浅谈体外培养成骨细胞
生物材料——骨组织工程讨论
生物材料——骨组织工程讨论组织工程（Tissue Engineering）是近年来正在兴起的一门新兴学科，组织工程一词最早是由美国国家科学基金会1987年正式提出和确定的。
它是应用生命科学和工程学的原理与技术，在正确认识哺乳动物的正常及病理两种状态下结构与功能关系的基础上。
研究、开发用于修复、维护、促进人体各种组织或器官损伤后的功能和形态生物替代物的科学。
组织工程的核心就是建立细胞与生物材料的三维空间复合体，即具有生命力的活体组织，用以对病损组织进行形态、结构和功能的重建并达到永久性替代。
共基本原理和方法是将体外培养扩增的正常组织细胞，吸附于一种生物相容性良好并可被机体吸收的生物材料上形成复合物，将细胞-生物材料复合物植入机体组织、器官的病损病分，细胞在生物材料逐渐被机体降解吸收的过程中形成新的在形态和功能方面与相应器官、组织相一致的组织，而达到修复创伤和重建功能的目的。
骨组织构建构建组织工程骨的方式有几种：①支架材料与成骨细胞；②支架材料与生长因子；③支架材料与成骨细胞加生长因子。
生长因子通过调节细胞增殖、分化过程并改变细胞产物的合成而作用于成骨过程，因此，在骨组织工程中有广泛的应用前景。
常用的生长因子有：成纤维细胞生长因子（FGF）、转化生长因子（TGF-ρ）、胰岛素样生长因子（IGF）、血小板衍化生长因子（PDGF）、骨形态发生蛋白（BMP）等。
它们不仅可单独作用，相互之间也存在着密切的关系，可复合使用。
目前国外重点研究的项目之一，就是计算机辅助设计并复合生长因子的组织工程生物仿真下颌骨支架。
有人采用rhBMP-胶原和珊瑚羟基磷灰石（CHA）复骨诱导性的骨移植、修复大鼠颅骨缺损，证实了复合人工骨具有良好的骨诱导性和骨传导性，可早期与宿主骨结合，并促进宿主骨长大及新骨形成。
用rhBMP-胶原和珊瑚复合人工骨修复兔下颌骨缺损，结果显示：2个月时，复合人工骨修复缺捐赠的交果优于单纯珊瑚3个月时，与自体骨移植的修复交果无明显差异。
体外培养软骨细胞方法及其影响因素的研究进展
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Ｍｅｄ
ｏｆ ｈｕｍａｎ
ａｒｔｉｃｕｌａｒ
ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ［ｊ］，Ｋａｏｈｓｉｕｎｇ Ｊ
万方数据
华北煤炭医学院学报２００９年７月第１ｌ卷第４期Ｊ
Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ ＣｏＭ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ２００９
Ｊｕｌｙ，１１（４）
・４９９・
３．２负性作用白细胞介索（ＩＬ）是由白细胞、内皮细胞、软骨 细胞等产生。ＩＬ对关节软骨细胞代谢作用主要表现为抑制透明 软骨特征性ｎ、ＩＶ型胶原的合成，促进Ｉ、ＩⅡ型胶原的合成，使软 骨细胞变性，抑制软骨细胞增殖和蛋白多糖的合成；对关节软骨 的降解作用主要表现在促进软骨细胞合成和分泌金属蛋白酶， 提高软骨基质巾溶解蛋白分子酶类的活性。大量实验研究表 明，ＩＬ一１、ＩＬ一２、ＩＬ一６、ＩＬ一８、ＩＬ一１０、ＩＬ一１２均与关节软・跨’损 伤有关。另外，ＴＮＦ也对软骨细胞有一定的损伤作用。 总之，体外关节软骨细胞培养的方法众多，并受到众多复杂 因素的调控，如何更好的综合运用这些方法，综合有利因素，仍 需大量实验进行进一步研究。 参考文献
石见穿萃取物对体外培养成骨细胞活性的影响
石见穿萃取物对体外培养成骨细胞活性的影响王朝元;徐宗【摘要】石见穿以95%乙醇抽提得总提物.分别用不同试剂萃取总提物,获得其石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物以及其水溶性成分.以体外培养成骨细胞MC3T3-E1为模型,用cck-8法测定细胞增殖,碱性磷酸酶(ALP)试剂盒法测定了上述不同萃取物对成骨细胞增殖和分化的影响.结果表明:总提物在浓度10～-3、10-4、10-5mg/mL时和10-3mg/mL乙酸乙酯萃取物具有极显著的促进细胞增殖(P＜0.01)作用.10-4mg/mL总提物和10-3mg/mL乙酸乙醇萃取物显著促进成骨细胞ALP活性(P＜0.05).研究表明石见穿乙酸乙酯萃取物舍有能促进成骨细胞增殖和成骨活性的有效成分.【期刊名称】《中南民族大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2011(030)001【总页数】4页(P33-36)【关键词】石见穿;萃取物;成骨细胞;细胞增殖;成骨活性【作者】王朝元;徐宗【作者单位】中南民族大学,生命科学学院,武汉,430074;中南民族大学,生命科学学院,武汉,430074【正文语种】中文【中图分类】Q949.777.6;Q253石见穿(S alvia chinensisBenth)为唇形科植物华鼠尾草的地上部分[1,2],作为常用草药,其名见于《本草纲目》仅有疗效记载,本品曾收载于《中国药典》(1997年版)一部,为中草药的一种.其疗效包括清热解毒,活血止痛等.在中医中可用于治疗急慢性肝炎[3]、肾炎、风湿骨痛、癌症[4]、面神经麻痹、白带、痛经[5]、淋巴结结核、乳腺炎、跌打损伤、蛇咬伤、痈肿热痛等症,尤其具有治疗骨病的疗效.李时珍在《本草纲目》卷二十一草部记载有石见穿用于治疗骨痛.中医临床研究证实其具有一定的治疗骨相关疾病的疗效,包括:治疗风湿骨痛,跌打损伤的疗效[2].但是,其何种成分对成骨细胞的增殖和成骨活性有促进作用还不明确.石见穿对成骨细胞的代谢的影响尚未见相关的报道.因此,本研究旨在通过分离石见穿的不同组分,研究其具有治疗骨病疗效的有效成分,以期进一步研究其作用机理[6-10].1.1.1 药品与试剂石见穿药材采自湖北省利川县并保存于中南民族大学药学院标本馆,经中南民族大学药学院万定荣教授鉴定确认后用于本实验.其它主要试剂:己烯雌酚(DES)(购自武汉银信);新生小牛血清(美国Gibco Corporation);DEM E培养基(新西兰HyClone Corporation)、胰蛋白酶(杭州吉诺公司);CCK-8(日本同仁化学公司);碱性磷酸酶(AL P)试剂盒(南京建成生物技术有限公司)、考马斯亮兰试剂盒(南京建成生物技术有限公司).小鼠成骨样细胞系M C3T3-E1(购自中科院上海细胞研究所).1.1.2 仪器CO2培养箱(HF151UV CO2培养箱,上海力申科学仪器有限公司);XDS-1B型倒置生物显微镜(重庆光电仪器总公司);ELX808型酶标仪(美国Bio-Tek公司);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂).1.2.1 药物的制备称取石见穿5 kg,经95%的乙醇浸泡24 h后过滤,残渣继续经95%的乙醇浸泡24 h,过滤,如此反复3次,合并滤液,减压回收溶剂获得浸膏189 g.浸膏用90%的甲醇溶液溶解,为总提物.部分总提物用石油醚萃取.溶液分为2层,上层为石油醚部位,减压回收得石油醚萃取物;下层部分用乙酸乙酯萃取.溶液分为2层,上层为乙酸乙酯部位,减压回收得乙酸乙酯萃取物;下层为水层加入等量正丁醇萃取,回收上层得正丁醇萃取物;下层为水部位,减压回收得水萃取物.称取已经真空干燥后所得恒重的总提物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水萃取物浸膏各0.01 g,加200μL DM SO 溶解,取其中100μL加入50mL培养基,用微孔滤膜过滤除菌,制成浓度10-1mg/mL药液.取此药液用培养基逐级稀释为10-2、10-3、10-4、10-5mg/mL不同浓度梯度备用.阳性对照:称取0.01 g己烯雌酚,用200μL DM SO 溶解,再以含10%小牛血清M EM 培养基稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5mg/mL 过滤除菌备用. 阴性对照液:不加药的10% 小牛血清培养基.1.2.2 细胞培养用10%小牛血清的DM EM培养基培养M C3T3-E1细胞.细胞传代时,将长满M C3T3-E1细胞的培养瓶中的培养液倾倒,用PBS清洗2次,在培养瓶中加入0.25%胰蛋白酶0.5 mL,消化2～3 m in,待大多数细胞变圆脱落,加入4 mL灭菌的10%的小牛血清和双抗的培养液终止消化.1500 r/m in离心沉淀细胞.1.2.3 成骨细胞增殖实验1)CCK-8法吸光度与细胞数目曲线测定.将收获的成骨细胞分别以密度0、0.2×104、0.4×104、0.8×104、1.6×104细胞/孔接种于96孔板培养24 h,每种处理设5个复孔.采用cck-8法[11],用酶标仪于450 nm处测定各孔的吸光度. 2)不同萃取物对成骨细胞增殖影响.按密度0.4×104细胞/孔接种于96孔板,培养24 h,换液,加入含相应萃取物的培养基100μL,每组设5个复孔.同时以不加药培养基为空白对照,以己烯雌酚为阳性对照.培养72 h后,向每孔加入10 μL cck-8,3 h 时后测定OD值[11].1.2.4 成骨细胞分化功能测定1)AL P试剂盒标准曲线测定.细胞悬液分别以密度 0、0.2×104、0.4×104、0.8×104、1.6×104、3.2×104细胞/孔接种于96孔板,每孔设5个复孔,培养24 h,加0.1%T riton X-100/PBS液裂解细胞12 h,按AL P试剂盒介绍的方法测定成骨细胞的碱性磷酸酶的活性.2)不同萃取物对成骨细胞活性的影响.细胞悬液按1×105细胞/孔密度接种于96孔板,培养24 h,更换含药培养基,每孔100μL,继续培养7 d后裂解细胞,按AL P试剂盒法于520 nm处测定吸光度,按考马斯亮兰法于595 nm处测定蛋白质含量(g/L).AL P活性以U/gprot表示.1.2.5 统计方法实验所得数据用SPSS10.0软件系统进行显著性差异分析处理,当P≤0.05,表示两者有显著差异;当P≤0.01,表示两者有极显著差异.2.1.1 CCK-8法线性关系考察以5孔吸光度的平均值(y)与细胞数(x)作线性回归,得回归方程:y=0.2396x+2.5503(R2=0.9981,n=5).由图1可见,在(0～1.6×104)细胞/孔范围内,细胞数与吸光度具有良好的线性关系.2.1.2 不同萃取物对成骨细胞增殖的影响以图1结果为基础,按0.4×104细胞/孔接种96孔板,并用萃取物处理细胞,结果见表1.由表1可知,10-3～10-5mg/mL总提物明显促进成骨细胞的增殖(P＜0.05);10-3～10-5mg/mL乙酸乙酯萃取物能极明显地促进成骨细胞的增殖(P＜0.01),增值率达到39%,正丁醇部位10-1、10-2、10-5能明显地促进成骨细胞的增殖(P＜0.05).且所有药物处理组的细胞增殖率均高于阳性对照组.2.2.1 AL P试剂盒法线性关系的考察以5孔吸光度的平均值(y)与细胞数目(x)作线性回归,得回归方程:y=0.03955x+1.1067(R2=0.9741,n=5).由图2可见,在(0～3.2×104)细胞/孔范围内,细胞数与吸光度(AL P活性)呈良好的线性关系.2.2.2 石见穿萃取物对成骨细胞分化的影响成骨细胞总蛋白测定结果见表2.以图2结果为基础,细胞悬液按1×105细胞/孔接种于96孔板,并用萃取物处理成骨细胞,结果见表3.由表3可知,10-3～10-5mg/mL 总萃取物,10-4～10-5mg/mL乙酸乙酯萃取物,10-3mg/mL正丁醇萃取物能明显提高成骨细胞AL P活性水平(P＜0.05),尤其10-3mg/mL乙酸乙酯萃取物能极显著提高成骨细胞AL P活性水平(P＜0.01).其它萃取物对成骨细胞的分化均无明显影响.本研究首次以体外培养的成骨细胞M C3T3-E1为模型,研究了石见穿萃取物对骨细胞增殖和成骨活性的影响.结果表明石见穿的部分萃取物对成骨细胞均具有一定的促进增殖和成骨活性的影响.由此对于进一步研究石见穿治疗骨折药效的机理提供了基础.研究结果表明,石见穿的多种萃取物对成骨细胞均具有一定的促进增殖的作用.其中,以乙酸乙酯萃取物的效果最好.一般乙酸乙酯萃取物的成分主要为黄酮类化合物,该类化合物已证实对骨折的愈合具有较好的促进作用.而骨折的愈合与成骨细胞的增殖和分化有密切关系.因此,笔者初步判断,石见穿的乙酸乙酯萃取物可能含有促进成骨细胞成骨活性的该类化合物.碱性磷酸酶是成骨细胞活性的主要标志.在骨骼发育及骨折愈合等情况下,旺盛生长和分化的成骨细胞表现出强烈的碱性磷酸酶活性.与上述细胞增殖结果一致,石见穿的乙酸乙酯萃取物对成骨细胞碱性磷酸酶活性具有较强的诱导作用.此研究初步证实了石见穿治疗骨折的药效,笔者下一步将进一步分离纯化石见穿的化学组分,分析各组分对成骨细胞的增殖和分化的影响,以期查明其治疗骨病的有效成分,为未来开发该药提供依据.【相关文献】[1] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:人民卫生出版社,1977:138.[2] 万定荣,陈家春,余汉华.湖北药材志[M].北京:科学技术出版社,2002:90-94.[3] 郑海英,武一曼,林信宽,等,流式细胞术检测石见穿多糖诱导的肝癌细胞凋亡率[J].福建中医学院学报,2009;19(3):20-21.[4] 郑海英,徐炜,郑晓燕,等,石见穿多糖的提取及其对肝癌细胞增值的抑制作用[J].中国中医药科技,2008;15(5):360-362.[5] 王梅,韦小芳,杨艳琪.石见穿对大鼠子宫内膜异位症模型形态及结构的影响[J].中医药学报,2006.34(1):18-22.[6] 许美娟,林永东.石见穿化学成分的研究[J],中草药,1987,18(9):430-432.[7] Hou G Q,Xue L X.A n activated mTOR/p 70S6K signaling pathway in esophageal squamous cell carcinoma cell lines lines and inhibition of the pathway by rapamycin and siRNA against mTOR[J].Cancer L etters,2007,253:236-248.[8] Hu YM,L iu C,Cheng KW,et al.Sesquiterpenoids from Homalomena Occulta affect osteoblast proliferation, differentiation and m ineralization in vitro[J].Phytochemistry,2008,69:2367-2373.[9] Isama K,T suchiya T.Enhancing effect of poly(L-lactide)on the differentiation ofmouse osteoblast-like M C3T3-E1 cells[J].Biomaterials,2003,24:3303-3309.[10] Kanazawa I,Yamaguchi T,Yano S,et al.M etform in enthances the differentiation and m ineralization of osteoblasticM C3T3-E1 cells via AM P kinase activation as well as eNOS and BM P-2 expression[J]. 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光生物调节作用对高糖环境下成骨细胞影响的体外实验研究
■论著・光生物调节作用对高糖环境下成骨细胞影响的体外实验研究*王欢欢萇彪李炜温宁【摘要】目的：研究高糖环境下光生物调节作用对成骨细胞增殖、分化的影响。
方法：将成骨前体细胞MC3T3-E1分为对照组、光照组、高糖组和高糖+光照组，首先用CCK-8法检测各组24h、48h和72h的细胞活力，然后检测14天碱性磷酸酶染色情况及其活性，并对21天钙结节进行茜素红染色并半定量分析，实时荧光定量PCR检测21天成骨相关基因OCN、Runx2的表达，最后统计学分析各组间的差异。
结果：与对照组相比，光照组在24h、48h、72h的细胞活力增强，14天时碱性磷酸酶染色及活性增强，21天钙结节形成增加、OCN 和Runx2的表达上升；与对照组相比，高糖组在48h、72h的细胞活力下降，14天时碱性磷酸酶染色及活性减弱，21天钙结节形成减少、OCN及Runx2的表达降低；高糖+光照组与高糖组相比，在24h、48h、72h的细胞活力升高，14天时碱性磷酸酶染色及活性增强，21天钙结节形成增加、OCN和Runx2的表达增强；高糖+光照组与对照组相比，在21天时钙结节形成增加，其余指标差异无统计学意义。
结论：在高糖环境下，成骨细胞经光生物调节作用，可补偿高糖对细胞增殖分化的抑制，可为促进高糖环境下颌骨缺损的<关键词：光生物调节作用；高糖环境；成骨细胞；颌骨缺损［中国图书分类号］R783［文献标识码］A D01:10.19749/.cjgd.l672-2973.2021.03.001Effect of photobiomodulationon osteoblasts in high glucose environment in vitroWANG Huan—hua(+CHANG Biao,LI Wei,WEN N ing.(Beijing Friendship Hospital Affiliated to Capital Medical University G Chinese Academy ofSciences G Chinese PLA General Hospital,Beijing100050,China)［Abstract］Objective:To study the effect of photobiomodulation(PBM)on the proliferation and differentiation of osteoblasts in high glucose environment.Methods:MC3T3-E1cells were divided into four groups:control group,light group high glucose group,and high glucose+light K-8method was used to detect the cell viability of MC3T3-E1cells at24h, 48h and72h,alkaline phosphatase staining and its activity at14d were detected,alizarin red staining and semi quantitative analysis were performed on calcium nodules at21d,and the expression of osteogenic related genes OCN and Runx2at21d were detected by real-time quantitative PCR.Finally,the differences between the groups were statistically analyzed.Results: Compared with the control group,the cell viability of t he light group increased at24h,48h and72h,the alkaline phosphatase staining and its activity increased at14d,the calcium nodule formation increased at21d,and the expression of OCN and Runx2increased;Compared with the control group,the cell viability of high glucose group decreased at48h and72h,the staining and activity of alkaline phosphatase decreased at14d,the formation of calcium nodule decreased at21d,and the expression of OCN and Runx2decreased;Compared with the high glucose group,the viability of cells in the high glucose+ light group was increased at24h,48h and72h,the alkaline phosphatase staining and activity increased at14d,the calcium nodule formation increased at21d,and the expression of OCN and Runx2increased;The calcium nodule formation increased at21d in the high glucose+light group and the other indexes were not statistically significant compared with the control group.Conclusion:Low level laser irradiation of osteoblasts can compensate the inhibition of cell proliferation and differentiation caused by high glucose,which can provide a theoretical basis for promoting the repair of j aw defects in high glucose environment.Key words:photobiomodulation(PBM);high glucose environment;osteoblasts;jaw defects水基金项目：国家自然科学基金（项目编号：51972339）王欢欢首都医科大学附属北京友谊医院口腔科医师北京100050萇彪解放军总医院第一医学中心激光科主治医师北京100853李炜中国科学院博士北京100049温宁通讯作者解放军总医院第一医学中心口腔科主任医师教授北京100853・129・由外伤、炎症、肿瘤等引起的颌骨缺损在口腔临床中极为常见，而糖尿病患者因机体长期处于高血糖水平，会引起骨代谢紊乱，影响颌骨缺损修复[I]O有研究表明，光生物调节作用（photobio-modulation,PBM）可以作用于骨缺损区促进骨再生[2-3]o光生物调节作用又叫做低强度光疗、弱激光治疗等，主要指利用低强度的激光照射组织或细胞，引起光生物的治疗。
小鼠成骨细胞体外分离培养及鉴定
随着细 胞培 养技术 的发展 ，采用 体 外 培养 成 骨 细胞 评 价人工 骨 替 代材 料 的生 物 活 性 、 物 相 容性 生 及骨 诱 导 性 等 ， 已成 为 重 要 的研 究 手 段 。成 骨 １ 细胞 的体 外 培 养 可 以 排 除 体 内多 种 因 素 的相 互 影
（． １石河子大学医学院新疆地方与民族高发病重点实验室 ； ２ 石 河子 大学 医学 院组织胚 胎 学教 研室 ， ． 新疆 石 河子 ，３０ ２ ８ ２０ ）
【 摘要 】 的 ： 目 目 针对 前体外培养成骨细胞方法各异 ， 建立一种 简易 的原代培养成骨细胞 的方法 ， 并研究其生物学特
２０ ０ ８年 ｌ 月 ２
农
垦
医
学
Ｄｅ ２ ０８ ｃ． ０
第３ ０卷
・
第６ 期
Ｊｕ ａ ｆ ｎ ｋ ｎ Ｍｅ ｉｉｅ ｏ ｒ ｌ ｇ ｅ ｄｃｎ ｎ ｏ Ｎｏ
Ｖ０ ． ０ Ｎｏ． １３ ６
论著 ・
小 鼠成 骨 细 胞 体 外 分 离 培 养 及 鉴 定
符毓 豪 王 菊２ 周 宗瑶２
～
２ ｉ， 洗 ， 干 ； 甘 油 明胶 封 片 ， 检 ； 所 染 ｍｎ 水 待 ⑤ 镜 ⑥
结 果 为红色 即 为 阳性 ， 之为 阴性 。 反
骨带骨膜 ， 经无菌 Ｐ Ｓ缓 冲液洗 涤 ２ Ｂ ３次 ， 在含 １％ ５
１４ ３ 钙 化 结节 染 色 （ 素红 法 ） 细 胞 接种 方 法 ．． 茜 同上 ， 培养 １ｄ后 ， 下 可 见 黑 色 不 透 明 区 域 ， 时 ０ 镜 此 进行 染 色 ， ７ ％ 乙醇 固定 １ｍｎ０ ２ 用 ５ ０ ｉ， ． ％茜 素 红 染 色 ３ｍｎ蒸馏 水 冲洗 ， 油 明胶 封 片 。 ０ ｉ， 甘
王朝元绿原酸对体外培养成骨细胞活性的影响_王朝元
第32卷第2期中南民族大学学报（自然科学版）Vol．32No．22013年6月Journal of South-Central University for Nationalities （Nat．Sci．Edition ）Jun．2013收稿日期2012-11-26*通讯作者杨光忠（1968-），男，博士，教授，研究方向：天然药物化学，E-mail ：yanggz888@126．com作者简介王朝元（1964-），男，教授，博士，研究方向：生物医学工程，E-mail ：wangchaoyuan@mail．scuec．edu．cn 基金项目湖北省自然科学基金资助项目（2009CDZ033）绿原酸对体外培养成骨细胞活性的影响王朝元1，易继凌1，宋超1，魏甜甜1，唐俊龙1，杨光忠2*（1中南民族大学生命科学学院，武汉430074；2中南民族大学药学院，武汉430074）摘要为研究接骨草成分之一绿原酸（CGA ）对成骨细胞MC3T3-E1活性的影响，采用MTT 法检测11．02，22．05，44．09，88．19μmol /L CGA 对成骨细胞增殖率，碱性磷酸酶（ALP ）试剂盒检测成骨细胞ALP 活性，实时定量PCＲ检测成骨细胞骨相关基因的表达．结果表明：11．02 88．19μmol /L CGA 对成骨细胞增殖具有明显的促进作用．培养2d ，44．09μmol /L CGA 能促进ALP 表达上调；22．05，44．09μmol /L CGA 能促进ALP 、Ｒunx2、Osterix 、c-jun 和c-fos 基因的表达；培养6d ，44．09μmol /L CGA 能促进c-fos 基因的表达；在整个培养过程中，I 型胶原（Col-I ）基因的表达具有浓度和时间依赖性．故CGA 具有一定的成骨活性，是接骨草的成骨活性成分之一．关键词绿原酸；成骨细胞；碱性磷酸酶活性；成骨分化相关基因中图分类号Q813．1；Q786文献标识码A文章编号1672-4321（2013）02-0046-05Effects of Chlorogenic Acid on the Activity of Cultured Osteoblasts in vitroWang Chaoyuan 1，Yi Jiling 1，Song Chao 1，Wei Tiantian 1，Tang Junlong 1，Yang Guangzhong 2*（1College of Life Science ，South-central University for Nationalities ，Wuhan 430074，China ；2College of Pharmacy ，South-central University for Nationalities ，Wuhan 430074，China ）AbstractTo investigate the effect of chlorogenic acid （CGA ），one of the components of Sambucus chinensis ，on theosteogenic activity of cultured osteoblasts ，osteoblasts were treated with 11．02，22．05，44．09，88．19μmol /L CGA ，respectively．MTT assay ，alkaline phosphate （ALP ）kit ，real-time PCＲwere used to measure the proliferation rate ，ALP activity and expression of bone-related genes in osteoblasts．The results showed that 11．02 88．19μmol /L CGA could promote the proliferation rate remarkably．The activity of ALP in osteoblasts was up-regulated when treated with 44．09μmol /L CGA for 2d．The expression of bone-related genes such as ALP 、Ｒunx2、Osterix 、c-jun and c-fos could be enhanced when treated with 22．05，44．09μmol /L CGA for 2d．The expression of c-fos could be promoted when treated with 44．09μmol /L CGA for 6days．In the whole process ，the expression of Col-I was increased in a time-dependent and concentration-dependent manner ．Therefore ，CGA showed osteogenic activity ，which demonstrated that it was one of the osteogenic active ingredients of Sambucus chinensis ．Keywordschlorogenic acid ；osteoblasts ；ALP activity ；bone differentiation related genes接骨草（Sambucus chinensis ）为忍冬科接骨木属，又名陆英、杜仲．主要分布于华北、华南、陕西、甘肃、四川、宁夏等省区．接骨草的根、茎、叶、花和果实均可入药，有祛风除湿、活血化瘀之功效．在传统中医药中，它可治疗风湿疼痛、痢疾、黄疸、慢性气管炎、风疹瘙痒、丹毒、跌打损伤和骨折［1，2］，目前关于接骨草防治骨质疏松和促进成骨细胞增殖的报道较多［3］，但其促进骨折愈合的有效成分尚不清楚．绿原酸（chlorogenic acid ，CGA ）是接骨草的化学成分之一，通常存在于杜仲、金银花、葵花籽粕等植物中［4，5］．现有研究表明：CGA 具有广泛的生理活性和药理活性，如利胆、抗菌、降压、增加白血球和兴奋中枢系统，抗肿瘤，清除自由基等［6-8］．故本实验以成骨细胞MC3T3-E1为体外模型，研究CGA 对成骨细胞活性、ALP 活性和成骨分化相关基因的影响，以阐明其是否具有促成骨作用，为接骨草的临床应用提供理论依据．1材料和方法1．1试剂和仪器CGA （SIGMA-ALDＲICH 公司），α-MEM 培养基（Thermo 赛默飞世尔生化制品有限公司），胎牛血清（杭州四季青公司），0．25%的胰蛋白酶（Thermo ），青链霉素（Thermo ），DMSO （Amresco ，0231），MTT （Amerro ），碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物工程研究所），BCA 蛋白试剂盒（碧云天生物技术研究所），反转录试剂盒（Thermo ），SYBＲGreen 荧光染料（日本TOYOBO 公司）．细胞培养瓶（美国Corning 公司），96孔、24孔、6孔培养板（美国Corning 公司），CO 2培养箱（HF90/240型，利康生物医疗科技控股集团），倒置显微镜（Motic AE21型，重庆光学仪器），酶联免疫分析仪（MULTISKAN ASCENT 354型，thermo ），PCＲ仪（Biometra ），凝胶成像分析仪（JS-380A ，上海培清科技），荧光定量PCＲ仪（ABI ，7500fast ）．1．2不同浓度CGA 的制备称取0．05g CGA 溶于50mL α-MEM 培养基（无血清），配制成浓度为1mg /mL 的储备液．再用含10%血清的α-MEM 培养基将CGA 储备液倍比稀释为11．02，22．05，44．09，88．19μmol /L 等处理细胞．1．3成骨细胞MC3T3-E1的培养取液氮冻存的成骨细胞MC3T3-E1复苏后，用含有10%胎牛血清的α-MEM 完全培养基，置于37ħ培养箱中培养，每隔3 4d 更换1次培养基，待细胞90%铺满瓶底时，用0．25%的胰蛋白酶消化，按1︰2传代培养．1．4CGA 对成骨细胞增殖率的影响将生长状态良好的MC3T3-E1细胞以5ˑ103/孔接种于96孔板中，置于37ħ，5%CO 2培养箱中培养．细胞贴壁后，分别加入含上述浓度CGA 的培养基，设不加药为对照组，每组5个复孔，分别培养0，1，3d 后，每孔分别加入20μL MTT ，置于37ħ，5%CO 2培养箱中进行培养，反应4h ，小心吸出上清液，每孔加入150μL DMSO ，吹打均匀后，在37ħ培养箱中温育10min ，使其紫色结晶完全溶解，用酶标仪在492nm 波长处测定其OD 值．1．5CGA 对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响将生长状态良好的成骨细胞MC3T3-E1按105/孔接种到24孔板中，置于37ħ，5%CO 2培养箱中培养．待细胞贴壁后加入22．05，44．09μmol /L 药物（该浓度下对成骨细胞增殖促进作用较好）设不加药为对照组，每组3个复孔，分别培养2，4，6d 后，按照ALP 试剂盒和BCA 蛋白试剂盒的操作步骤测定细胞中ALP 活性．1．6CGA 对成骨细胞成骨分化相关基因表达的影响将生长状态良好的MC3T3-E1细胞按2ˑ105/孔接种到6孔板中，置于37ħ，5%CO 2培养箱中培养．待细胞贴壁后加入药物，设不加药为对照组，每组3个复孔，分别培养2，4，6d 后，用Trizol 法提取总ＲNA ，用反转录试剂盒合成cDNA ，并进行real-time PCＲ．反应条件：95ħ，15s ；60ħ，15s ；72ħ，45s ；40个循环．以看家基因GAPDH 为内参，每个样品设3个复孔，采用2﹣ΔΔCt 法［9］检测成骨分化相关基因的表达，不同骨相关基因PCＲ引物序列如见表1．表1荧光定量PCＲ引物序列Tab．1Primer sequences of real-time PCＲ基因名称上游引物（5'-3'）下游引物（5'-3'）3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH ）AACTTTGGCATTGTGGAAGGACACATTGGGGGTAGGAACA原癌基因（c-fos ）CCAGTCAAGAGCATCAGCAA AAGTAGTGCAGCCCGGAGTA 原癌基因（c-jun ）TCCCCTATCGACATGGAGTC TGAGTTGGCACCCACTGTTA 成骨转录因子（Ｒunx2）TCACTACCAGCCACCGAGAC ACGCCATAGTCCCTCCTTTT 成骨转录因子（Osterix ）ATGGCGTCCTCTCTGCTTGAG AGGACTGCCTGCAGGAGAGAG 碱性磷酸酶（ALP ）GCTGATCATTCCCACGTTTT CTGGGCCTGGTAGTTGTTGT I 型胶原（Col-I ）ACGTCCTGGTGAAGTTGGTCCAGGGAAGCCTCTTTCTCCT1．7统计学处理根据公式F =2﹣［（待测组目的基因平均Ct 值－待测组内参基因平均Ct 值）－（对照组目的基因平均Ct 值－对照组内参基因平均Ct 值）］，计算出目的基因的相对表达量．用单因素方差分析（one-way ANOVA ）对结果进行显著性差异分析．74第2期王朝元，等：绿原酸对体外培养成骨细胞活性的影响2结果与分析2．1CGA 对成骨细胞增殖的影响不同浓度CGA 对成骨细胞增殖的影响结果见图1．如图1所示，CGA 浓度为11．02 88．19μmol /L 时，对成骨细胞的增殖均有较好的促进作用，选择22．05，44．09μmol /L 两个浓度用于后续实验．1）control ；2 5）依次为11．02，22．05，44．09，88．19μmol /L CGA与对照组比较，＊＊P ＜0．01，n =3图1不同浓度CGA 对成骨细胞增殖活性的影响Fig．1Effect of different concentrations of CGA on the proliferation of osteolasts2．2CGA 对成骨细胞ALP 活性的影响CGA 对成骨细胞ALP 活性的影响见图2．由图2可见，培养2d 时，44．09μmol /L 的CGA 能促进成骨细胞MC3T3-E1ALP 活性的表达（P ＜0．01）．培养4d 时，CGA 对成骨细胞MC3T3-E1ALP 活性无显著影响（P ＞0．05）．随着培养时间的增加，培养至6d时，22．05、44．09μmol /L CGA 对成骨细胞ALP 活性的影响具有抑制作用（P ＜0．05）．1）control ；2）22．05μmol /L CGA ；3）44．09μmol /L CGA与对照组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01，n =3图2绿原酸对成骨细胞碱性磷酸酶活性的影响Fig．2Effect of chlorogenic acid on ALP activity of osteoblasts2．3CGA 对成骨细胞成骨分化相关基因mＲNA 表达的影响CGA 对c-fos 基因mＲNA 表达的影响见图3．由图3可见，培养2d 时，2种浓度的CGA 对c-fos 基因的表达均有极显著促进作用（P ＜0．01）；4d 时，44．09μmol /L CGA 对c-fos 基因表达的影响逐渐由促进转为抑制（P ＜0．05）；6d 时，22．05μmol /L CGA 对c-fos 基因表达明显抑制（P ＜0．01），呈时间依赖性．1）control ；2）22．05μmol /L CGA ；3）44．09μmol /L CGA与对照组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01，n =3图3CGA 对成骨细胞c-fos 表达的影响Fig．3Effect of CGA on c-fos expression of osteoblastsCGA 对c-jun 基因表达的影响见图4．由图4可见，22．05μmol /L CGA 短期处理（2 4d ）不影响c-jun 基因表达（P ＞0．05），长期处理（6d ）则表现为抑制作用（P ＜0．05）．44．09μmol /L CGA 处理2d可显著促进c-jun 基因表达（P ＜0．01），长期处理（4 6d ）则具有显著的抑制作用（P ＜0．01）．故CGA 对成骨细胞c-jun 基因表达亦呈明显的时间依赖性．1）control ；2）22．05μmol /L CGA ；3）44．09μmol /L CGA与对照组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01，n =3图4CGA 对成骨细胞c-jun 表达的影响Fig．4Effect of CGA on c-jun expression of osteoblastsCGA 对Ｒunx2基因表达的影响见图5．由图5可见，其影响呈明显的时间依赖性．22．05μmol /L CGA 培养2 4d 时，对Ｒunx2基因的表达呈上调作用（P ＜0．01），至6d 时，则表现为强烈的抑制作用（P ＜0．01）．44．09μmol /L 的CGA 在短期处理（2d ）时，显著促进Ｒunx2基因的表达（P ＜0．01），但是随着培养时间的延长，促进作用变成抑制（P ＜0．01）或没有显著影响（P ＞0．01）．84中南民族大学学报（自然科学版）第32卷1）control ；2）22．05μmol /L CGA ；3）44．09μmol /L CGA与对照组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01，n =3图5CGA 对成骨细胞Ｒunx2表达的影响Fig．5Effect of CGA on Ｒunx2expression of osteoblasts如图6所示，CGA 对osterix 基因表达的影响也具有明显的时间依赖性．两种浓度的CGA 短期处理（2d ）时，均极显著地促进Osterix 基因的表达（P ＜0．01）．随着培养时间的增加（4 6d ），两种浓度的CGA 处理对成骨细胞osterix 表达的促进作用显著减弱，直至抑制作用（P ＜0．01）．1）control ；2）22．05μmol /L CGA ；3）44．09μmol /L CGA与对照组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01，n =3图6CGA 对成骨细胞Osterix 表达的影响Fig．6Effect of CGA on Osterix expression of osteoblasts如图7显示，与CGA 对ALP 基因表达的影响与osterix 基因类似，也具有明显的时间依赖性．培养2d ，2种浓度的CGA 均促进ALP 基因的表达（P ＜0．05）；4 6d 时，2种浓度的CGA 对ALP 基因的表达均具有不同程度的抑制（P ＜0．05）．图8中CGA 对Col-I 基因表达的影响也呈明显的时间依赖性．但与CGA 对Osterix 和ALP 基因表达的影响相反，随着培养时间的延长，CGA 对Col-I 基因表达的促进作用增强．在2 6d ，22．05μmol /L CGA 对Col-I 基因表达的影响由抑制转为促进（P ＜0．01）；而44．09μmol /L 的CGA 对Col-I 基因表达的影响始终具有促进作用（P ＜0．05），随着培养时间的增加，促进作用愈发显著（P ＜0．01）．1）control ；2）22．05μmol /L CGA ；3）44．09μmol /L CGA与对照组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01，n =3图7CGA 对成骨细胞ALP 表达的影响Fig．7Effect of CGA on the ALP expression ofosteoblasts1）control ；2）22．05μmol /L CGA ；3）44．09μmol /L CGA与对照组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01，n =3图8CGA 对Col-I 表达的影响Fig．8Effect of CGA on Col-I expression of osteoblasts3讨论MC3T3-E1细胞系是由C57BL /6小鼠颅骨细胞建株的成骨细胞，具有碱性磷酸酶活性，I 型胶原合成和基质钙化等成骨细胞的生物学特性，常作为骨代谢研究的细胞模型［10］．故本研究以MC3T3-E1细胞系来探讨CGA 对成骨细胞增殖及活性的影响．本实验中，11．02 88．19μmol /L 的CGA 在不同的时间点对成骨细胞的增殖均具有一定的促进作用，以22．05，44．09μmol /L 的CGA 在2个浓度的CGA 进行进一步研究．ALP 的表达是成骨细胞分化早期的主要特征之一，是成熟成骨细胞的标志，其活性的高低可反映成骨细胞的活性状况［11］．故本文研究了CGA 对ALP 活性的影响．在2 6d ，随着处理时间的延长，22．05μmol /L CGA 对ALP 活性的影响由不影响变为抑制，44．09μmol /L CGA 对成骨细胞ALP 活性的影响则由促进变为抑制，并与随后的CGA 对ALP 基因表达的影响结果一致．说明CGA 对成骨细胞ALP 活性的调控主要通过对其mＲNA 转录的调控来实现．94第2期王朝元，等：绿原酸对体外培养成骨细胞活性的影响Ｒunx2是干细胞向成骨细胞早期分化的重要标志基因，高表达Ｒunx2可激活骨钙蛋白、骨桥蛋白和骨涎蛋白的转录和表达，从而促进成骨细胞成熟［12］．Osterix是一种成骨细胞特异性表达的锌指结构转录因子，对成骨细胞的分化起着重要作用．Osterix转录受Ｒunx2正性调控，直接促进前成骨细胞向成骨细胞分化．Osterix能调控许多重要成骨细胞晚期表型和功能蛋白的表达，如骨钙蛋白、骨桥蛋白、骨涎蛋白及I型胶原［13］．在本研究中，CGA对Ｒunx2和Osterix 基因的表达具有显著的时间依赖性，短期处理可以促进Ｒunx2和Osterix mＲNA的表达，随着处理时间的延长，则表现为抑制作用．这一结果说明CGA短期处理可能促进干细胞向成骨细胞的分化，而长期处理则不利于干细胞向成骨细胞的分化．十分有意义的是，CGA可以促进成骨细胞Col-I 的表达．I型胶原蛋白是成骨细胞分泌的骨主要有机成分，是成骨细胞的分化标志之一［14］．本实验中，除了短期培养（2d）时，低浓度（22．05μmol/L）的CGA 对Col-I基因的表达具有一定抑制作用（P＜0．05），4 6d，CGA均能显著促进Col-I基因的表达，并呈时间依赖性．说明合适浓度的CGA对成骨细胞成熟具有正向调控作用，有助于骨基质的形成和骨生长．原癌基因c-fos产物与其他一些转录因子如c-jun 表达的癌蛋白结合，形成活性蛋白-1（AP-1），进而调控其他基因的转录，导致一系列生物学效应的产生，进而促进细胞的分裂增殖［15］．在成骨细胞中，c-jun 调控相关基因如骨钙素、I型胶原、碱性磷酸酶和组蛋白转录［16］，故c-jun是调节成骨细胞增殖分化的基因之一．本研究中，CGA对c-fos和c-jun表达影响具有一定的复杂性，尚需进一步的研究阐明其机理．综上所述，CGA具有调控成骨细胞增殖和分化的能力，CGA可促进成骨细胞的增殖，抑制成骨细胞ALP活性；CGA长期处理不利于干细胞向成骨细胞的分化，它通过促进I型胶原的表达而促进骨成熟分化．故CGA具有一定的成骨活性，是接骨草的成骨活性成分之一．参考文献［1］蔡凌云．接骨草黄酮成分的初步研究［J］．凯里学院学报，2010，28（6）：62-65．［2］张金昕．杜仲和续断在骨伤科中的应用［J］．陕西中医学院学报，2009，32（1）：74-75．［3］钱维娜，张艳红．杜仲对体外培养大鼠骨髓基质细胞增殖和分化的影响［J］．安徽农业科学，2009，37（14）：6461-6462．［4］李胜华，李爱民，伍贤进．接骨草化学成分研究［J］．中草药，2011，42（8）：1502-1504．［5］尉芹，马希汉，景谦平．杜仲叶中绿原酸的提取工艺件研究［J］．林产化学与产业，2001，21（4）：27-32．［6］Hai-Tao Lu．Application of preparative high-speed counter-counter chromatography for separation of chlorogenic acidfrom Flos Loncease［J］．J Chromatogr A，2004，1026（1/2）：185-190．［7］史秀玲，高银辉．绿原酸对小鼠急性肝损伤的保护作用［J］．中国实验方剂学杂志，2011，17（19）：199-202．［8］王丽萍，郭栋，王果，等．中药绿原酸的研究进展［J］．时珍国医国药，2011，22（4）：961-963．［9］Livak K J，Schmittgen T D．Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCＲand the2-ΔΔT method［J］．Methods，2001，25（4）：402-408．［10］Sudo H，Kodama H，Amagai Y，et al．In vitro 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activator protein1transcriptional activity in the regulation ofgene expression by transforming growth factor beta1andbone morphogenetic protein2inＲOS17/2．8osteoblast-like cells［J］．J Bone MinerＲes，2000，15（12）：2352-2361．05中南民族大学学报（自然科学版）第32卷。
体外培养成骨细胞的研究进展
体外培养成骨细胞的研究进展
徐杨俊;赵建宁
【期刊名称】《中国骨伤》
【年(卷),期】2010(023)007
【摘要】随着体外细胞培养技术的发展,人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞,研究表明培养出的成骨细胞具有良好的生物学特性,在不同环境下可以形成骨组织,联合支架的应用,构建组织工程骨,将其植入体内修复骨缺损.现就成骨细胞的来源、分化调控因子、复合移植及中医药方面的研究进展作一综述.
【总页数】4页(P562-565)
【作者】徐杨俊;赵建宁
【作者单位】南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院骨科,江苏,南
京,210002;南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院骨科,江苏,南京,210002【正文语种】中文
【相关文献】
1.补肾方剂对成骨细胞体外培养干预的研究进展 [J], 贾英民;武密山;李恩
2.成骨细胞体外培养模型的研究进展 [J], 孙中洋;李东韬;赵学武;张舒
3.电离辐射对体外培养成骨细胞影响的研究进展 [J], 李玉梅;赵铱民
4.淫羊藿对体外培养成骨细胞影响的研究进展 [J], 孙海涛;丁仁
5.成骨细胞体外培养研究进展 [J], 徐展望;许波;李军
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人骨关节炎软骨细胞的体外培养及细胞形态学分析
人骨关节炎软骨细胞的体外培养及细胞形态学分析唐新;郑果;黄强;李棋;付维力;李箭;陈刚;周宗科;裴福兴【摘要】目的：研究人骨关节炎关节软骨细胞的体外分离及培养方法，观察各代人关节软骨细胞的形态学特性，为临床基础研究提供参考依据。
方法取全膝置换术患者残存的无菌膝关节软骨，采用两步酶消化法（胰蛋白酶＋Ⅱ型胶原酶）分离培养人关节软骨细胞，并进行传代培养。
通过倒置相差显微镜下观察每代的细胞形态，甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色对细胞进行进一步鉴定后绘制生长曲线。
结果两步酶消化法消化出的软骨细胞呈接近圆形，培养2~3 d，细胞贴壁、变形，呈多角形或条状，2周左右细胞融合成层，4代后出现明显分化，软骨细胞增殖和生长缓慢。
形态学、免疫组织化学染色显示细胞培养4代以内可以保持表型的稳定。
结论体外培养骨关节炎软骨细胞4代以内生长良好，生物学特性明显，4代以后出现去分化现象，提示我们2或3代骨关节炎软骨细胞是用于实验研究的最佳选择。
%Objective To study the methods for isolation,culture and identification of articular chondrocytes as well as the biological characteristics from osteoarthritis patients in vitro. Methods Cartilage was harvested under sterile conditions from osteoarthritis knee joints in total knee arthroplasty. Human articular chondrocytes were isolated by using two-step enzymatic di-gestion,and the cells were cultured and subcultured respectively in vitro. Cell morphology were observed under phase-contrast microscope,toluidine blue staining,type Ⅱ collagen immunohistochemistry staining and growth curve was drawn. Results The morphology of osteoarthritis chondrocytes was similar to fibroblasts,and the growth rate was slowly. It could get a confluent layer after culture for about two weeksand appeared distinct differentiation in passage four. Toluidine blue staining and type Ⅱ colla-gen immunohistochemistry staining showed that the chondrocytes cultured in vitro maintained the specific chondrocytes pheno-type in the first 4 passages. Conclusion Within 4 passages,the osteoarthritis chondrocytes grew well with obviously biological characteristics and turned to dedifferentiation after 4 passages.【期刊名称】《实用骨科杂志》【年(卷),期】2015(000)007【总页数】5页(P614-617,618)【关键词】骨关节炎;人软骨细胞;细胞学【作者】唐新;郑果;黄强;李棋;付维力;李箭;陈刚;周宗科;裴福兴【作者单位】四川大学华西医院骨科，四川成都610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都 610041;四川大学华西医院骨科，四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】R684.3骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种随年龄增长而发生率明显增加的退行性关节疾病，其发病是一个多因素参与的复杂过程[1]，至今其病因和发病机理仍不是十分清楚。
大鼠骨髓基质干细胞的体外培养及成骨诱导分化
大鼠骨髓基质干细胞的体外培养及成骨诱导分化【摘要】目的:研究大鼠骨髓基质干细胞体外培养的方法及成骨能力。
方法: 通过密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,检测细胞表面标志、定向成骨分化和细胞矿化作用。
结果: 原代培养大鼠骨髓基质干细胞通过3~5代传代,细胞形态趋于一致,诱导条件下出现矿化结节。
结论:大鼠骨髓基质干细胞体外培养可模拟成骨分化过程,可作为骨组织工程研究的细胞学模型。
【关键词】骨髓基质干细胞;诱导分化;成骨细胞【中图分类号】r414.1【文献标识码】b【文章编号】1005-0515(2010)009-0010-01骨髓基质干细胞(bone marrow stromal stem cells, bmscs)是一类具有分化潜能的成体干细胞,在特定条件下可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞、神经细胞等多种细胞,被认为骨组织工程中的最佳种子细胞。
本实验通过贴壁培养法和密度梯度离心法分离成年大鼠骨髓基质干细胞,定向成骨分化,并检测细胞表面标志、碱性磷酸酶活性和细胞矿化作用。
材料和方法1 材料1.1 实验动物。
成年wistar 大鼠,雌雄不限,体重150~180 g ,由浙江大学华家池动物实验中心提供。
1.2 实验试剂。
胎牛血清,胰蛋白酶(hyclone),(杭州四季清生物技术有限公司),b一甘油磷酸纳(sigma,usa),地塞米松(sigma,usa),维生素c(sigma,usa),小鼠抗大鼠oc单克隆抗体(r-d,usa),兔抗大鼠cd4(ba0532)、cd44(ba0321)、cd54(ba0541)、cd105(ba1725)、fibronectin(ba1772)、collagen ⅰ(ba0325)、egfr1(b0485)亲和纯化抗体(武汉博士德公司)2 方法2.1 bmscs的分离和培养:成年wistar大鼠麻醉后处死,无菌条件下取股骨.用含10%fbs的高糖dmem培养液冲洗骨髓腔.制成骨髓单细胞悬液。
人骨髓基质干细胞体外诱导为成骨细胞的实验研究
ａｓ ｙ Ｒｅ ｕ ｔ ： ｉｒ ｓ ｐ ， Ｐ ｓａ ｎｎ ， ｎ Ｋｏ ｓ ｔｉ ｉ ｇ ａ ｄ ＡＬＰ ａ ｓ ｙ ａｌ ｈ ｗ ｈ ｔ ｔ ｅ ｃ ｌ ｕｔ ｒｄ ｗｉ ｎ ｉ ｏ ａ ｃ ｌ ｒ ｓ ａ ． ｓ ｌ Ｍ ｃ ｏ ｃ ｙ ＡＬ ｔｉ ｉ ｇ Ｖｏ — ￣ａ ｓａ ｎｎ ｎ ｓ ｏ ｓａ ｌ ｓ ｏ ｔ ａ ｈ ｅｌ ｃ ｌ ｅ ｔ ｃ ｄｔ ｎ ｌ ｕｔ ｅ ｓ ｕ ｈｏ ｉ ｕ ｍｅ ｉｍ ａ ｅ ｔ ｅｃ ａ ａ ｔ ｒ ｔ ｓａ ｄ ｔ ｅａ ｔ ｉ ｆｔ ｅｏ ｔｏ ｌ ｔ ． ｎ ｌ ｓ ｎ： Ｂ Ｓ ｓｃ ｎ ｂ ｄ ｃ ｄ ｔ ｉ ｅ ｅ ｔ ｔ ｔ ｔ ｏ ｌ ｓ ｄ ｕ ｈ ｖ ｈ ｈ ｒ ｃｅ ｉ ｉ ｎ ｈ ｃ ｉ ｔ ｏ ｈ ｅ ｂａ ｓ Ｃｏ ｃｕ ｉ ｈ Ｍ Ｃ ａ ｅｉ ｕ ｅ ｄ ｆ ｒ ｎ ｉ ｅｉ ｏ ｏ ｅ ｂ￣ｔ ｓｃ ｖｙ ｓ ｓ ｏ ｎ ｏ ｆ ａ ｎ ｓ
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大鼠骨髓基质干细胞体外培养及定向诱导分化为成骨细胞的实验研究
广
西
医
科
大
学
学
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Hale Waihona Puke ２ ０ ｒ ０ ７ Ａｐ ； ４（ ） ２ ２
１
・２９ ５ ・
大 鼠骨髓 基质 干细胞 体 外 培 养及 定 向诱 导分 化 为成 骨细 胞 的 实验研 究
１ ２ ５ 成 骨 细 胞 鉴 定 ： 碱 性 磷 酸 酶 （ Ｌ ） 色 ： 代 培 养 ．． ① Ａ Ｐ染 传
细 胞 长 满 后 ，． ５ ０ ２ ％胰 酶 消 化 制 成 浓 度 为 １ ０／ 的细 胞 ×１ ｍｌ
甘油 磷 酸 钠 、 碱性 磷 酸 酶 检 测 试 剂 盒 等 。 １１ ３ 培 养 液 配 置 ： 基 础 培 养 液 ： ．． ① ＤＭＥ 培 养 液 （ ｌ Ｍ 含 ５
由广 西 医科 大 学 实 验 动 物 中心 提 供 。 １１ ２ 主要 试剂 ： ．． ＤＭＥ 培 养 液 （ Ｉ Ｃ 、 牛 血 清 （ Ｂ Ｍ Ｇ Ｂ Ｏ）胎 ＧＩ—
Ｃ 、ｅｃ ｌ分 离 液 （ ＨＡＲ Ａ Ｉ 、 塞 米 松 、 生 素 Ｃ、一 Ｏ）ｐ ｒｏ１ Ｐ Ｍ Ｃ Ａ） 地 维 Ｂ
目前 种 子 细 胞 的来 源 有 骨 、 膜 、 髓 及 骨 外 组 织 口 ， 多 研 骨 骨 ］许 究发 现 骨 髓 来 源 的 种 子 细 胞 最 具 优 势 。 骨 髓 基 质 干 细 胞 （ ｏ ｅｍａｒｗ ｓｒｍａ ｃｌ ， ＭＳ ｓ 是 来 源 于 骨 髓 基 质 的 一 Ｂ ｎ ｒｏ ｔ ｏ ｌ ｅ ｓＢ ｃ ） ｌ 种 间充 质 细 胞 ， 有 多 向分 化 潜 能 ， 一 定 的 诱 导 下 可 向 成 具 在 骨细 胞 分 化 。本 实 验 通 过 研 究 大 鼠 骨 髓 基 质 干 细 胞 体 外 培 养 的生 长 特 点 和诱 导 条 件 下 的成 骨 能 力 ， 下 一 步 构 建 组 织 为
体外培养成骨细胞的研究进展
医 药方 面的研 究进 展 作 一 综 述 。
【 键 词 】 成 骨 细胞 ； 细 胞 培 养技 术 ； 移植 ； 中药 关
・
５ ２・ ６
中 国骨 伤 ２ １ ０ ０年 ７月 第 ２ 卷 第 ７期 Ｃ ｉａＪＯ ｔｏ ３ ｈｎ ｒ ｐ＆ Ｔａ ｍ Ｊ １ ０１ Ｖｏ． Ｎｏ７ ｈ ｒｕ ａ ｕ． ０， １ ２ ２３， ．
，
・
综 述 ・
体外培养宁 赵
（ 京 大 学 医学 院 临 床 学 院 南京 军 区南 京 总 医 院 骨科 ， 苏 南京 南 江 ２００ ） １０ ２
ｃ ｎ ｔ ｃ ｉｎ ｏ ｓ ｕ ｎ ｉ ｅ ｒ ｄｂ ｎ ｂ ｌｎ ｅ ｅｂ ｄ ｅ ａ ｒ ｏ ｅｄ ｆ ｃｓ Ｉ ｉ ａ ｔ ｌ ｔｅ ｓ ｕ ｃ ｆ ｓｅ ｂａ ｔ ｏ ｓｒ ｔ ｆ ｉｓ ｅ ｅ ｇｎ ｅ ｅ ｏ ｅ， ｅ ｉ ａ ｔｄ ｉ ｔ ｏ ｙｔ ｒ ｐ ｉ ｎ ｅ ｅ ｔ． ｎ ｔ ｓ ｒ ｃｅ， ｏ ｒ ｅｏ ｔｏ ｌｓ ， ｕ ｏ ｔ ｍｐ ｎｈ ｏ ｂ ｈ ｉ ｈ ｏ ｒ ｇ ｌｔ ｒ ｃ ｏ ， ｏ ｏ ｉ ｒ ｆ ａ ｄ Ｃ ｉ ｅ ｅｍｅ ｉｉ ｅｒ ｓ ａ ｃ ｒ ｇｅ ｓ ｅ ｅｒ ｖ ｅ ｄ ｅ ｕａ ｏｙ ｆ ｔｒ ｃ ｍｐ ｓ ｅｇ ａ ｎ ｈ ｎ ｓ ｄｃ ｎ ｅ ｒｈ ｐ ｏ ｒ ｓ ｒ ｅ ｉｗｅ ． ａ ｔ ｔ ｅ ｗ Ｋｅ ｒ ｓ Ｏｓｅ ｂａ ｔ ； Ｃ ｌ ｃ ｌ ｒ ｅ ｈ ｉ ｕ ； Ｔ ａ ｓ ｌｎ ａ ｉｎ； Ｃ ｉ ｅ ｅｈ ｒ ａ ｄ ｕ ｓ ｙｗｏ ｄ ｔ ｏ ｌｓｓ ｅｌ ｕ ｔ ｅｔｃ ｎ ｑ ｅ ｕ ｒ ｎ ｐ ａ ｔｔ ｈ ｎ ｓ ｅ ｂ ｌ ｒ ｇ ｏ
间充质干细胞体外诱导生成软骨细胞的研究进展
限制 了细 胞 间信 号 传 递 。阻 碍 细 胞 因子 对 软 骨 细 胞 的调 节 作 用 ，影 响 软 骨 细 胞
既然骨髓 、 肪组织 、 带血 、 脂 脐 滑膜 、 的进 一 步 分 化 及 成 熟 。单 层 培 养 最 主 要
应 用 。间 充 质 干细 胞 （ ｓｎ ｈ ｍａ ｓ ｍ Ｍｅｅ ｃ ｙ ｌ ｔ 骨 骼 肌 、骨 膜 等 组 织 都 可 分 离 出间 充 质 的弊 端 ， 随着 传 代 次数 的增 多 ， 骨 细 ｅ 即 软 ｃｌ ） ｅ ｓ 由于 具 有 良好 的 多 向分 化 潜 能 、 ｌ 来 干 细 胞 。那 么 不 同 来 源 的 ＭＳ ｓ是 否 具 胞 会 出现 去 分 化 和 老 化 现 象 ，上 述 情 况 Ｃ 源 方便 等优 势 ，近年 来 日益 成 为 人 们 关 有 相 同的 分 化 能 力 ？ Ｓ ｋ ｇ ｃ ｉ 用 人 ａ ａ ｕ ｈ￣
发现 它还 可 以 向脂 肪 、 袭 性 软骨 缺损 通 常 由创 伤 及 关 节 了更 为 深 入 研 究 ，
寿 分 炎 等 原 因 引起 ， 一 种 常 见 的 骨 科疾 病 ， 肌 肉等 其 他 各 种 间 充 质 组 织 分 化 。也 正 充 质 细 胞 不 论 是 在 数 量 、 命 、 化 能 是 都 由于 软 骨组 织 无 血 管 、 经 和 淋 巴 管 ， 因如 此 ．人 们 将 这 些 成 纤 维 细 胞 集 落 形 力 等 方 面 ， 表 现 出 与 供 者 年 龄 呈 负 相 神 同 时 软 骨 细胞 代 谢 率 低 ．加 之 在 基 质 纤 维 成 单 位 定 义 为 问 充 质 干 细 胞 。后 来 的 研 关 的趋 势 ＿ 。 近年 来 ． 究 人 员 还 从 头 ４ ｌ 研 网中 的 增 生 和迁 移 受 限 。故 当软 骨 组 织 究 进 一 步 证 明 ．间 充 质 干 细 胞 是 一 种 来 皮 ＿、 水 ［ 、 周 膜 、 ６羊 ］ ７牙 １ 鼠类 前 列 腺 组 织 ９ １ Ｓ ｓ遗 并 受 到 破 坏后 ， 自行 修 复 能 力 非 常有 限 ， 源 于 中胚 层 的 具 有 高 度 增 殖 能 力 及 多 向 ［ 中 成 功 获 得 Ｍ Ｃ ， 憾 的是 ， 没 有 其 往 往 会 造成 不可 逆 转 的功 能 障 碍 ．从 而 分 化 潜 能 的 成 体 干 细 胞 ，不 仅 能 够 分 化 对 这 些 不 同 组 织 源 性 ＭＳ ｓ的软 骨 细 胞 Ｃ
体外培养破骨细胞功能的定量评定
体外培养破骨细胞功能的定量评定摘要目的建立适用于体外药理学研究的破骨细胞骨吸收功能的定量评定方法。
方法机械分离法获得破骨细胞，接种于象牙簿片底物上，分别于培养1d、3d、5d、7d取出象牙簿片各4张，采用光镜和扫描电镜观察骨吸收陷窝数量的变化；对随机拍摄的陷窝照片进行计算机形态计量分析，测算陷窝的面积和深度。
结果骨吸收陷窝计数光镜法和扫描电镜法具有良好的相关性，r＝0.9998，P＜0.001。
随着培养时间的延长，陷窝数量逐渐增多、面积扩大、深度加深。
结论骨吸收陷窝计数光镜法可以用于体外培养破骨细胞功能的定量评价，结合陷窝面积和深度分析，可以较为全面地评价体外培养破骨细胞的骨吸收功能。
关键词破骨细胞骨吸收陷窝数量面积深度Quantitative Evaluation of The Function of OsteoclastGultured in VitroZhan Hongshenget al Zhejiang college of Traditional Chinese Medicine,Hangzhou(310053)Shi Yinyu,Zhao Yongfang(Shanghai University of TCM)Objective To establish a quantitative evaluation method of absorptive function of osteoclast which is fit for pharmacological studies.Method Get osteoclast by mechanical dispersionmethod,inoculate it on thin ivory slices,take out four slices respectively after culturing for 1d,3d,5d,and 7d,observe the changesof the lacuna amount of bone absorption with light mirror andscanning electric mirror,make a quantitative analysis of computerform to the randomly taken pictures of lacunae,measure the area and depth of the lacunae.Results Light mirror method of bone absorptive lacunae amount had a good correlation with scanning electric mirror method,r＝0.9998，P＜0.001.With increasing the culture time,there are more,larger and deeper lacunae.Conclusions Counting light mirror method of bone absorptive lacunae could be used for quantitative evaluation of the osteoclast function cultured in vitro,combiningwith the analysis of lacunae area and depth,we could more completely evaluate the bone absorptive function of osteoclast cultured in vitro.Key words osteoclast,bone absorptive lacunae,amount,area,depth正常骨重建起始于破骨细胞的激活，破骨细胞性骨吸收伴随生命活动的始末，破骨细胞异常活跃或功能低下，可诱发一系列临床病症，如骨质疏松症、Paget氏病、关节置换术后假体松动、牙周病变或骨硬化症等。
现代医学实验学-成骨细胞的培养和骨折模型的制作
4.培养瓶 培养瓶在接种前，使用1%多聚赖氨酸快速包被（具体方 法：每个50ml培养瓶加3-4ml1%多聚赖氨酸，尽量是底壁均铺满液体 ，拧上盖子，放置30min，倒掉1%多聚赖氨酸液体，用去离子水或PBS 液冲洗两遍）， 包被的培养瓶，细胞很容易贴壁 。
大鼠成骨细胞
2铝
目前认为一些疾病如骨质疏松、骨软化等 与铝中毒有关。铝蓄积于骨骼，对骨骼和 神经系统等产生危害。文献报道低浓度铝 可刺激体外培养的成骨细胞的增殖和分化 ，铝对成骨细胞的作用不受培养液中生长 因子变化的影响。高剂量铝可抑制成骨细 胞的生长发育并对其产生一定的毒性作用
3氟
氟 一方面 作为骨基质构成物参与骨形成过程 ，另一方面，过量的氟摄入可导致齿、骨等 组织及器官的损害。体外研究则表明，氟通 过对成骨细胞的有丝分裂的作用促使成骨细 胞的生长速度加快、数量增多、功能增强。 氟对成骨细胞的作用与铝有所不同，需依赖 于培养液中部分生长因子，除去这些生长因 子，可消除氟对成骨细胞的作用.
传代培养步骤
1.弃除旧的培养液（可以吸，可以倒，倒的时候小心） 2.用PBS冲洗一遍（加PBS清洗或换液时，不要将细胞冲刷下来） 3.用0.25%的胰酶消化液消化30-45s，在显微镜下观察，细部变圆， 间距增大时，可用手拍打瓶侧壁与底壁，会发现细胞很快悬浮。 4.加入含15%的牛血清培养液终止消化 5.用吸管反复细心吹打瓶底，置离心管中后，可以用PBS或DHANKS再吹打，可以反复几次，目的是将细胞尽可能的洗刷干净
样细胞不会引起明显的改变 ,而单次高剂量辐射（ 400 cGy）却使克隆成骨细胞系MC3T3-E1 的 ALP 活性增加. 2 微重力 目前认为失重条件下骨形成受到抑制是造成骨质 脱钙的主要原因，特别是成骨细胞数目的减少和活性
软骨细胞体外培养及鉴定
括：Ｉ、 、Ⅺ型胶原、蛋 白聚糖 、软骨连接蛋白和基质蛋 Ｉ Ⅸ
白，以及 在不 同生 长阶段 所表 达 的蛋 白，其 中 儿型胶 原和 蛋 白聚糖 是 评价 软骨 细胞 功能 的主要 指标 。
２ 软 骨 细胞 的 来 源
体 外软 骨细 胞培 养可 取材 于成 熟软 骨组 织 ， 可 由间充 也
骨髓 分造 血和基 质 两大 系统 ， 骨髓 基质含 有 能分化 为成
骨细 胞 、 骨细 胞 、 软 脂肪 细胞 及肌 细胞 的 前体细 胞群 ，称 为 骨髓 基质细 胞 （ ａ ｏ ｒｍａｃｌ ＭＳ Ｓ） ｍ ｒ ｗ ｓ ｏ ｌｅ ， Ｃ 或骨 髓 间充质 ｒ ｔ ｌ
干 细胞 （ ｓｎ ｈ ｍａ ｅ ｃｌ ＭＳ ） ｍｅｅ ｃ ｙ ｌｔｍ ｌ ｓ ｅ ， ＣＳ 。ＭＳ ｓ 一种 多潜 Ｃ是 能成体干 细 胞 ，主要 存脂肪 干 细胞 、血管 内皮细 胞 、胚 胎干 细
３３
文 章 编 号 ：ｗｇ ２ １１ －２ ４ ｓ ｋ ０］ — ２０ ２
软 骨 细 胞 体 外 培 养 及 鉴 定
王 勇平 蒋 壶
软 骨 组 织 （ ａｔａ ｅ 由软 骨 细胞 （ ｈ ｎ ｒｃｔ）和 细 ｃｒ ｌｇ ） ｉ ｃ ｏ ｄｏ ｙｅ 胞外 基 质 （ ｘｒｃ ｌ ｌ ｔ ｘ Ｃ ） 成 ，软 骨细胞 是 软 ｅ ｔ ｅｌ ａ ｍａｒ ，Ｅ Ｍ 构 ａ ｕｒ ｉ 骨组 织 中 唯一 的细胞 成 分 ，是软 骨破 坏过 程 中的靶 细 胞 ，因 此软 骨细胞 的体 外培养 是研 究关 节软骨 生理及 病理 的常用 体 外实 验模 型 …。软骨 组 织 内无血 管 ，软 骨 细胞 所需 营养 由软
２１ ０ ２年
－
０ ８月
第 ９卷 第 ４期
成骨细胞的体外培养与鉴定
成骨细胞的体外培养与鉴定☆
王 勇平 ，廖 皴 ，蒋 矗
Ｉ ｖ ｔｏ ｌｕｒ ｎｄ ｉ ｎ ｉｒ ｃｕ ｔ ｅ ａ ｄｅｎ ｉ ｃ ｔｏｎ ｏ ｔ ｏ ａ ； ｔ ｉ ａ ｉ ｆｏｓ ｅ ｂｌ ｓ ｓ ｆ ｔ
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王 勇平 ， 廖 皴 ，蒋 壶 ． 骨 细 胞 的 体 外 培 养 与 鉴 定 ［ ． 国 组 织 工 程 研 究 与 临 床 康 复 ，２ １ ， １ （３： ３ —２ ４ 成 Ｊ中 】 ０ １ ５３ ） ２ １ ３ ６ ６
Ａｂｓ ｒ ｃｔ ｔａ ＢＡＣＫＧＲＯＵＮＤ： ｅ ｍｅ ｈ ｓｏ ｓ ｅ ｂ ａ ｔ ｕｔ ｒ 『 ｖｔ ａ ｅ ｃ ｒ ｎ ｌ ｉ ｔ ｓ Ｔｈ ｔ ｏｄ ｆｏ ｔ ｏ ｌ ｓ ｌ ｅ 门 ｉ ｏ ｈ ｖ ｅ ｔ ｉ ｔ ｉ ｃ ｕ ｒ ａｉ ｍ ａ ｏｎ ． ０ＢＪＥ ＣＴＩ ＶＥ： ｕ ＴＯ ｓ ｍｍａｒ ｅ ｏｓ ｅ ｂ ａ ｔｓ ｕ ｃ ｉ ｉ ｏ ｃ ｔ ｅ ｍｅ ｈ ｄ， ｕｌ ｒ ｏｎ ｉｏｎ ａ ｄ ｉｅｎ ｉｃ ｔ ｎ ｓ ｇ ｓ ｉ ｔ ｏ ｌ ｓ ｏ ｒ ｅ，ｎ ｖｔ ｕｌ ｔ ｏ ｃ ｔ ｅ ｃ ｄ ｔ ， ｎ ｚ ｒ ｕｒ ｕ ｉ ｄ ｔ ａｉ ｉｎ ｉ ｆ ｏ Ｍ ＥＴ ＨＯＤＳ： ｃ Ａ ｏｍｐ ｔ ｒｂ ｅ ｅ ｒ ｖ ｓ ｐ ｒ ｍｅｄ ｉ ｂＭｅ ｎ ａ ｆ ｎ ｄａ ａ ａ ｅ ｅ ｃ ｕ ｅ － ａｓ ｄ ｒ ｔｉ ａｌ ｅ ｗａ ｅ ｆ ｏｒ ｎ Ｐｕ ｄ ａ ｄ Ｗ ｎ ａ ｇ ｔ ｂ ｓ ｓ ｔ ｓ ａｒ ｈ ｍａｎ ｓ ｒｐ ｓ ｐ ｂ ｉｈ ｄ ｏ ｕ ｃ ｉ ｔ ｕ ｌ ｅ ｓ ｂ ｔ ｅ ０ ０ ａｎ ０１ ｔ ｈ ｅｙｗｏ ｄｓ ｓ ｅ ｂｌｓ ． ｅ ｌ ｕｌ ｅ ｉ ｅ ｔ ｃ ｔ ｎ”ｉ Ｅｎ ｉ ｈ ａ ｄ Ｃｈ ｎ ｓ ｎ ｕａ ｅ ． ｅ ｐ ｐ ｓ ｅ ｗｅ ｎ ２ ０ ｄ ２ ｗｉ ｔ ｅ ｋ ｒ ”ｏ ｔ ｏ ａ ｔ ｃ ｌ ｃ ｔ ， ｄ ｎ ｉ ａ ｉ ０ ｈ ｕｒ ｉ ｆ ｏ ｎ ｇｌ ｎ ｉ ｅ ｅ ｌ ｇ ｇ ｓ Ｔｈ ａ ｅｒ ｓ ａ ｄ ｓ ｒ ｉ ｇ ｉ ｉ ｏ ｃ ｌ ｅ ａｎ ｎ ｉｃ ｔ ｎ ｏ ｓ ｅ ｂ ａ ｔ ｒ ｎ ｌｄｅ ． ｅ ｃ ｉ ｎ ｖｔ ｕｔ ｄ ｉ ｔ ｉａ ｉ ｆｏ ｔ ｏ ｌ ｓ ｓ ｗｅ ｅ ｉ ｃ ｕ ｄ Ｒｅｐ ｔ ｉｅ ｒ ｓ ａ ｃ ｎ ｂ ｎ ｒ ｕｒ ｄｅ ｆ ｏ ｅ ｉ ｖ ｅ ｅ ｒ ｈ ａ ｄ Ｍｅｔ ｎ ｙ ｉ ｒ ｃ ｕ ｅ ｔ ａ ａ ａｌｓｓ ｗｅ ｅ ｅｘ ｌ ｄ ｄ． ＲＥＳＵＬＴ ＡＮＤ Ｓ ＣＯＮＣＬＵＳｌ ＯＮ： ｉ ｈ ｅ ｅ ｏ ｍ ｅ ｔ ｆ ｅ ｌ ｕｔ ｒ ｈｎｑｕ ｓ／ ｉ ｏ． ｓ ｅ ｂ ａ ｔ ｒ Ｗ ｔ ｔ ｅｄ ｖ ｌｐ ｈ ｎ ｌｃ ｌ ｅｔ ｏｃ ｕ ｅｃ ｉ ｅ ｎ ｖｔ ｏ ｔ ｏ ｌ ｓ ｓ ｆ ｒ ０ｍ ｎ ｍａ ｏｎ ａｉ Ｉ ｂ ｅ． ｐ ｉ ｔ ｕ ． ｏｎ ｅｒ ｅ ｍ ｂ ｅ ｍａｒ ｗ ｎｄ ｎ ｎ ｂ ｎ ｉｓ ｅ ｈ ｖ ｅ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌ ｕｔ ｒ ｄ． ｕ ｉ ａ ｅ ｓ ｏ ｈ ｔ ｈ ｓ ｔ ｏ ｌ ｓ ｓ ｈ ｖ ｏｓ ｒ ａ ｏ ． ｏ ｅ ｌ ｕ ａ ｅ ｂｅ ｎ ｓ ｃ ｅ ｓ ｕｌ ｃ ｌ ｅ Ｓｔ ｄｅｓ ｈ ｖ ｈ ｗｎ ｔ ａ ｅ ｅ ｏｓ ｅ ｂ ａ ｔ ａ ｅ ｏ ｓ ｙ ｕ ｔ ｔ ｐ ｃ ｌ ｈ ａ ｔ ｉｔ ｓ ａ ｄ ｇ ｏｄ ｂ ｏ ｏ ｉａ ｒ ｐ ｔ ｅ ． ｒｅｎ ｌ， ｈ ｕｔ ｒ ｄ ｏｓ ｅ ｌ ｔ ｅ ｃ ｍ ｍｏ ｘ ｅ ｉ ｎ ａ ｄｅ ｔ ｙ ｉ ａ ａｒ ｃ ｅｒ ｉ ｎ ｏ ｉ ｌ ｇ ｃ ｌ ｏ ｅｒ ｓ Ｃｕ ｒ ｔ ｔ ｅ ｃ ｌ ｅ ｔ ｏｂａｓｓ ａｒ ｏ ｃ ｓｃ ｐ ｉ ｙ ｕ ｎ ｅ ｐ ｒｍｅ ｔ ｌ ｍｏ ｌｎ ｖ ｒ ｉｉ ｏ
体外诱导MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化模型的建立
体外诱导MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化模型的建立1.包头医学院第一附属医院神经外科内蒙古包头 014030；2.包头医学院内蒙古包头 014030【摘要】目的观察MC3T3-E1细胞在体外诱导条件下成骨分化的特征及碱性磷酸酶（ALP）的表达情况。
方法将MC3T3-E1细胞于六孔板中培养，将含诱导剂（β-GP和抗坏血酸）的MEM-α培养基作为实验组，不含诱导剂的MEM-α培养基作为对照组，两组于第14天、21天是分别行茜素红染色，光学显微镜下观察细胞矿化情况；每隔两天换液一次并收集上清液进行碱性磷酸酶（AIP）活性检测。
结果培养第14天时两组均无矿化结节形成，第21天时实验组细胞出现明显矿化结节，对照组仍不明显；两组碱性磷酸酶（ALP）活性都于15天前呈上升趋势，其后呈下降趋势，实验组细胞活性明显高于对照组（p＜0.05）。
结论实验组细胞培养过程中矿化程度和碱性磷酸酶（ALP）活性都明显高于对照组细胞。
【中图分类号】R329.2【文献标识码】A【文章编号】2096-0867（2016）09-234-02骨组织的生理过程包括骨的形成和骨的吸收，其中成骨细胞参与骨细胞形成、分泌和矿化等一系列过程[1]。
MC3T3-E1细胞系来源于小鼠锁骨细胞，是作为体外研究成骨细胞模型的常用细胞[2]。
本实验通过利用含诱导剂（β-GP和抗坏血酸）的培养基和无诱导剂培养基分别培养 MC3T3-E1细胞，观察两组细胞在不同时间的矿化和细胞活性情况。
1材料和方法1.1材料和仪器MC3T3-E1细胞（协和医科大学，中国），MEM-α培养基（gibco，美国），胎牛血清（四季青，中国），青链霉素（gibco，美国）二氧化碳培养箱（Thermo，美国），β-甘油磷酸钠和抗坏血酸（华迈科，中国），茜素红染色液（leagene，中国），碱性磷酸酶试剂盒（碧云天，中国）。
1.2细胞培养将MC3T3-E1细胞接种于含MEM-α培养基（10%胎牛血清，1%青链霉素）的培养瓶内，放置于二氧化碳培养箱（37℃，5%CO2，潮湿）培养，每三天更换一次培养液，待细胞铺满瓶底的80%以上时，可用胰蛋白酶消化，进行传代、冻存或用于后续实验。
成骨前体细胞来源的骨髓细胞球在体外的生物矿化
成骨前体细胞来源的骨髓细胞球在体外的生物矿化发表时间：2011-05-16T16:34:29.543Z 来源：《中外健康文摘》2011年第4期供稿作者：刘威1 潘锋2[导读] 二月龄新西兰大耳白兔12只，雌雄不限，体重1.5kg左右，由中国医科大学实验动物中心提供。
刘威1 潘锋2（1辽宁本溪市卫生学校解剖教研室 117022）（2中国医科大学解剖教研室 110001）【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2011)04-0172-03【摘要】目的研究兔骨髓中的成骨前体细胞凝集单位——成骨性骨髓细胞球在体外的矿化过程。
方法新西兰大耳白兔股骨中获得骨髓，骨钙素抗体分离出成骨前体细胞，扩增传代后加入含有谷氨酰胺和转化生长因子-β1的无血清培养基，生成大量的成骨性骨髓细胞球，组织化学方法、扫描、透射电镜观察结果，能量色散谱电子探针（EDS）分析元素。
结果成骨性骨髓细胞球碱性磷酸酶（ALP）及茜素红染色均呈强阳性反应；扫描电镜见细胞球状体中的前体细胞呈三维球状生长，多突起，细胞之间空隙较大，且周围有基质成分分泌，骨髓细胞球周围的贴壁细胞均完全铺展，明显可见其内部的微管结构；透射电镜见细胞中基质小泡丰富；电子探针见钙磷元素在成骨性骨髓细胞球内部高度浓集。
结论成骨前体细胞依赖高密度细胞的三维立体方式生长才能发挥功能，使得成骨性骨髓细胞球在体外快速发生矿化。
【关键词】成骨前体细胞骨髓细胞球 L-谷氨酰胺转化生长因子-β1在骨髓腔中稳态条件下，大部分成骨前体细胞都是以一种凝集态的方式存在，这就是成骨性骨髓细胞球[1]，此种凝集态的变化是以作为细胞微环境的细胞外基质的降解改变为前提，即发生单个成骨前体细胞的释放并在适当条件下进一步增殖成球，从而形成损伤条件下的成骨前体干细胞的级联放大效应以在最短时间内建立众多的成骨性骨髓细胞球并在一些因子的影响下形成类骨质。
本研究筛选了成骨前体细胞增殖成球的因素并在体外观察这种成骨性骨髓细胞球在无诱导条件下的成骨作用。
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浅谈体外培养成骨细胞张杰（陕西理工学院生物科学与工程学院生物科学081班陕西汉中 723000）【摘要】成骨细胞是骨形成和骨代谢的核心部分，随着体外细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，成骨细胞体外培养是研究骨代谢和成骨机制的重要手段。
现就成骨细胞的来源、分化调控因子、复合移植及中医药方面和影响因素的研究进展作一综述。
【关键词】成骨细胞；细胞培养技术；移植；中药；影响因素；成骨细胞是骨形成细胞，对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量平衡和损伤修复起关键作用。
随着细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，研究表明培养出的成骨细胞具有良好的生物学特性，在不同环境下可以形成骨组织，现就成骨细胞的研究进展作一综述。
1 成骨细胞的来源国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨为成骨细胞的常用来源。
有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学活性及发生钙化的功能。
有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖．代谢及钙化的能力发现，来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力，但碱性磷酸酶的生成较低，而且兔盖骨来源的成骨细胞在体外培养中可以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石(HA)结晶。
骨膜是骨骼膜性成骨的细胞来源，若将体外培养的骨膜细胞移植入体内，在理论上能形成骨组织，修复骨缺损，很多学者对此展开了研究并取得成功。
Turhani等【1】将骨膜细胞接种到HA支架上进行培养，观测到HA上细胞具有良好的活性，表达骨特定因子，如骨钙素和骨桥蛋白，三维HA 对骨膜间充质细胞的生长行为起着积极作用。
从研究中可知，骨膜源性细胞(PDC)具有很强的增殖能力和分化成骨潜能间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞，主要存在于骨髓，还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织，如脂肪干细胞、血管内皮细胞、胚胎干细胞等。
骨髓MSCs在体外适当的培养条件下，具有向成骨细胞方向分化潜能。
Gronthos等【2】把人骨MSCs分离体外扩增后与HA／磷酸三钙载体复合，再植入裸鼠背部皮下，发现载体周围有骨髓和新骨组织形成，而且通过原位杂交显示新骨组织中的骨细胞是人来源。
Cowan等【3】一和Wan等【4】研究发现小鼠脂肪来源基质细胞诱导分化的成骨细胞体内移植成功的修复了颅盖骨缺损。
近年来对脐血干细胞的研究越来越多。
并指出脐血MSCs具有多向分化潜能，Yang 等【5】一成功将脐血MSCs诱导分化为软骨细胞与成骨细胞。
此外Wan等渴。
报道外周血来源间充质细胞能够向成骨细胞分化，并参与骨损伤修复。
Henning等研究羊水来源间充质细胞向成骨细胞诱导分化，研究结果显示其增殖、分化能力比成人组织来源的MSCs更强，作为组织工程种子细胞也更为理想。
在不同来源成骨细胞的研究中，增殖能力以骨髓基质干细胞最好，钙化能力以骨膜成骨细胞和松质骨成骨细胞最好，而胶原合成，骨钙素表达以及碱性磷酸酶活性以骨膜成骨细胞最好。
组织工程化人工骨所需要的种子细胞应具备强的增殖能力和良好的成骨功能，可见3种来源细胞都不能达到骨组织工程的理想要求，解决组织工程种子细胞的途径是建立标准成骨细胞系，通过基因工程技术对成骨细胞进行改造，使其转变为既有较强增殖能力．又有较强成骨能力的标准细胞。
2 成骨细胞的分化调控因子的研究进展成骨细胞的分化是骨发生、骨形成的前提。
成骨干细胞经过一步或几步分化为前成骨细胞，再继续分化为有功能的成骨细胞。
成骨细胞在分化过程中受Ostefix、Cbfa 1、bFGF、CGRP、IGF-l等多种因子的调控。
Ostefix(OSX)OSX是由Nakashima等【6】发现的成骨细胞特异性转录因子，只在发育的骨组织中特异性表达，是成骨细胞分化和骨形成过程中所必需的转录因子。
有研究表明在OSX 基因剔除小鼠胚胎中，I型胶原RNA水平在间充质细胞密集的成骨部位，软骨膜及软骨中的表达均明显低于野生型小鼠，同时，作为成骨细胞分化的早期指标中的BSP在野生型小鼠骨组织内均高表达，而在OSX(-／-)小鼠体内则未检测到，另外两种成骨细胞标志性蛋白骨黏连蛋白和骨桥蛋白也低于野生型小鼠，由此町见OSX的缺失使成骨细胞的分化受到阻碍。
Cao 等【7】发现相对于正常的成骨细胞，小鼠和人类骨肉瘤细胞中的OSX的mRNA水平明显低下。
将OSX基因通过胫骨注射转染入小鼠骨肉瘤细胞可以阻止肿瘤细胞的生长并缩小肿瘤体积，减少肺转移。
还可以对抗肿瘤的溶骨作用。
这一发现为研究骨肉瘤的治疗方法提供了新的思路。
成骨细胞复合移植的研究进展随着分子生物学和生物材料学的发展，以组织工程技术方法培养出既具有成骨细胞的成骨活性，又具有一定的空间构型和生物支撑作用、成骨效果能与自体骨媲美的新型骨替代材料，植人体内修复大的骨缺损，近年来发展很快。
目前研究的复合载体根据支架材料的特性可分为几类：①无机盐类，a．钙磷陶瓷人工骨包括磷酸=三钙(TCP)和HA两种主要材料-b．煅石膏即干燥硫酸钙。
②多聚体类．包括乳酸(PLA)和聚乙二醇酸(PGA)。
(彭天然聚合物类，主要有纤维蛋白凝块(FC)或纤维蛋白牯合剂、胶原、不溶性非胶原蛋白等。
④经体外物理化学方法处理的异体或异种骨组织。
Kay等[1引合成了纳米结构的聚乳酸聚乙醇酸一钛复合物。
并与微米级或通常粗糙度的表面比较发现，成骨细胞在纳米复合物的黏附性增加。
Lee等“8J发现壳聚糖生物材料可控释放生长因子PDGF-BB增强骨形成．骨诱导性和骨传导力明显增高。
张春宝等“91将成骨细胞种植于Ti-75合金表面，细胞在24 h 贴壁率达到84．38％，细胞ALP活性和蛋白质合成量在培养第7天后出现明显增大趋势，表明T i-75合金具有良好骨组织生物相容性，适于作为骨内种植材料应用。
朱元等∞’在研究生物陶瓷对体外培养大鼠成骨细胞的影响时发现生物活性陶瓷在体外与大鼠成骨细胞的复合培养中，对成骨细胞的生长、增殖、生物活性等方面具有积极的影响。
目前成骨细胞的体外复合移植的研究主要集中在支架材料的改性、细胞种植方法的改进和引进应力应变作用模拟细胞在体内所处的微环境。
进一步的研究需解决在保持材料骨诱导、骨引导作用的同时提高其机械强度，促进新骨的形成和支架降解的平衡、良好的增殖能力和成骨能力达到平衡、人工骨的血管化等。
3 体外培养成骨细胞的影响因素3.1 物理因素3.1.1 电离辐射一般来说，电离辐射对细胞的增殖和分化产生抑制效应，甚至会起细胞死亡。
受辐射的成骨细胞呈梭形，较稀疏，胞体增大，胞浆呈匀质，折光性差，胞核肿胀、并随照射剂量增加而加重。
Dare【7】等观察到，单次低剂量辐射（40 cGy 以下）对大鼠成骨细胞样细胞不会引起明显的改变，100 cGy 也只是导致有限的细胞死亡，而从400 cGy 开始，细胞的生存率明显呈指数地下降，这符合Chadwick 提出的放射的线性二次方程模型（LQ 模型）；而单次高剂量辐射（400 cGy）却使克隆成骨细胞系MC3T3-E1 的ALP 活性增加。
这又表明，对于不同的成骨细胞系，高剂量辐射的效应是不同的。
3.1.2 微重力目前认为，失重条件下骨形成受到抑制是造成骨质脱钙的主要原因，特别是成骨细胞数目的减少和活性的降低。
张晓铀等[8]利用回转器模拟失重，观察到成骨细胞增殖受到明显抑制，G1 期细胞显著增多，S 与G2+M 期细胞显著减少。
模拟失重12 h 后再经12 h 以上正常生长，细胞周期有一定的恢复作用。
3.1.3 外力Hasegawa 等【9】将鼠成骨细胞培养在可变形塑料膜上，使膜均匀变形，发现机械拉伸能刺激成骨细胞增加DNA 合成，并且能改变蛋白合成的类型，但胶原蛋白的合成量不变，非胶原蛋白的合成增加。
Buckley 等【10】发现鸡成骨细胞在周期性载荷作用下DNA 合成速度和细胞分裂速度加快。
Brighton 等【11】选用单层多聚氨基甲酸乙酯膜为培养皿基底材料，气体动力加载牵张基底膜，观察了应力应变场对成骨细胞的分化和代谢的影响，发现适当的拉应变（400）刺激，可使培养的细胞中DNA 含量明显增加，还可导致成骨细胞的增殖变快。
3.2 微量元素微量元素在骨的形成和生长分化过程中起着重要作用，微量元素缺乏可能使骨骼发育受到障碍，甚至可能发生畸形，成骨细胞增殖分化的过程与某些微量元素有着密切的关系。
3.2.1 锌锌是人体所必需的微量元素，它参与了机体新陈代谢的各个方面。
近年来的研究证实锌与骨代谢及机能的关系非常密切【12】，锌缺乏会影响骨骼的生长发育，促进骨质疏松的发生与发展【13.14】。
体外实验表明，锌能够促进大鼠成骨细胞的增殖及分化【15】，促进MC3T3-E1 成骨细胞蛋白质及DNA 的合成【16】。
而锌缺乏则抑制大鼠成骨细胞的增殖分化【17】；锌浓度过高会对细胞产生毒性【18】。
3.2.2 铝目前认为一些疾病如骨质疏松、骨软化等与铝中毒有关。
铝蓄积于骨骼，对骨骼和神经系统等产生危害。
文献报道低浓度铝可刺激体外培养的成骨细胞的增殖和分化，铝对成骨细胞的作用不受培养液中生长因子变化的影响【19】。
高剂量铝可抑制成骨细胞的生长发育并对其产生一定的毒性作用【20】。
3.2.3 氟氟是人体必需的微量元素，但其生理安全范围较窄。
一方面氟作为骨基质构成物参与骨形成过程，另一方面，过量的氟摄入可导致齿、骨等组织及器官的损害。
体外研究则表明，氟通过对成骨细胞的有丝分裂的作用促使成骨细胞的生长速度加快、数量增多、功能增强【21】。
氟对成骨细胞的作用与铝有所不同，需依赖于培养液中部分生长因子，除去这些生长因子，可消除氟对成骨细胞的作用【22】。
有文献报道，NaF 对大鼠颅骨成骨细胞增殖分化呈双向调节，小剂量促进、大剂量抑制【23】。
3.2.4 其它微量元素铜对骨骼的形成和维持很重要。
缺铜骨质中胶原纤维合成受损，骨骼发育受限，结构疏松，长骨易碎，骨发育停止。
在体外成骨细胞样培养液中，补充铜，其醛胺缩合反应受铜赖氨酰氧化酶活性影响，能促进胶原纤维的交联反应，有利于胶原合成。
锰对粘多糖、溶胶原的合成和骨形成有特殊作用。
如对粘多糖分子的联接酶具有激活作用，故补充锰对粘多糖的合成有利，而粘多糖是软骨和骨组织的重要成分。
钙是骨骼的主要构成，其主要功能是与磷协调建立骨骼和牙。
缺钙使骨骼形成不佳，失调引起骨质疏松等镁也是必不可少的微量元素之一，不论钙补充多少，没有镁的参加，则生成软的珐琅质与骨质疏松、佝偻病等。
刘秀明等【24】研究发现，锌、铜、锰、镁、钙等对体外培养SD大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞的增殖分化都具有一个最佳峰值，但其作用是很复杂的。