浅谈体外培养成骨细胞

浅谈体外培养成骨细胞

张杰

（陕西理工学院生物科学与工程学院生物科学081班陕西汉中 723000）

【摘要】成骨细胞是骨形成和骨代谢的核心部分，随着体外细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，成骨细胞体外培养是研究骨代谢和成骨机制的重要手段。现就成骨细胞的来源、分化调控因子、复合移植及中医药方面和影响因素的研究进展作一综述。

【关键词】成骨细胞；细胞培养技术；移植；中药；影响因素；

成骨细胞是骨形成细胞，对骨组织的生长发育、骨代谢平衡、骨量平衡和损伤修复起关键作用。随着细胞培养技术的发展，人们已经从许多动物的颅骨、骨髓基质、骨膜及骨外组织中成功培养出了具有典型成骨细胞特性的细胞，研究表明培养出的成骨细胞具有良好的生物学特性，在不同环境下可以形成骨组织，现就成骨细胞的研究进展作一综述。

1 成骨细胞的来源

国内外文献报道新生动物的颅骨或胚胎颅骨为成骨细胞的常用来源。有不少学者尝试用新生大鼠的颅骨分离成骨细胞，结果表明所培养的成骨细胞具有典型的成骨细胞的形态特征、生物学活性及发生钙化的功能。有学者研究兔盖骨的成骨细胞增殖．代谢及钙化的能力发现，来自兔盖骨的成骨细胞具有较高的增殖能力，但碱性磷酸酶的生成较低，而且兔盖骨来源的成骨细胞在体外培养中可以形成有序的钙化结节和羟基磷灰石(HA)结晶。骨膜是骨骼膜性成骨的细胞来源，若将体外培养的骨膜细胞移植入体内，在理论上能形成骨组织，修复骨缺损，很多学者对此展开了研究并取得成功。Turhani等【1】将骨膜细胞接种到HA支架上进行培养，观测到HA上细胞具有良好的活性，表达骨特定因子，如骨钙素和骨桥蛋白，三维HA 对骨膜间充质细胞的生长行为起着积极作用。从研究中可知，骨膜源性细胞(PDC)具有很强的增殖能力和分化成骨潜能间充质干细胞(MSCs)是一种多潜能成体干细胞，主要存在于骨髓，还存在于胚胎时期间充质来源的骨外组织，如脂肪干细胞、血管内皮细胞、胚胎干细胞等。骨髓MSCs在体外适当的培养条件下，具有向成骨细胞方向分化潜能。Gronthos等【2】把人骨MSCs分离体外扩增后与HA／磷酸三钙载体复合，再植入裸鼠背部皮下，发现载体周围有骨髓和新骨组织形成，而且通过原位杂交显示新骨组织中的骨细胞是人来源。Cowan等【3】一和Wan等【4】研究发现小鼠脂肪来源基质细胞诱导分化的成骨细胞体内移植成功的修复了颅盖骨缺损。近年来对脐血干细胞的研究越来越多。并指出脐血MSCs具有多向分化潜能，Yang 等【5】一成功将脐血MSCs诱导分化为软骨细胞与成骨细胞。此外Wan等渴。报道外周血来源间充质细胞能够向成骨细胞分化，并参与骨损伤修复。Henning等研究羊水来源间充质细胞向成骨细胞诱导分化，研究结果显示其增殖、分化能力比成人组织来源的MSCs更强，作为组织工程种子细胞也更为理想。在不同来源成骨细胞的研究中，增殖能力以骨髓基质干细胞最好，钙化能力以骨膜成骨细胞和松质骨成骨细胞最好，而胶原合成，骨钙素表达以及碱性磷酸酶活性以骨膜成骨细胞最好。组织工程化人工骨所需要的种子细胞应具备强的增殖能力和良好的成骨功能，可见3种来源细胞都不能达到骨组织工程的理想要求，解决组织工程种子细胞的途径是建立标准成骨细胞系，通过基因工程技术对成骨细胞进行改造，使其转变为既有较强增殖能力．又有较强成骨能力的标准细胞。

2 成骨细胞的分化调控因子的研究进展

成骨细胞的分化是骨发生、骨形成的前提。成骨干细胞经过一步或几步分化为前成骨细胞，再继续分化为有功能的成骨细胞。成骨细胞在分化过程中受Ostefix、Cbfa 1、bFGF、CGRP、IGF-l等多种因子的调控。

Ostefix(OSX)OSX是由Nakashima等【6】发现的成骨细胞特异性转录因子，只在发育的骨组织中特异性表达，是成骨细胞分化和骨形成过程中所必需的转录因子。有研究表明在OSX 基因剔除小鼠胚胎中，I型胶原RNA水平在间充质细胞密集的成骨部位，软骨膜及软骨中的表达均明显低于野生型小鼠，同时，作为成骨细胞分化的早期指标中的BSP在野生型小鼠骨组织内均高表达，而在OSX(-／-)小鼠体内则未检测到，另外两种成骨细胞标志性蛋白骨黏连蛋白和骨桥蛋白也低于野生型小鼠，由此町见OSX的缺失使成骨细胞的分化受到阻碍。Cao 等【7】发现相对于正常的成骨细胞，小鼠和人类骨肉瘤细胞中的OSX的mRNA水平明显低下。将OSX基因通过胫骨注射转染入小鼠骨肉瘤细胞可以阻止肿瘤细胞的生长并缩小肿瘤体积，减少肺转移。还可以对抗肿瘤的溶骨作用。这一发现为研究骨肉瘤的治疗方法提供了新的思路。成骨细胞复合移植的研究进展随着分子生物学和生物材料学的发展，以组织工程技术方法培养出既具有成骨细胞的成骨活性，又具有一定的空间构型和生物支撑作用、成骨效果能与自体骨媲美的新型骨替代材料，植人体内修复大的骨缺损，近年来发展很快。目前研究的复合载体根据支架材料的特性可分为几类：①无机盐类，a．钙磷陶瓷人工骨包括磷酸=三钙(TCP)和HA两种主要材料-b．煅石膏即干燥硫酸钙。②多聚体类．包括乳酸(PLA)和聚乙二醇酸(PGA)。(彭天然聚合物类，主要有纤维蛋白凝块(FC)或纤维蛋白牯合剂、胶原、不溶性非胶原蛋白等。④经体外物理化学方法处理的异体或异种骨组织。Kay等[1引合成了纳米结构的聚乳酸聚乙醇酸一钛复合物。并与微米级或通常粗糙度的表面比较发现，成骨细胞在纳米复合物的黏附性增加。Lee等“8J发现壳聚糖生物材料可控释放生长因子PDGF-BB增强骨形成．骨诱导性和骨传导力明显增高。张春宝等“91将成骨细胞种植于Ti-75合金表面，细胞在24 h 贴壁率达到84．38％，细胞ALP活性和蛋白质合成量在培养第7天后出现明显增大趋势，表明T i-75合金具有良好骨组织生物相容性，适于作为骨内种植材料应用。朱元等∞’在研究生物陶瓷对体外培养大鼠成骨细胞的影响时发现生物活性陶瓷在体外与大鼠成骨细胞的复合培养中，对成骨细胞的生长、增殖、生物活性等方面具有积极的影响。目前成骨细胞的体外复合移植的研究主要集中在支架材料的改性、细胞种植方法的改进和引进应力应变作用模拟细胞在体内所处的微环境。进一步的研究需解决在保持材料骨诱导、骨引导作用的同时提高其机械强度，促进新骨的形成和支架降解的平衡、良好的增殖能力和成骨能力达到平衡、人工骨的血管化等。

3 体外培养成骨细胞的影响因素

3.1 物理因素

3.1.1 电离辐射

一般来说，电离辐射对细胞的增殖和分化产生抑制效应，甚至会起细胞死亡。受辐射的成骨细胞呈梭形，较稀疏，胞体增大，胞浆呈匀质，折光性差，胞核肿胀、并随照射剂量增加而加重。Dare【7】等观察到，单次低剂量辐射（40 cGy 以下）对大鼠成骨细胞样细胞不会引起明显的改变，100 cGy 也只是导致有限的细胞死亡，而从400 cGy 开始，细胞的生存率明显呈指数地下降，这符合Chadwick 提出的放射的线性二次方程模型（LQ 模型）；而单次高剂量辐射（400 cGy）却使克隆成骨细胞系MC3T3-E1 的ALP 活性增加。这又表明，对于不同的成骨细胞系，高剂量辐射的效应是不同的。

3.1.2 微重力

目前认为，失重条件下骨形成受到抑制是造成骨质脱钙的主要原因，特别是成骨细胞数