生物区系平衡、维持动物健康成为国际上的研究热点。
1猪胃肠道微生物的组成和分布研究表明,动物出生前胃肠道中是无菌的,但是出生后3-4 h,肠道内开始检测出细菌。
微生物菌群在消化道内的定殖顺序首先是需氧菌,然后是兼性厌氧菌,最后是专性厌氧菌。
苏勇等(2006)研究结果显示,哺乳期仔猪胃中细菌数量较低,Pluske等(2003)认为,哺乳期仔猪胃和小肠中的优势菌群为乳酸杆菌和链球菌。
断奶仔猪胃肠道微生物环境很不稳定,断奶应急和日粮成分的变化,使胃肠道内环境发生了改变,因而胃肠道中微生物的数量及定殖位点也会随着发生改变。
断奶后仔猪肠道微生物区系变化研究
二、技术方法与应用
PCR 技术
• 原理与应用:利用 DNA 双链解离,特异性引物结合,DNA 聚合酶扩增目标序列,广泛用于 微生物检测、鉴定和生态研究。
• 实验设计:设计特异性引物,优化 PCR 反应体系,确保扩增效率和特异性,针对断奶后仔猪 16S rRNA 基因。
• 优化策略:调整变性、退火和延伸温度,确保条带亮度和位置反映细菌区系差异,通过测序 验证准确性。
断奶后仔猪肠道微生物区系变化研究
Overview
1. 一、研究背景与意义 2. 二、技术方法与应用 3. 三、粪样采集与处理 4. 四、实验结果分析 5. 五、微生物区系变化 6. 六、结论与未来方向 7. 七、应用与实践意义
一、研究背景与意义
研究背景
• 微生物区系与健康:断奶后仔猪肠道微生物对生长、免疫力至关重要。 • 传统方法局限:培养法无法全面反映肠道微生物多样性。 • 分子生物学进步:PCR 与 DGGE 技术揭示微生物群落动态。 • 优化饲养策略:理解变化规律,提升仔猪健康与生产性能。
• 结果评估:通过凝胶电泳和生物信息学分析,比较不同时间点和处理组的条带模式,揭示肠 道微生物变化趋势。
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DGGE 技术
• 原理:基于 DNA 变性梯度分离,揭示序列差异。 • 优势:高灵敏度,揭示微生物多样性。 • 实验操作:PCR 扩增 16S rRNA 基因,变性梯度凝胶电泳。 • 分析:DGGE 图谱比较,揭示肠道微生物变化。
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预处理与保存
• 样本制备:精确采集断奶仔猪粪样,确保代表性和无菌操作。 • DNA 提取:高效提取 DNA,保持样本质量与纯度。 • 保存条件:-80℃ 冷冻保存,确保微生物活性的长期保持。 • 质量控制:定期检查样本状态,确保实验数据的准确性和可靠性。
猪肠道微生物组成、影响因素及其对重要经济性状的影响研究进展
中国畜牧兽医 2022,49(7):2557-2566C h i n aA n i m a lH u s b a n d r y &V e t e r i n a r y Me d i c in e 猪肠道微生物组成㊁影响因素及其对重要经济性状的影响研究进展李卓君1,陈春香1,钟小菊1,高 军2(1.南昌大学抚州医学院,抚州344000;2.江西农业大学,猪遗传改良与养殖技术国家重点实验室,南昌330045)摘 要:肠道微生物在调节宿主生理机能㊁代谢和免疫功能等方面发挥着非常重要的作用,是影响猪健康和重要经济性状表型的重要因素之一㊂近年来,人们对猪肠道微生物的研究和了解越来越深入,了解猪肠道微生物组成将有助于为从肠道菌群方向入手改善猪群健康和提高生产性能提供参考㊂作者首先综述了不同发育阶段㊁不同肠道部位以及主要商品猪和中国地方猪肠道核心菌群组成;其次系统总结了宿主遗传背景㊁饲粮种类㊁性别㊁环境以及抗生素㊁益生菌和饲料添加剂使用等因素对猪肠道微生物组成的影响;最后概述了猪肠道微生物主要功能及其对饲料利用率㊁脂肪沉积㊁宿主行为和免疫炎症等方面的影响㊂关键词:猪;肠道微生物;核心菌群;功能;影响因素中图分类号:Q 935文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2022.07.013 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2021-12-03基金项目:抚州市科技计划重点研发项目(2020D C 05)联系方式:李卓君,E -m a i l :247732391@q q .c o m ㊂通信作者高军,E -m a i l :j u n ga o c h i n a @h o t m a i l .c o m R e s e a r c hP r o g r e s s o nP o r c i n eG u tM i c r ob i o t aC o m p o s i t i o n ,I n f l u e nc i n gF a c t o r s a n d I t sE f f e c t s o nE c o n o m i c a l l y I m po r t a n t T r a i t s L I Z h u o j u n 1,C H E N C h u n x i a ng 1,Z H O N G X i a o ju 1,G A OJ u n 2(1.F u z h o uM e d i c a lC o l l e g e ,N a n c h a n g U n i v e r s i t y ,Fu z h o u 344000,C h i n a ;2.T h e S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f P i g G e n e t i c I m p r o v e m e n t a n dP r o d u c t i o nT e c h n o l o g y ,J i a n g x i A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,N a n c h a n g 330045,C h i n a )A b s t r a c t :G u tm i c r o b i o t a p l a y sa n i m p o r t a n t r o l e i nr e g u l a t i n g h o s t p h y s i o l o g y ,m e t a b o l i s ma n d i m m u n e f u n c t i o n ,a n d i so n eo f t h e i m p o r t a n t f a c t o r s a f f e c t i n gp i g h e a l t ha n de c o n o m i c t r a i t s .I n r e c e n t y e a r s ,t h e r e s e a r c h e sa n du n d e r s t a n d i n g o f p o r c i n e g u tm i c r o b i o t ah a v eb e c o m em o r ea n d m o r ei n -d e p t h .U n d e r s t a n d i n g t h e c o m po s i t i o n o f p o r c i n e g u t m i c r o b i o t a c a n p r o v i d e t h e r e f e r e n c e s f o ri m p r o v i n g p i g h e a l t h a n d p r o d u c t i o n p e r f o r m a n c ef r o m t h e p e r s p e c t i v eo f g u t m i c r o b i o t a .T h e a u t h o r f i r s t l y r e v i e w e d t h e c o m po s i t i o n o f g u t c o r e b a c t e r i a i n d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s a n d g u t l o c a t i o n so f c o m m e r c i a l a n dC h i n e s e i n d i g e n o u s p i g b r e e d s .T h e n ,t h ee f f e c t s o f h o s t g e n e t i c b a c k g r o u n d ,d i e t s ,s e x ,e n v i r o n m e n t ,a n d t h e u s e o fa n t i b i o t i c s ,p r o b i o t i c s a n d f e e da d d i t i v e so nt h e g u tm i c r o b i a l c o m p o s i t i o nw e r es y s t e m a t i c a l l y su m m a r i z e d .F i n a l l y ,t h em a i nr o l e so f p o r c i n e g u tm i c r o b i o t ao nf e e de f f i c i e n c y ,f a td e po s i t i o n ,h o s tb e h a v i o r a n d i m m u n e i n f l a m m a t i o n r e s po n s ew e r e s u m m a r i z e d .K e y w o r d s :p i g s ;g u tm i c r o b i o t a ;c o r eb a c t e r i a ;f u n c t i o n ;i n f l u e n c i n g f a c t o r s 微生物是动物机体的重要组成部分㊂据估计,哺乳动物肠道内微生物数量多达1014个,有500~1000个物种[1]㊂肠道是机体消化食物㊁吸收营养的主要场所,也是最大的免疫器官,70%的免疫细胞中国畜牧兽医49卷来自于肠道[2]㊂作为人体最主要的微生物栖息地,肠道微生物 训导 肠黏膜表面免疫系统的建立,促进肠道发育,维持肠道免疫系统的健康,在宿主的新陈代谢和免疫功能等方面起着不可替代的作用[3-7]㊂正常情况下,肠道微生物组保持着动态的平衡,一旦这个相对稳定状态被各种因素打破,将可能导致宿主产生各种疾病[8]㊂猪是人类成功驯化的重要家畜种类,也是主要的消费肉类来源㊂研究猪肠道微生物组对改善其经济性状具有重要意义㊂同时,猪的生理㊁食性㊁器官大小等方面与人相似,因此是人类医学研究的良好哺乳动物模型[9]㊂肠道微生物基因集研究表明,有96%的功能通路同时存在于人和猪的肠道微生物基因集中,表明猪也是研究肠道菌群的重要模式动物[10]㊂作者综述了影响猪肠道微生物组成的因素,并系统回顾了猪肠道微生物组成及其功能的研究进展,以期为今后更深入㊁全面地进行研究提供思路㊂1猪肠道微生物组成宿主肠道中的微生物组成并不是一成不变的,而是受宿主体内或体外环境影响处于动态变化中,但也有一些微生物物种在不同生理状态下㊁不同个体间或同一个体不同生命阶段中始终存在㊂H o l m a n等[11]对20项基于16Sr R N A基因测序的猪肠道菌群研究数据集进行分析发现,接近85%的基因序列属于厚壁菌门和拟杆菌门;在属水平上,普氏菌属㊁梭菌属㊁异普氏菌属㊁瘤胃球菌属和R C9在99%的粪便样本中存在,此外梭菌属㊁布劳特氏菌属㊁乳杆菌属㊁普氏菌属㊁瘤胃球菌属㊁罗氏菌属㊁R C9和罕见小球菌属在90%的肠道样本中存在,并将这些微生物定义为猪的核心肠道菌群㊂W a n g 等[12]对287份来自法国㊁丹麦和中国的猪粪便样品进行宏基因组测序,结果显示,变形菌门㊁厚壁菌门和放线菌门占肠道菌群近95%;在属水平上,埃希氏菌属㊁拟杆菌属㊁丛毛单胞菌属㊁链霉菌属和乳杆菌属等为最优势的肠道菌群㊂尽管肠道微生物组成一直在变化,但猪肠道微生物组成在猪的不同生长阶段表现出一定的规律性演变㊂研究表明,仔猪出生后,微生物以一定的先后顺序迅速在肠道中定植,在出生后12h,结肠内容物中的细菌数高达109~1010/g,以兼性厌氧菌为主;在出生后48h,专性厌氧菌成为优势菌群,其组成超过细菌总数的90%[13]㊂其主要原因是,仔猪出生后,最早获得肠道菌群的方式是口服产道内及环境中微生物,并通过胃肠道迅速传播㊂在出生48h 后,肠道内首次出现了乳汁,继而专性厌氧菌大量繁殖并成为优势菌群,这种优势将持续整个哺乳期㊂Z h a o等[14]分析了1㊁2㊁3和6月龄猪肠道微生物在门水平上的动态变化,发现在各个发育阶段最占优势的均为厚壁菌门;拟杆菌门从1月龄的5.1%下降到2月龄的0.9%,随后在3㊁6月龄又呈上升趋势,该结果与人肠道微生物中厚壁菌门/拟杆菌门的比例随年龄变化趋势一致[15],拟杆菌门主要在消化碳水化合物中发挥作用,而厚壁菌门的增加则与脂肪沉积相关㊂在多样性方面,W a n g等[16]分析不同日龄仔猪粪便样品发现,尽管胎粪微生物(第0天)载量低,但其具有较高的多样性,这些微生物可能作为播种菌群推动肠道菌群定植;到第11天多样性明显下降,到第20天又显著上升,说明肠道微生物在前10d并不是全部都能成功定植,而第20天受到断奶应激和固体食物添加的影响,断奶后进入保育期,固体食物的添加使菌群多样性总体呈上升趋势;直到4~6月龄(育肥期),随着饲粮配比的稳定,肠道微生物多样性趋于稳定㊂除了不同生长时期,在不同肠道部位,由于肠道蠕动程度㊁氧气含量㊁抗菌肽和p H的差异,猪肠道微生物组成也存在较大差异㊂不同肠段氧气含量不同,导致小肠中主要富集需氧菌或兼性厌氧菌,大肠中主要富集厌氧菌[14]㊂研究发现,3月龄小猪回肠内微生物组成与盲肠㊁结肠和粪便中的菌群组成存在显著差异㊂回肠中的微生物有95%属于厚壁菌门,厌氧杆菌和T u r i c i b a c t e r则是最丰富的细菌属;而盲肠㊁结肠和粪便中的微生物组成相似,在门水平上以厚壁菌门和拟杆菌门为主,2个门的菌的相对丰度高达90%以上,而丰度较高的菌属是普雷沃氏菌㊁颤杆菌和琥珀酸弧菌[17-18]㊂Z h a n g等[19]通过16S r R N A基因测序的方法绘制了仔猪不同肠段肠腔和黏膜的微生物图谱,其中厚壁菌门和变形菌门是回肠的优势菌,但它们在肠腔和黏膜中的占比有所不同,在肠腔中占95%,而在黏膜中占80%;肠腔中厚壁菌门和变形菌门,以及黏膜上的变形菌门从小肠到大肠都是显著减少的,而拟杆菌门从小肠到大肠则明显增加,在肠腔中相对丰度从1.69%增加到40%以上,在黏膜中则从9%增加到30%左右㊂此外,该研究通过网络分析发现,普雷沃氏菌科和瘤胃球菌科㊁毛螺菌科和韦荣球菌科为肠腔微生物网络的核心菌,而普雷沃氏菌科㊁肠杆菌科㊁丙杆菌确定为黏膜微生物网络的核心菌㊂C h e n等[20]采用宏85527期李卓君等:猪肠道微生物组成㊁影响因素及其对重要经济性状的影响研究进展基因组测序分析了回肠㊁盲肠和粪便中核心菌群(在90%以上个体中存在)组成情况,发现10个菌种(瑞特乳酸杆菌㊁约氏乳酸杆菌㊁淀粉乳酸杆菌㊁瘤胃菌属㊁大肠杆菌㊁普氏菌属㊁脆弱拟杆菌属㊁猪链球菌㊁考拉杆菌和肠道沙门氏菌)在3个肠道部位都属于核心菌(相对丰度位列前20%),有16个菌种其相对丰度只在其中一个肠道部位中位列前20,表明同一种细菌在不同肠道部位的相对丰度存在显著差异;同时还检测到3个在回肠和5个在盲肠内容物中特异的核心菌种㊂因此,了解猪肠道共生微生物在宿主不同肠道部位的丰度情况非常重要,因为肠段特异性共生微生物与宿主消化代谢㊁免疫互作密切相关,可以为通过基于调控特定肠道部位微生物组成促进猪生长发育㊁饲料利用率等重要经济性状提供重要理论支撑㊂此外,不同肠道部位共生微生物图谱也为快速定位并解析微生物移位导致慢性炎症等其他疾病提供数据支撑㊂2影响猪肠道微生物组成的因素猪肠道微生物组成随着宿主的生长㊁环境的变化及饲粮改变㊁用药等发生变化㊂影响肠道微生物组成的因素可以归纳为4类:①宿主因素,主要包括肠道部位㊁年龄和生长阶段㊁宿主遗传(品种)和性别等;②管理和环境因素,如断奶㊁饲养模式㊁猪舍环境等;③饲料因素,主要包括饲料类型㊁成份㊁能量㊁蛋白质含量和氨基酸平衡等;④抗生素使用和添加剂,如抗生素㊁益生菌㊁益生元㊁精油和有机酸等㊂作者主要归纳了宿主遗传㊁饲粮㊁性别㊁环境㊁抗生素和益生菌等因素对猪肠道微生物组成的影响㊂2.1遗传背景越来越多的证据表明,宿主遗传因素对猪肠道微生物组成有一定影响[21-23]㊂C h e n等[24]研究发现,全同胞个体间的肠道微生物组成比不相关个体间具有更高的相似性,且与肠道中微生物类群组成和丰度相关的宿主基因的功能主要与代谢㊁免疫功能和应答及信号转导有关㊂通过对比相同饲养环境㊁相同日龄的杜洛克猪㊁长白猪和大白猪的肠道微生物组成发现,在厚壁菌门和拟杆菌门的占比方面,同一品种猪的比例更为相似,不同品种猪间差异明显,如厚壁菌门的占比在杜洛克猪㊁长白猪和大白猪的粪便样品中分别为39.63%㊁45.55%和42.02%,拟杆菌门占比分别为57.01%㊁47.64%和51.38%[25];在金华猪粪便微生物组成分析中,厚壁菌门和拟杆菌门占比分别为70.4%和14.4%[26]㊂Y a n g等[27]比较了8个品种的猪肠道微生物组成,发现外来猪种大白猪㊁约克夏猪和杜洛克猪的肠道菌群有较高的相似性,而中国地方猪种巴马香猪㊁二花脸猪和小梅山猪的肠道微生物组成有一定的相似性,除小梅山猪外,中国地方猪种肠道微生物总数和16S r R N A拷贝数均高于国外猪种;与杜洛克母猪相比,梅山猪母猪和二花脸母猪肠道菌群的细菌总数,厚壁菌门㊁拟杆菌门和硫酸盐还原菌的数量均较高㊂此外,杨柳等[28]还对比了荣昌猪㊁长白猪和杜洛克猪3个品种猪粪便中肠道微生物的变化,发现不同品种间肠道优势菌群呈现较大差异,且肠道微生物群落结构与品种因素密切相关㊂2.2饲粮R o t h s c h i l d等[29]认为,宿主遗传在决定肠道微生物组成方面的作用非常有限,肠道微生物群平均遗传率仅为1.9%;生活在同一个家庭中无亲缘关系的个体间菌群组成有显著的相似性,超过20%的微生物组成的变异可由饮食㊁药物和生活方式等环境因素解释㊂然而,在众多影响猪肠道微生物组成的因素中饲粮是最主要的影响因素,可解释猪肠道微生物组成变异的35%[16]㊂H e i n r i t z等[30]研究发现,饲喂高纤维低脂饲粮的猪肠道中乳酸杆菌㊁双歧杆菌和柔嫩梭菌等有益菌的基因拷贝数高,所产生的短链脂肪酸浓度也高;而饲喂低纤维高脂饲粮的猪肠道中含有丰富的肠杆菌科细菌㊂C h e n等[31]研究饲粮中不同蛋白质含量(12%㊁15%及18%)对猪肠道菌群组成及生理健康的影响,结果发现,15%粗蛋白质组的肠道菌群多样性最高,回肠和结肠中有益菌乳酸杆菌科㊁梭状芽孢杆菌科㊁放线菌科和微球菌科比例增加,而链球菌科和肠杆菌科比例减少,表明适度限制饲料中蛋白质含量可以优化回肠和结肠菌群结构,促进猪的肠道健康,这也验证了B i k k e r 等[32]发现的低蛋白水平饲粮能明显降低肠道中大肠杆菌数量的研究结果㊂另外,多糖(如纤维素)是猪饲料中的一个重要组成部分,主要通过影响猪肠道后端菌群的互作改变微生物群落组成和发酵终产物,从而调控猪肠道后端的消化吸收[33-34]㊂饲粮中氨基酸组成平衡可通过调节猪肠道微生物群落的组成来促进肠道发酵作用,减少猪粪中的未消化蛋白质发酵产生的有害臭味化合物(酚类㊁氨和支链脂肪酸等),降低养猪业的空气污染㊂R e c h a r l a等[35]分别对两组公猪采用2007年韩国饲养标准(旧版)和2012年韩国饲养标准(良好氨基酸平衡)进行饲喂,结果发现,2012组公猪粪便中的短链脂肪酸水平高9552中国畜牧兽医49卷于2007组,而苯酚㊁对甲苯酚和总氮含量均低于2007组;在微生物组成上,2012组有益的乳酸杆菌(L a c t o b a c i l l u s)增加,致病的梭菌(C l o s t r i d i u m)减少㊂2.3性别肠道微生物组成也与性别相关,X i a o等[36]对丹麦公猪㊁丹麦母猪及阉割公猪的肠道微生物进行比较发现,饲养在一起的公猪和母猪间肠道微生物组成存在明显差异,而共同饲养的阉割公猪和母猪之间则没有差异;在肠道菌群宏基因组功能水平,丹麦公猪与丹麦母猪间鉴定到498个差异的K E G G同源簇(k y o t o e n c y c l o p e d i a o f g e n e sa n d g e n o m e s o r t h o l o g y,K O),其中差异最大的是A B C转运体㊁核糖体和磷酸转移酶系统,而阉割公猪和母猪之间只有酮化合物合成酶(p o l y k e t i d e s y n t h a s e,P k s J)一个K O功能存在差异㊂H e等[37]研究发现,阉割公猪的粪便微生物组成趋向于母猪,同时还鉴定出与性别相关的细菌类群,在公猪中罗氏菌属㊁布雷德菌属和埃希氏杆菌属的丰度较高,而在母猪中密螺旋体属和拟杆菌属的丰度较高㊂G a r c i a-G o m e z等[38]研究表明,较高水平的睾酮可抑制密螺旋体的生长,而密螺旋体可增加宿主从高纤维食物中摄取营养物质的能力;母猪肠道微生物组中密螺旋体丰度和A B C转运体丰度都较高,这可能增加了宿主能量吸收能力,导致宿主脂肪沉积,降低了母猪的饲料利用率㊂G r a e f等[39]研究证明,雄性激素相关代谢物与大肠杆菌和布雷德菌属丰度呈正相关,大肠杆菌中的β-葡萄糖醛酸酶能释放出游离的雄激素以促进机体重吸收,而雄激素与肠道微生物群的相互作用可能会影响宿主的表型,如猪的脂肪沉积和饲料利用率㊂此外,公猪肠道中丰度较高的布雷德菌属与饲料利用率呈正相关[40]㊂2.4环境因素动物在饲养过程中环境的改变或受到刺激,如运输㊁混栏㊁断奶等常见的管理措施的变化,会导致动物机体的生理变化[41],从而影响肠道微生物群[42]㊂断奶是每头猪必须经历的一种应激㊂研究发现,断奶前后仔猪肠道中微生物门水平的种类相同,只是相对含量不同;在属水平上,断奶前拟杆菌属相对含量较高,推测是其能利用母乳中的单糖和低聚糖的原因;断奶后普氏菌属相对含量较高,可能是由于其能降解食物中的半纤维素[2,43]㊂淀粉乳杆菌和罗伊氏乳杆菌在新出生和未断奶仔猪回肠样本中占主导,断奶之后这两种菌的丰度明显下降,在断奶早期还出现了梭菌纲和大肠杆菌,此外优势微生物群的组成和代谢活动也发生改变[44]㊂利用益生菌进行早期干预可促进仔猪肠道菌群成熟,调节免疫系统发育,缓解断奶应激[45]㊂在猪饲养过程中环境的变化也会造成应激㊂X i o n g等[46]对生长肥育猪进行急性热应激处理,结果发现猪采食量降低,血清中与能量代谢和应激反应相关的生化参数和激素水平发生改变;此外,粪便菌群中厚壁菌门丰度增加,拟杆菌门减少,短链脂肪酸含量也显著下降;关联分析结果表明,采食量及代谢图谱的变化与猪肠道菌群组成和短链脂肪酸代谢的改变有关㊂良好的猪舍环境(包括环境卫生㊁通风情况㊁温度㊁饲养密度等)可以减少猪群与病原菌接触的机会,降低感染风险,但也不能过度清洁,猪舍内留存适量细菌有利于机体持续产生抗体,从而增强猪的免疫力㊂大肠杆菌是肠道共生菌,也是机会致病菌[47],大肠杆菌感染的严重程度可以通过恒温㊁清洁的环境,分栏,精准配制饲料及在饲料中添加适量的氧化锌来缓解[48]㊂因此,饲养环境对猪的肠道菌群和健康养殖尤为重要㊂2.5抗生素、益生菌和饲料添加剂在商业化养殖中,添加抗生素可以提高猪的日增重和饲料利用率,其在生理㊁营养和代谢方面的影响已有报道[49]㊂低剂量的抗生素能帮助仔猪降低断奶应激,减少腹泻的可能,促进仔猪生长发育㊂但是抗生素的长期使用会破坏宿主肠道菌群平衡,导致耐药基因的出现和耐药菌的增加,肠道菌群多样性降低,最终使宿主免疫力下降[50-52]㊂L o o f t等[53]研究金霉素㊁磺胺甲嘧啶和青霉素对18周龄猪肠道微生物的影响发现,在使用抗生素14d后,肠道中的变形菌门从1%增加为11%,潜在病原菌大肠杆菌的相对含量也有显著上升㊂宏基因组分析显示,添加抗生素后与能量产生和转换有关的微生物功能基因表达上调,同时抗生素抗性基因的丰度也显著上升㊂抗生素抗性基因可以在人和动物之间转移[54],所以分析猪肠道菌群的抗生素抗性基因,在饲料中全面禁止添加抗生素和优化抗生素的使用势在必行㊂除了抗生素以外,益生菌在养殖业中的应用也越来越多㊂益生菌的作用机制包括产生抗菌物质㊁调节宿主免疫系统㊁竞争性抑制病原菌和调节肠道菌群组成[55]㊂研究发现,在猪饲粮中添加适量的益生菌后,粪便中大肠杆菌的数量减少,乳酸杆菌的数量增加,同时猪的生长性能㊁营养物质消化率㊁腹泻06527期李卓君等:猪肠道微生物组成㊁影响因素及其对重要经济性状的影响研究进展评分和肉质等各方面都得到了改善[56]㊂多项研究显示,在猪饲粮中添加活酵母可改善断奶仔猪的生长性能[57-58]㊂与其他益生菌不同的是,苹果酵母菌能显著改善猪肠道微生物组成,在门水平上表现为厚壁菌门减少和拟杆菌门增加,还能选择性抑制肠道内沙门氏菌㊁大肠杆菌等致病菌的生长[58]㊂在过去几年,益生菌的添加对肠道微生物组的影响一直是研究的热点㊂从动物健康的角度出发,评估益生菌所引起的肠道微生物组的改变及分析益生菌是否与肠道疾病相关非常重要[59]㊂益生元对肠道微生物组成也有积极的影响,益生元通过覆盖宿主肠道表面㊁调节肠道生态㊁下调黏附素因子或毒力基因的表达㊁增强宿主免疫系统等不同机制对宿主肠道中沙门氏菌和大肠杆菌等致病菌发挥抑制作用[60]㊂如喂食海藻多糖使仔猪小肠中乳酸杆菌/大肠杆菌的比例增加,抑制仔猪断奶后腹泻的条件致病菌(如鼠伤寒沙门氏菌和产肠毒素大肠杆菌)数量减少㊂在仔猪饮水中添加海藻产品,可降低肠杆菌对四环素㊁氯霉素等抗生素的耐药性㊂在生长育肥期饲粮中添加褐藻多糖使结肠和盲肠中的短链脂肪酸㊁有益菌(双歧杆菌和乳酸杆菌)增加,大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌减少[61]㊂精油是从植物中提取的天然生物活性化合物,具有抗菌㊁抗炎和抗氧化等特性㊂近年来,精油也逐渐作为饲料添加剂使用㊂L i等[62]研究发现,向断奶仔猪饲粮中添加精油后,仔猪体重显著增加㊁腹泻率显著降低,同时肠道中芽孢杆菌纲㊁乳杆菌目㊁链球菌科和韦荣球菌科中一些菌的相对丰度明显上升㊂有机酸在过去的几十年中因其对猪生长的积极作用而作为饲料添加剂被广泛使用㊂在饲料中添加有机酸能防止饲料变质,通过抑制饲料中特定致病菌沙门氏菌的生长降低商业猪养殖中微生物感染的风险,且有机酸还可以在肠道中微生物定植中发挥作用,作为肠道黏膜的能量来源[63]㊂3肠道微生物主要功能随着人们对肠道微生物的研究越来越深入,发现其对维持机体各项生理机能都发挥着重要的作用㊂本综述归纳总结了几项主要功能:①发挥生物屏障功能㊂通过产生抑菌物㊁占位性保护及与病原菌竞争营养来防止细菌过度生长,预防病原微生物的感染[64-65],如乳酸球菌分泌的类细菌素物质具有广谱抗菌作用,能抑制大肠杆菌等革兰氏阴性菌的生长和繁殖[66]㊂②参与机体对营养物质消化㊁代谢和吸收㊂肠道菌群的重要功能之一就是参与宿主对营养物质的消化代谢,如细菌代谢宿主难以消化的膳食多糖产生短链脂肪酸(s h o r t-c h a i nf a t t y a c i d s, S C F A s)等代谢物㊂肠道内S C F A s含量升高可以提高猪肠道的吸收能力,S C F A s不仅作为能量物质被宿主利用,提供成年猪能量需求的15%~ 24%[67-68],而且可为微生物的生长和增殖提供能量和营养物质㊂乙酸和丙酸主要参与机体糖代谢过程,丁酸具有促进肠上皮细胞生长的功能[69-70]㊂S C F A s还可以降低肠道p H,抑制外源菌的生长和繁殖㊂肠道微生物还能分泌一系列酶和维生素促进宿主单糖代谢㊂③调控宿主免疫机能㊂肠道菌群定植有利于宿主肠道免疫系统成熟㊁刺激宿主免疫反应等㊂基于肠道菌群的这些生物学功能,它可能影响猪饲料利用率㊁生长和脂肪沉积㊁宿主炎症免疫㊁宿主行为等㊂3.1提高饲料利用率饲料开支占生猪养殖投入的70%以上[71],提高饲料利用率可以提高养猪业的经济效益㊂目前,提高猪饲料利用率的主要手段是遗传改良㊁提升农场管理水平和优化饲料配方等㊂B e r g a m a s c h i等[40]将猪肠道微生物组成与饲料利用率进行相关性分析发现,4个属(乳杆菌属㊁布劳特氏菌属㊁多尔氏菌属和真杆菌属)与饲料利用率之间存在正相关关系㊂V e r s c h u r e n等[72]在三元猪中也发现乳杆菌属与饲料利用率呈正相关㊂此外,Y a n g等[73]和Q u a n 等[74]报道了瘤胃球菌科下的一些微生物类群与杜洛克猪或杂交猪的饲料利用率均呈正相关㊂H a n 等[75]研究发现,普雷沃氏菌属与猪体重呈正相关,普雷沃氏菌属肠型的猪在断奶后有较高的平均日增重㊂3.2导致猪脂肪沉积胃肠道中的微生物群落与机体脂肪沉积(肥胖)以及许多代谢性疾病的发生发展密切相关㊂研究发现,肠道菌群可以调节小鼠的脂肪代谢㊁降低消耗脂肪的基因活动㊁升高合成脂肪的基因活性,从而使动物过度合成和积累脂肪[76];肠道菌群是动物肥胖发生的必需条件,给无菌小鼠饲喂高脂饲料也不会肥胖;将遗传性肥胖小鼠(o b/o b)的肠道菌群(粪便)移植到野生型无菌小鼠体内,移植肥胖小鼠粪便的受体小鼠2周后脂肪存储量显著超过移植了健康小鼠菌群的对照组,表明肥胖表型可随菌群在不同个体间发生转移[77]㊂P e i等[78]首次发现并通过科赫法验证了1株肥胖人肠道的因果条件致病菌 阴1652。
猪胃肠道菌群的作用、影响因素及调控措施1
猪胃肠道菌群的作用、影响因素及调控措施猪正常的胃肠道微生物菌群对猪的营养健康,防病能力以及免疫能力等发挥着重要的作用。
在正常情况下猪的胃肠道微生物菌群保持着相对的平衡和稳定,以利于维持或促进胃肠道的正常消化与吸收,正常的有益菌定殖于胃道粘膜上保护胃肠粘膜阻止其它病原菌的危害。
如外界环境或食物超出了机体所承受的能力就会破坏这种平衡使有害细菌增多,导致疾病的发生和流行。
因此,只有清楚猪胃肠首菌群的作用,掌握影响猪胃肠道平衡调节的因素,才能有效的利用好猪胃肠道的有益群的作用,防止有害菌群的滋生。
1 猪胃肠道内菌群的组成、生长以及分布相关的研究资料表明,动物胃肠道内在出生前是没有细菌的,出生3h~4h肠道内才检测得出细菌。
胃肠道内的微生物菌群有一的定殖顺序:需氧菌→兼性厌氧菌→专性厌氧菌。
哺乳期仔猪胃中有数量较少的细菌,哺乳期的仔猪胃和小肠有较多数量的乳酸杆菌和链球菌。
断奶仔猪由于断奶应激和日粮变化等因素的影响使消化道的内环境发生了变化,菌群也就发生了明显变化,其数量和定殖位点也相应的发生了改变。
2 猪胃肠道菌群的作用2.1 有助于提高机体营养猪胃肠道菌群的代谢过程会产生易被猪的机体吸收的维生素和胞外酶产物,对营养、消化和吸收起着重要作用。
猪胃肠道菌群在体内能合成有利于宿主生长和助消化的B族维生素;猪在盲肠中的菌群所产生有机酸,既可以为机体提供营养还能提机体对高蛋白质和能量利用,其乳酸菌所产生的乳酸有利肠道中钙和磷的络合,以促进机体对钙和磷的吸收。
2.2 可以拮抗病原微生物2.2.1 抑制外源菌生长与定殖猪胃肠道内定殖的细菌可以有效的抑制外源菌生长与定殖,可以预防猪的病害和促进健康生长。
专性厌氧菌代谢产生的挥发性脂肪酸和乳酸,会降低胃肠道pH和氧化还原电势,给外源菌的生长和繁殖有一定的抑制作用,特别是使肠内容物变酸,促进了肠蠕动,使外源菌未能定殖便已被排出;肠道菌与上皮细胞的紧密结合,对宿主细胞形成了占位性保护。
益生菌对仔猪肠道菌群及生长性能的影响
组的变化及其影响因素[J].中国畜牧兽医,2021,48(2): 509-515. [2] 史超.早期补饲代乳料对哺乳仔猪断奶前后大肠微生物及代 谢产物的影响[D].南京:南京农业大学,2017. [3] 杨永霞.益生菌复合制剂对断奶仔猪腹泻的防治效果分析[J]. 国外畜牧学(猪与禽),2021,41(2):46-48. [4] 谢大识,李继仁,罗平华.复合微生态制剂对断奶仔猪生长 性能与腹泻率、盲肠与粪便微生物、免疫功能的影响[J].家 畜生态学报,2020,41(11):48-52. [5] 于治山.益生菌对不同日龄仔猪腹泻的调理[J].中国动物保 健,2018,20(4):25-27. [6] 蓝海恩,麦伟虹,黄焕昌,等.复合益生菌发酵饲料对断奶 仔猪生长性能、肠道微生物菌群、血清生化指标和免疫指标 的影响[J].中国饲料,2020(15):120-124. [7] 刘士奇,陈建,查剑平,等.复合益生菌对早期断奶仔猪肠 道抗炎作用及菌群结构的影响[J].中国兽医学报,2020,40 (10):2 032-2 039. [8] 熊云霞,张亚辉,李平,等.复合益生菌固态发酵豆粕对断 奶仔猪生长性能、肠道形态及肠道菌群的影响[J].动物营养 学报,2021,33(2):747-759.
作者简介:黄敏(1977-),女,广西昭平人,大专,畜牧师,研究方向:畜禽粪污资源化利用、畜禽生态养殖。
2021.19·
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Experimental research | 试验研究
发现仔猪红痢的防治方法为每天使用1~2 mL以乳酸菌 为主要成分的益生菌,2次/d,连续4 d左右;多发猪呼 吸道病综合症防治方法为母猪妊娠期全程,在日粮中拌 入1%~2%清温猪泰,这样可有效预防仔猪多发猪呼吸 道病综合症发病;仔猪黄痢的防治方法为每天使用1 mL 开口菌,2次/d,连续4 d左右,该方法可降低猪传染性 胃肠炎发病率;慢性仔猪副伤寒可全程饲用以活性乳酸 菌为主要成分的益生菌,添加量为2%,并配合使用发 酵植物精华和消化酶,也能增强治疗效果。益生菌对于 降低仔猪腹泻率,提高胃肠内有益菌数量具有积极作 用,不同日龄仔猪腹泻疾病可通过早期使用益生菌降低 发病率,提高仔猪猪生长性能的影响,以期为仔猪养殖过程中合理使用益生菌提供理论参考。
仔猪复合益生乳酸杆菌制剂及其作用机理的研究共3篇
仔猪复合益生乳酸杆菌制剂及其作用机理的研究共3篇仔猪复合益生乳酸杆菌制剂及其作用机理的研究1仔猪复合益生乳酸杆菌制剂及其作用机理的研究摘要随着家畜养殖业的发展,对于动物肠道健康的重视也越来越高。
本文研究了一种针对仔猪的复合益生乳酸杆菌制剂,并分析了其作用机理。
研究结果表明,复合益生乳酸杆菌制剂可以维持仔猪肠道菌群平衡,抑制有害菌的生长,增强肠道免疫力,提高仔猪生长性能和健康状态。
关键词:仔猪、复合益生菌、肠道菌群、免疫力、生长性能一、引言随着家畜养殖业的快速发展,动物肠道健康问题日益凸显。
肠道是动物体内最大的微生态系统,肠道内菌群对于动物的消化、营养吸收、免疫系统等具有重要影响。
而在现实生产中,由于环境污染,饲料不合理等多种因素,常常会导致动物肠道菌群失衡,引发肠道疾病。
同时,消耗了动物体内的养分和能量,导致生长性能下降,对肉类生产造成重大影响。
益生剂在维护动物肠道健康方面具有重要作用。
在益生剂中,益生菌和益生物质是最常用的两种形式。
益生菌是指能够在动物肠道内存活并对宿主有益的菌群,如乳酸杆菌、双歧杆菌、酵母菌等;益生物质则是通过菌群发酵制成的物质,如发酵乳、发酵饲料等。
复合益生菌制剂是近年来开发出的一种新型益生剂,它由多种益生菌组成,具有更强的维护肠道健康的能力。
本研究旨在开发一种复合益生乳酸杆菌制剂,探究其在维护仔猪肠道健康方面的应用价值和作用机理。
二、材料与方法1.制备复合益生乳酸杆菌制剂本研究选取了乳酸杆菌、双歧杆菌、酵母菌三种益生菌作为复合菌,分别在适宜的培养条件下进行纯菌培养。
然后将三种菌混合,并加入辅料和搅拌剂,进行制剂的生产。
2.动物试验选取生长健康、体重相似的仔猪,并随机分为两组,每组10头。
实验组喂养复合益生乳酸杆菌制剂饲料,对照组喂养普通饲料。
在试验开始前和结束后,对仔猪体重、血液指标、肠道菌群进行检测。
三、结果与分析1.复合益生乳酸杆菌制剂的制备图1为复合益生乳酸杆菌制剂的SEM扫描结果。
猪不同发育阶段肠道微生物菌群特征分析
猪不同发育阶段肠道微生物菌群特征分析陈宝剑,吴永绍,覃兆鲜,张冰,潘天彪,关志惠,陈少梅,吴柱月,谢炳坤*(广西壮族自治区畜牧研究所,广西家畜遗传改良重点实验室,广西南宁 530005)摘 要:为研究不同生长发育阶段猪肠道微生物菌群结构与特征的差异,本研究将50头28日龄体重8 kg左右的杜×长×大断奶仔猪随机分为5栏,分别在第60、90、120、150、180日龄饲喂前,从每栏随机挑选5头猪,每头采取100 g左右的新鲜粪样,采用16S rRNA高通量测序技术对微生物多样性进行研究。
结果显示:通过菌群分类学分析发现,不同时期猪肠道微生物分布于22个门、42个纲、74个目、119个科、321个属和579个种,厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroides)、螺旋体门(Spirochaetae)为主要优势菌门,不同时期的特异菌群显著差异;对丰度值前30的肠道菌群与血液免疫抗体浓度进行相关性关联分析发现,IL-2浓度与12个菌群存在显著相关性,IL-6浓度与14个菌群存在显著相关性,IgG浓度与12个菌群存在显著相关性,IgM浓度与11个菌群存在显著相关性,IgA浓度与26个菌群存在显著相关性。
综上表明,猪肠道微生物菌群结构与组成在不同生长发育阶段均存在显著差异,对猪免疫性能具有重要作用。
关键词:猪;肠道微生物多样性;16S rRNA测序中图分类号:S828.2 文献标识码:A DOI编号:10.19556/j.0258-7033.20200313-01猪肠道中微生物主要是厌氧菌和兼性厌氧菌,其中厚壁菌门和拟杆菌门占90%以上,在维护机体健康、提高机体免疫力、营养物质吸收代谢等方面发挥着重要作用[1]。
不同时期猪肠道微生物菌群有显著差异,胚胎时期肠道处于一种无菌状态,分娩过程中受母体产道、粪便以及周围环境的影响开始出现微生物,主要以大肠杆菌、葡萄球菌等为主[2]。
利用分子生物技术研究益生菌对断奶仔猪生长及粪便菌群的影响
利用分子生物技术研究益生菌对断奶仔猪生长及粪便菌群的影响1. 本文概述本文旨在探讨利用分子生物学技术研究益生菌对断奶仔猪生长及粪便菌群的影响。
断奶是仔猪生长过程中的一个关键阶段,此时仔猪的免疫系统尚未完全发育,肠道微生物群落也在逐渐形成和稳定。
益生菌作为一种有益微生物,能够通过调节肠道微生物平衡,促进肠道健康,提高动物生长性能。
本研究通过分子生物学手段,深入分析益生菌对断奶仔猪生长及粪便菌群的影响,以期为优化仔猪饲养管理、提高生产效益提供理论依据。
具体而言,本研究首先选取适当的益生菌种类和剂量,通过饲养试验观察其对断奶仔猪生长性能的影响。
随后,利用分子生物学技术,如高通量测序、实时荧光定量PCR等,对试验组和对照组仔猪的粪便样品进行肠道微生物群落结构和多样性的分析。
通过比较两组间肠道微生物群落的差异,探讨益生菌对肠道微生物群落的影响及其与生长性能的关系。
本研究的意义在于,通过分子生物学手段深入揭示益生菌对断奶仔猪生长及粪便菌群的影响机制,为益生菌在畜牧生产中的应用提供科学依据。
同时,也为今后开展相关研究和优化动物饲养管理提供参考和借鉴。
2. 材料与方法选用健康、体重相近的断奶仔猪(约21日龄,初始体重平均为[具体数值,例如]5 kg)若干头,按照随机化原则分为两组:对照组(仅饲喂基础日粮)和益生菌处理组(基础日粮中添加益生菌制剂)。
每组设重复,每个重复包含[适当数量,例如]10头仔猪,确保实验设计的统计学效力。
所使用的益生菌制剂由商业供应商提供,包含经筛选鉴定的多种有益菌株,如乳酸菌属(Lactobacillus spp.)、双歧杆菌属(Bifidobacterium spp.)以及芽孢杆菌属(Bacillus spp.)等,其活菌总数[具体数值,例如]1109 CFUg。
益生菌处理组的仔猪日粮中按推荐剂量([具体添加量,例如]01)均匀混合添加益生菌制剂。
所有仔猪均接受营养均衡且符合国家标准的断奶仔猪全价日粮,保证满足其生长所需的各种营养素。
仔猪早期肠道微生物变化特点与饲养管理
Experimental research | 试验研究垂直传递模式进行传递,形成仔猪肠道微生物群。
保持母猪身体健康、干净,可显著减少病毒传播,促进仔猪的健康生长。
为仔猪提供干净、整洁的生长环境,能明显减少病原菌的大范围传播,如饲养人员通过科学控制猪舍内部的湿度与温度,减小外界环境给母猪带来的刺激,减少应激反应的发生。
同时,定期清理粪便,如果猪舍内部堆积大量的粪便,仔猪出生后,和周围污染物密切接触,容易引发腹泻。
采用水泥地饲养方式,可取得较好效果,也有研究人员提出,通过采取发酵床饲养方式,对仔猪肠道健康有利,和水泥地饲养方式不同,发酵床主要采取干法分层技术,塑料和菌种等众多材料,按一定的比例放入发酵池的内部,可提升断奶仔猪的体重,降低仔猪出现腹泻的概率,确保仔猪肠道微生态环境的平衡[2]。
因为新生仔猪的身体基坑没有发育完全,皮下脂肪比较薄,被毛稀少,自身调温能力比较差,适应能力也比较差,因此,饲养人员需要采取有效的保温措施,保证猪舍干燥,严格控制猪舍内部温度与湿度,为仔猪提供更加舒适、温暖的环境,在提升仔猪机体免疫力的同时,促进仔猪健康生长发育。
2.2 加强仔猪管理力度第一,仔猪出生后,采用母乳饲喂方式,因为同伴之间的接触特别密切,会对仔猪的肠道菌群定植产生较大影响。
因为早期仔猪的免疫系统不是特别成熟,通过及时获取初乳,能让仔猪快速获取免疫球蛋白与充足营养,同时,和其他牛乳或者代乳品相比,采取母乳喂养方式,可有效提高仔猪体内肠道菌群的丰富度。
第二,做好仔猪哺乳期的管理工作。
因为仔猪体内的肠道微生物环境不是特别稳定,仔猪的免疫系统不是特别成熟,易出现病原体感染现象,所以,在断奶前,仔猪容易发生腹泻现象,而仔猪肠道菌群紊乱,是引发腹泻的主要原因。
通过加强母猪营养优化,可进一步提升仔猪健康水平。
如在母猪的妊娠后期,一直到泌乳期,通过饲喂益生元物质,对仔猪肠道内部的SCFAs含量起到一定改善作用,能显著提高仔猪肠道免疫能力。
仔猪断奶应激对肠道微生物菌群影响的研究
仔猪断奶应激对肠道微生物菌群影响的研究于光辉; 姜建阳; 张华杰; 耿梅; 宋春阳【期刊名称】《《中国兽医杂志》》【年(卷),期】2019(055)004【总页数】5页(P44-47,51)【关键词】肠道微生物; 断奶应激; 杜-长-大仔猪; 莱芜猪【作者】于光辉; 姜建阳; 张华杰; 耿梅; 宋春阳【作者单位】青岛农业大学动物科技学院山东青岛266109; 威海市动物疾病控制预防中心山东威海264200【正文语种】中文【中图分类】Q939.94断奶仔猪由于消化系统和免疫系统等生理机能发育不够完善,消化酶及胃酸分泌不足,肠道内微生物区系尚未建立,体温调节能力差[1],导致仔猪在断奶时会表现出一系列的症状,如食欲减退、消化力差、腹泻、抵抗力差、易被病原微生物侵袭等,从而造成消化不良、体弱、生长发育受阻、饲料报酬低等断奶应激综合征[2]。
断奶应激是猪生产中的一个普遍现象,给养猪业造成巨大的经济损失。
寄居在动物肠道中的细菌对于维持寄主的健康发挥着重要的作用,肠道微生物菌落能够帮助寄主消化吸收营养物质、提高免疫力、维持上皮细胞发育,并且是抵御外源致病菌的天然屏障[3]。
当然,肠道微生物也有不利的方面,它能通过与遗传距离较远的致病菌以等位基因交换的方式,或者整合几种致病菌的致病基因变为新的致病菌[4-5]。
断奶应激和日粮改变会打破微生态的平衡,导致乳酸菌减少,大肠杆菌增多,而多数人认为仔猪断奶后腹泻的主要致病菌就是大肠杆菌[6]。
乳酸杆菌与肠杆菌的比例通常被用于评价肠道的健康水平,比值增加说明肠道健康,断奶导致比值下降,仔猪肠道健康受到威胁引发腹泻甚至死亡,仔猪断奶后抑制肠道菌能够预防或者降低腹泻的程度[7]。
众所周知,中国地方品种猪经过几千年的遗传进化,有着丰富的遗传多样性,有很多优良性状是引进品种猪所不具备的,它们更能适应当地的气候环境,并且比国外品种有独特的抗逆性,肠道微生物菌群相对稳定,断奶应激反应相对较小。
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第二代测序技术-罗氏454焦磷酸测序技术 454测序法的步骤 (1)样品输出并片段化: GS系统支持各基因组DNA、PCR产物和细菌人工染 色体(BACs) 及cDNA、小分子RNA 的测序。先将基因组DNA 和BACs等通过物 理方法打断为300-800 bp 的片段,而对于短的小分子RNA 和PCR 用在DNA片段的 5′端加上磷酸基团,3′端变成平端,然后和两个44 bp 的衔接子( adaptor)A、B进行 平端连接。将样品5′端和3′端分别连接A和B衔接子。具展(分子生态学研究方法)
DNA 指纹图谱技术依据分子大小、核酸序列等特征的不同,将代 表微生物群落中各物种的 DNA 分子标记物在凝胶上进行电泳分离,使 代表不同物种的分子标记迁移到胶上的不同位置,最终得到的电泳图 谱用于显示群落的组成结构。DNA 指纹图谱的最大优点是方便、快速、 直观,常用于检测微生物群落结构的动态变化或比较不同群落之间的 结构差异。最常用的 DNA 指纹图谱技术包括变性梯度凝胶电泳 (Denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)[10,11,12]和末端片段长 度多态性(Terminalrestriction fragment length polymorphism, T-RFLP) 等。 不同于指纹图谱技术,DNA 测序技术的目的在于通过直接获取序 列核酸信息的方法,对群落中各物种的进化地位作出判断。基于单克 隆质粒、转化细胞构建和桑格(Sanger)双脱法。
仔猪肠道微生物菌群的研究
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目录
仔猪的肠道微生态
仔猪肠道菌群的形成
肠道菌群的研究方法进展
第二代测序技术-罗氏454焦磷酸测序技术
实验进展及后续实验计划
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仔猪的肠道微生态
仔猪肠道微生物区系随宿主日龄增加逐渐变得复杂多样,且形成 一个相对动态平衡、稳定的微生态系统,对宿主的生长和健康起着重 要作用。但报道认为,自然界中很多微生物不能用现有的培养方法进 行分离和鉴定或是不能培养[1,2],而且仔猪肠道中大部分微生物的生长 需要厌氧环境,因此人们对仔猪肠道及粪样微生物及其变化规律的了 解甚少。
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肠道菌群的研究方法进展(常规分离培养技术)
在肠道微生物学研究中,科学家们通常使用一定的选择 性液体或固体培养基,对粪便或肠道粘膜、肠道内容物等样 本进行培养和富集,并对培养得到的细菌种类进行分析[7]。 根据肠道细菌的特性,对肠道菌进行培养通常需要在厌氧的 条件下进行,严格的厌氧和培养基的选择对于肠道菌的分离 和生长具有非常重要的意义。 但是,局限于纯培养的方法具有很多不足之处。首先, 体外培养体系难以模拟微生物在肠道中自然生长繁殖的条件, 因此绝大多数的肠道微生物都还不能通过纯培养的方法得到 分离;其次,仅仅依靠形态学和生理生化检测也不能对菌株 进行准确的鉴定[8]。因此,在研究肠道菌群结构和功能的研 究中,研究者们通常结合分离培养方法和分子生物学方法, 对感兴趣的细菌种类进行研究。
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肠道菌群的研究方法进展(分子生态学研究方法)
分子生态学方法通常以环境中各种微生物的基因组核酸(DNA 或 RNA)为研究对象。在以肠道菌群为对象的分子生态学研究中,研究 者们最常使用核糖体小亚基RNA 基因(细菌中的 16S rRNA 基因)的 全部或部分序列作为分子标签来代表物种,以基因序列的多样性代表 物种的多样性,从而对菌群的组成结构进行分析。细菌 16S rRNA 基因 具有广泛性、进化变异小、具备高保守区和高变区(V 区)等特点, 同时序列还具有信息量巨大且更新迅速的公开数据库,如 Ribosomal Database Project(RDP)、SILVA 、Greengenes 等等,研究者们可以方 便地将自己研究中的 16S rRNA基因序列与数据库进行比对,确定细菌 的分类地位[9]。 常用的分子生态学分析方法分为两大类:基于 DNA 指纹图谱的分 析方法和基于DNA 测序技术的分析方法。除此之外,可用于实时定量 的荧光定量 PCR(Real time quantitative PCR)和荧光原位杂交技术 (Fluorescence in situ hybridization, FISH)也是常用的分析测序技术
焦磷酸测序法的原理 将PCR扩增的单链与引物杂交,并与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸 腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5′磷酸硫腺苷共同孵育,然后脱氧核糖核苷三磷酸即按照 碱基配对的原则依次连接到引物上。在每一轮测序反应中,只加入一种dNTP,若该dNTP与 待测模板配对, DNA 聚合酶可以将其掺入到合成链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团 ( PPi) 。ATP硫酸化酶在APS存在的情况下催化焦磷酸形成ATP,ATP驱动荧光素酶介导的 荧光素向氧化荧光素( oxyluciferin)的转化,氧化荧光素发出与ATP量成正比的可见光信号。 ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解,淬灭光信号,并再生反应体系,然后加入 下一种dNTP,如此循环[13]。
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仔猪肠道菌群的形成
新生动物肠道菌群形成可以划分为以下几个阶段 [3,4,5,6]。 第一阶段:新生动物出生两周以内,肠道内的细菌定 植方式基本相同。结肠内首先出现杆菌和肠链球菌,随之 很快出现双歧杆菌并成为优势菌,这个时期肠道菌群的特 点是不稳定,容易发生变化。 第二阶段:出生后两周到断奶以前,动物在母乳喂养 下,肠道内细菌主要以厌氧菌为主,主要为双歧杆菌,肠 杆菌和链球菌数量较少。这个阶段的特点是肠道菌群容易 受食物的影响,食物的微小改变就可以引起肠道菌群发生 较大的变化。 第三阶段:断奶以后,基本类似与成年动物肠道菌群。