血凝与血凝抑制试验标准方法
实验四血凝和血凝抑制试验
3. 0.85%生理盐水. 4. 被检血清,采自被检鸡的血清.
四、操作步骤 〔一血凝试验〔HA
1. 在血凝板第一排的1~12孔加入50μl生理盐水. 2. 在第1孔中加入50μl病毒抗原,反复吸取混匀后
〔Hemagglutination and Hemagglutination
Inhibition, HA and HI
动物病原学实验之六
一、实验目的
掌握血凝和血凝抑制试验的原理,以及使 用该试验测定血清抗体水平的操作步骤和结 果判定方法.
二、实验原理
〔一血凝试验〔HA
➢ 有些病毒能够促使某些动物〔如鸡、鹅、豚鼠、 绵羊和人的红细胞发生凝集,这就是红细胞凝集 现象,称做血凝试验.
以50%的红细胞发生凝集的病毒悬液的最高稀释度 作为血凝价的终点,即一个血凝单位.
〔二血凝抑制试验〔HI
1. 在血凝板的1~12孔加入50μl生理盐水,最后一孔加 100μl.
2. 第1孔加入待检血清50μl,混匀后吸50μl至第2孔,倍比 稀释直至第10孔,混匀后弃50μl.
3. 从1~11孔,每孔加稀释好的50μl 4个血凝单位的病毒悬 液.
放映结束 感谢各位的批评指导！
谢 谢！
让我们共同进步
➢ 象各种脑炎病毒、口蹄疫病毒等,凝集红 细胞的条件很严格,对红细胞的种类有很 严格的选择,同时还要掌握反应的pH和温 度等.
〔二血凝抑制试验〔HI
➢ 当病毒悬液中加入特异性抗体时,这种红 细胞凝集的现象就被抑制,称做红细胞凝 集抑制试验,也叫血凝抑制试验.
HI试验的原理图
血凝及血凝抑制实验
实验原理基于病毒与抗体结合 后，改变了红细胞的抗原性，
从而影响血凝过程
实验结果可用于病毒的分离、 鉴定和抗体效价测定等
实验材料
血凝抑制抗体 病毒抗原 受检血清 红细胞
实验步骤
准备试剂和器材：包括血凝试剂、抗体、离心机、试管等。 采集样本：采集待检测动物的血液样本。 抗体处理：将抗体与待检测样本混合，孵育一定时间。 离心分离：将混合液离心，分离出凝集块。 结果观察：观察凝集块的数量和大小，判断实验结果。
实验结果
添加 标题
实验原理：血凝抑制实验的原理是利用抗原抗体反应的特异性，通过加入抗体来抑制血凝反应的发生，从而 检测出血液中是否存在相应的抗体。
添加 标题
实验步骤：血凝抑制实验通常包括加样、加抗体、观察结果等步骤。在实验过程中，需要严格控制实验条件， 以保证实验结果的准确性和可靠性。
添加 标题
实验结果分析：根据实验结果，可以判断出被检测样本中是否存在相应的抗体。如果血凝反应被抑制，则说明被检测样本中 存在相应的抗体；如果没有出现血凝反应或者血凝反应没有被抑制，则说明被检测样本中不存在相应的抗体。
诊断试剂开发：利用 血凝及血凝抑制实验 检测血液中的病毒抗 体，辅助临床诊断
在食品科学领域的应用
食品安全：评估食品中细菌、 病毒等微生物的污染程度
食品加工：检测食品中病原 微生物的含量
食品质量控制：监测生产过程 中的卫生状况，确保产品质量
食品科学研究：为食品科学 领域的研究提供数据支持
在其他领域的应用
评估风险：对于需要进行手术或特殊治疗的患者，血凝及血凝抑制实验可以评估其出 血风险
科学研究：在医学研究中，血凝及血凝抑制实验可用于研究凝血机制、药物作用等方 面
血凝和血凝抑制实验
3、每孔加入1％鸡红细胞悬液25ul
4、轻轻振荡均匀，后放于室温或37℃中静置30分 钟
5、结果判定
医学课件ppt
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血凝效价测定
医学课件ppt
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结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
以出现＋＋（50％凝集）的抗原最高稀释 倍数为该抗原的血凝价（1:128）？？？ 。
25ul 1:256稀释的病毒抗原为该抗原的一 个血凝单位。
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血凝抑制试验
1、将病毒抗原稀释成4个血凝单位（1/128×4=1:32）
2、在血凝板上1－12孔内各加入25ul生理盐水；
3、在第1孔内加入被检血清25ul，然后倍比稀释至第 10孔，最后弃25ul；
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注意事项
• 1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢， 以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡 红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄 色，之后直至清亮为清洗干净）。
• • 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸
取干净。
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1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100 ％凝集；
2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而 稍向孔底集中，即75％凝集；
3、 ＋＋：红细胞形成一个环状，四周有下凝集块， 即50％凝集；
4、 ＋：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四 周稍有凝集块，即25％凝集；
5、－：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即 无凝集。
医学课件ppt
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血凝HA和血凝抑制试验HI
HA值可用于评估血液凝固功能和血栓形成风险
试验方法
添加标题
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试验材料：抗凝剂、试管、离心机、凝血因子活性检测试剂等。
试验原理：通过观察血液凝固过程，检测血浆中凝血因子的活性。
试验步骤：采集血液样本，加入抗凝剂，离心分离血浆，加入凝血因子活性检测试剂，观察血液凝固时间并记录结果。
不同点：血凝HA试验只能判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，而血凝抑制试验HI不仅可以判断是否存在凝血功能障碍或血栓前状态，还可以检测抗凝物质的具体类型和浓度。
试验方法的比较
血凝HA试验：通过观察血凝块的形成和溶解过程，检测抗凝物质的存在和含量
操作简便性：血凝HA试验操作相对简单，而血凝抑制试验HI需要更多的样本和操作步骤
参考值：血凝HA试验结果的参考值一般为阴性或阳性，具体参考值因不同病毒而异。
临床意义
用于诊断血栓栓塞性疾病
评估血液高凝状态的风险
辅助诊断易栓症等血栓前状态
监测抗凝治疗的效果
02
血凝抑制试验HI
试验原理
血凝抑制试验HI是一种检测病毒抗体的方法，通过与特异性抗体结合，抑制病毒的凝集活性，从而检测出病毒抗体。
临床意义
用于诊断疾病：血凝抑制试验HI可以用于诊断多种疾病，如流感、麻疹等病毒感染性疾病，以及疟疾、血友病等出血性疾病。
监测治疗效果：通过血凝抑制试验HI，可以监测治疗效果，评估病情进展和预后。
指导治疗：血凝抑制试验HI的结果可以指导治疗，例如在输血时，通过血凝抑制试验HI可以确定最佳的输血量。
流行病学调查：血凝抑制试验HI还可以用于流行病学调查，了解疾病的流行趋势和分布情况。
试验意义：用于检测凝血因子活性，评估血液凝固功能，协助诊断凝血障碍相关疾病。
实验四血凝和血凝抑制试验课件
02
实验材料
实验器材
01
02
试管
用于血样的采集、分离和反应 。
吸管
用于吸取试剂和血样。
03
离心机
用于血样的分离。
04
显微镜
用于观察血凝现象。
实验试剂
生理盐水
用于稀释血样和作为反应介质 。
抗血清
用于血凝抑制试验，针对特定 病毒或细菌。
凝血酶
促使血液凝固的酶。
抗凝剂
如肝素，防止血液凝固。
实验样本
出了抗体滴度与病毒滴度之间的关系。这一发现有助于评估抗体治疗效
果和制定抗病毒治疗方案。
05
注意事项与安全须知
实验安全须知
01
实验操作应在专业人员 的指导下进行，确保安 全。
02
实验过程中应穿戴实验 服和防护眼镜，避免意 外伤害。
03
实验器材应保持清洁， 避免交叉污染。
04
实验废弃物应按照规定 进行处理，避免对环境 和人体造成危害。
血凝抑制试验
利用抗体与相应抗原结合后，抑 制红细胞发生凝集的现象。
实验步骤
准备试剂和器材：包括抗 原、抗体、红细胞、生理 盐水等。
制备不同浓度的抗原溶液。
取适量红细胞，加入不同 浓度的抗原溶液中，观察 红细胞是否发生凝集。
记录实验结果，分析数据， 得出结论。
对于血凝抑制试验，先加 入抗体，再加入抗原溶液， 观察红细胞是否发生凝集。
实验结果
实验结果一
实验结果三
血凝试验中，不同稀释度的病毒液与 红细胞混合后，红细胞迅速凝结成块， 形成明显的血凝现象。
通过比较不同稀释度的病毒液与加入 特异性抗体后的血凝抑制情况，可以 得出抗体滴度与病毒滴度之间的关系。
血凝及血凝抑制实验
1、在稀释移取混匀的操作过程中动作要慢，以免损坏红细胞（表现为分离是上清液为淡红色，正常情况第一次分离后上清液为淡黄色，之后直至清亮为清洗干净）。 2、在吸取过程中一定要将中间的白细胞层吸取干净。
血凝(HA)与血凝抑制(HI)试验
一、实验目的 二、实验内容 三、实验原理 四、实验材料 五、实验方法与结果判定 六、注意事项 七、红细胞制备
一、实验目的
1、掌握血凝和血凝抑制试验的基本原理、操 作方法和结果判定方法 2、了解新城疫有关背景知识
二、实验内容
1、血凝试验(HA)检测新城疫抗原的效价 2、血凝抑制试验(HI)检测新城疫抗体（疫苗注射后的抗体检测）
三、实验原理
1、血凝试验（HA）原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应。
病毒颗粒
红细胞
2、血凝抑制试验（HI）原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
结果判定标准
1、＋＋＋＋：红细胞呈细沙样均匀铺于孔底，即100％凝集； 2、＋＋＋：红细胞均匀铺于孔底，当边缘不整齐而稍向孔底集中，即75％凝集； 3、 ＋＋ ：红细胞形成一个环状，四周有凝集块，即50％凝集； 4、 ＋ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘不够光滑，四周稍有凝集块，即25％凝集； 5、－ ：红细胞于孔底形成圆团，边缘光滑整齐，即无凝集；
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1---血凝和血凝抑制实验
做好个人防护
注意事项
7、环境温度一定要重视，一般要求在室温下20-25°进行， 如果低于15°反应结果就出现的慢；如果高于30°结果会出现的 快；如果低于4°会发生红细胞自凝现在。因此，观察时间可以 适当根据反应情况缩短，所以实验室要装有空调和温度计。
8、微量反应版如果是有机玻璃的一定要清洗干净，孔底 要透亮，无磨损毛糙无划痕和有残留物。不干净的反应板在试验 中会出现自凝现象。使用正规厂家生产的一次性微量板就可杜绝 这种情况。
检测质量控制措施
标准、 规范
注 意
优质的试剂
充分准备！！！
校准的仪器
正确的操作
注意事项
1、四个单位抗原，红细胞悬液使用过程中要轻轻摇匀；
2、移液器的吸头在反复洗吹时要插入液面以下但不可过深， 避免使用中速度过快产生过多气泡造成移液量减少，每孔混匀完毕 要将吸头内液体排尽。
注意事项
3、移液器使用时要用力均匀不可过力，吸头要安装牢固，防止 使用过程中漏气或者掉落。吸头尽量使用一次性的，若反复使用要清 洗干净，最好用超声波清洗机清洗，高压灭菌后使用，如果发现吸头 堵住不能吸到液体或者弯曲及时淘汰。 4、移液器在滴加液体，特别是在加抗原和红细胞悬液时一定不要 深入液面中造成交叉污染，影响浓度造成结果较大误差，可以尝试悬 空垂直加样。
1、HA原理：某些病毒或病毒的血凝素能选择性地 使某种动物地红细胞发生凝集，这种凝集红细胞的 现象称为血凝（HA）,也称直接血凝反应（红细胞 不流淌）。
病 毒 颗 粒
红 细 胞
2、HI原理：当病毒的悬液中加入特异性抗体，且这 种抗体的量足以抑制病毒颗粒或其血凝素时，则红细 胞表面的受体就不能与病毒颗粒或血凝素直接接触。 这时红细胞的凝集现象就被抑制，称为红细胞凝集抑 制（HI）反应，也称血凝抑制反应。
血凝HA和血凝抑制试验课件
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3. 热灭活法
3.1鸡血清
取100µL血清样品放入一灭菌离心管中；
各取100µL阳性血清和阴性血清加入到另2个灭 菌离心管中；
56℃水浴30min。
3.2 其它禽类血清
血清用鸡的红细胞处理后，分别取100µL样品、 阳性血清、阴性血清放入灭菌离心管中，56℃水 浴30min。
4000转离心1min；
取出上清，进行HI试验；
用阳性对照血清和阴性对照血清验证处理的彻底性
用于消除除鸡以外的其它禽类的血清非特异性反应。
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2.RDE（受体裂解酶）消除法 2.1试剂： RDE：用20mL无菌PBS稀释，小量分装，-20℃保存一周，注
意避免反复冻融； PBS： pH7.5，4℃保存； 阳性对照血清； 阴性对照血清。 2.2方法： 2.2.1鸡血清 加3倍体积的RDE到1倍体积的血清中； 充分混合； 56℃水浴30-60min; 加入6倍体积于血清体积的PBS。 2.2.2其它禽类血清 依据用RDE处理鸡血清方法处理后，继续按下列方法进行：用
三、实验步骤 （以禽流感为例, 参照禽流感防治 技术规范）
1 阿氏（Alsevers）液配制 称量葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化
钠0.42g, 加蒸馏水至100mL, 散热溶解后调pH值至6.1, 69kPa 15min高压灭菌, 4℃保存备用。
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•2 1%鸡红细胞液的制备
Hale Waihona Puke 全不凝集能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高
稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位
血凝、血凝抑制试验
⾎凝、⾎凝抑制试验红细胞凝集试验（HA）与红细胞凝集抑制试验（HI）⼀、实验⽤设备：1、离⼼机 1台*（3000转离⼼红细胞）2、冰箱 1台*（存放抗原）3、振荡器 1台*（振荡96孔V型板）4、抗原新城疫（ND）、减蛋（EDS）、流感（AI）抗原，从正规⼚家进。
5、96孔V型板稀释⾎清清洗后可重复使⽤6、⼋道移液器 1把（5-50微升稀释⾎清）7、吸头和⼋道移液器配套使⽤，清洗后重复使⽤）8、积液槽配制4个单位抗原及盛放⽣理盐⽔加样⽤9、⼀次性采⾎管采⾎⽤10、2毫升注射器采⾎⽤11、红细胞⾮免疫鸡⼼脏采⾎或免疫鸡也可，但需离⼼5次后使⽤。
12、柠檬酸三钠配制3.8％抗凝剂⽤13、重铬酸钾配制清洁液⽤14、硫酸配制清洁液⽤15、吸管 1毫升、10毫升16、吸⽿球和吸管配套使⽤17、针头 9*13（采雏鸡）、9*25（采⼤鸡）18、蒸馏⽔当地买。
清洗96孔V型板、吸头⽤19、10毫升离⼼管离⼼红细胞⽤（塑料制）20、⽣理盐⽔做⾎清稀释液⽤、配制4单位抗原⼆、实验前的准备：1.抗原：从指定⼚家购买稳定浓缩抗原。
2.抗凝剂的配制：⽤天平称量3.8克柠檬酸三钠，溶⼊100ml⽣理盐⽔中，待溶解完全后即可使⽤。
3.1％红细胞悬液：由鸡⼼脏或翅静脉采⾎，放⼊加有抗凝剂的离⼼管内（按抗凝剂：全⾎＝1：2的⽐例），迅速混匀。
在离⼼机中以3000转/分离⼼5分钟，⽤吸管吸去上清液和红细胞上层的⽩细胞薄膜，将沉淀的红细胞加⽣理盐⽔，慢慢混合均匀，再在离⼼机中3000转/分离⼼5分钟，弃去上清液，再加⽣理盐⽔混匀，如此反复离⼼4～5次，最后⼀次离⼼后的红细胞，弃去上清液，即为红细胞泥。
放⼊4℃冰箱中可保存2—3天。
使⽤时⽤1ml 吸管吸取0.1ml红细胞泥，然后加⼊9.9ml的⽣理盐⽔，此即1%红细胞悬液。
现⽤现配。
4.被检⾎清：每只鸡⼼脏或翼下采⾎0.5-1ml,静置或离⼼，待⾎清析出后备⽤。
5.吸管清洁液的配制：使⽤1%的稀硫酸溶液。
血凝与血凝抑制试验标准方法
血凝抑制（HI）试验操作规程1.仪器、设备和试剂的准备1.1仪器及设备V型96孔血凝板、微量振荡器、低速台式离心机、含25μL的单道加样器、含25μL的八道加样器、小圆底试管、吸管。
1.2抗原和试剂：1.2.1相应HI抗原1.2.2相应阳性血清1.2.3生理盐水、阿氏液（血球保护液）1.2.41%鸡红细胞悬液1.2.4.1红细胞的采集从2-6月龄SPF公鸡翅静脉采集血液与等量的阿氏液混合（采集后上下颠倒使血液和阿氏液混匀，防止凝血）1.2.4.2红细胞的洗涤将于阿氏液混合的血液，分装于圆底试管中，以1000rpm离心5分钟，吸弃阿氏液；加入适量生理盐水轻轻吸打将红细胞充分混合，以1500rpm离心5-10分钟，吸弃上清液时，应注意吸弃红细胞表面的白细胞层，并应尽量吸净上清液。
按上述步骤，用生理盐水对红细胞进行洗涤三次，最后一次洗涤应1500rpm离心10分钟（确保红细胞的压积）。
1.2.4.3吸弃上清液，将沉淀的红细胞吸取1ml，加入99ml生理盐水摇匀配制成1%的红细胞悬液。
（按照需要量配制）1.2.4.41%红细胞悬液的标定对首次配制的红细胞悬液应进行标定，取配制好的红细胞悬液60ml，自然沉降后，弃掉上部生理盐水50ml，混匀后装入刻度离心管中，1000rpm离心5分钟，红细胞压积应为0.6ml2．HI抗原工作液配制2.1HI抗原血凝价测定血凝试验：1．取一块V型96孔板，按表1每孔加入生理盐水25ul，将HI抗原进行系列倍比稀释，至11孔后吸取25ul弃去，第12孔为对照，稀释后每孔再加入25ul生理盐水，最后每孔加入1%鸡红细胞悬液25ul，微量振荡器中速摇匀，置于室温（20—25℃），20~30分钟后判定结果，以能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。
表1病毒血凝试验孔号：123456789101112滴度：1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水252525252525252525252525抗原(病毒)2525252525252525252525弃去生理盐水252525252525252525252525红细胞悬液252525252525252525252525轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果图1如图1所示为禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的血凝价测定，第9孔为能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数，因此该禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原血凝价为1:5122.2HI抗原工作液配制及检验2.2.14HA100单位的抗原配制4个100%血凝单位（即4HA100）抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数/4图1所示禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的4HA100单位的抗原=512/4=1282.2.24HA100单位抗原的检验4HA100单位抗原的检验按表2进行。
血凝实验和血凝抑制实验报告
血凝实验和血凝抑制实验报告一、引言血液凝固是维持人体生命活动的重要生理过程之一。
当人体受到损伤时，血液会迅速凝固形成血块，以阻止出血。
然而，血液凝固过程的异常可能导致血栓形成，进而引发心脑血管疾病。
因此，准确评估血液凝固功能对于疾病预防和治疗至关重要。
二、血凝实验血凝实验是一种常用的临床实验方法，用于评估血液的凝固功能。
该实验主要通过测量血液在一定时间内凝固的程度来获得结果。
常见的血凝实验包括凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、血小板计数和纤维蛋白原测定等。
1. 凝血酶原时间（PT）凝血酶原时间是评估外源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶原转化为凝血酶所需的时间来测定。
正常情况下，PT 的时间范围为11-13秒。
若PT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
2. 活化部分凝血活酶时间（APTT）活化部分凝血活酶时间是评估内源凝血系统的功能的指标。
该实验通过观察血浆中凝血酶形成所需的时间来测定。
正常情况下，APTT 的时间范围为25-35秒。
若APTT延长，则可能存在凝血因子活性降低或凝血因子缺乏的情况。
3. 血小板计数血小板计数是评估血小板功能的指标。
血小板是血液中的细小细胞片段，主要参与血液凝固过程。
正常情况下，血小板计数在150-450×10^9/L之间。
若血小板计数过低，则可能导致出血倾向。
4. 纤维蛋白原测定纤维蛋白原是血液凝固过程中的重要物质，参与形成纤维蛋白凝块。
纤维蛋白原测定可以评估纤维蛋白原的含量。
正常情况下，纤维蛋白原的浓度在2-4 g/L之间。
若纤维蛋白原浓度过低，则可能导致凝血功能异常。
三、血凝抑制实验血凝抑制实验是一种检测血液凝固抑制功能的方法。
该实验主要评估抗凝血酶、抗纤维蛋白聚合酶等物质对血液凝固过程的抑制作用。
1. 抗凝血酶实验抗凝血酶是一种重要的抗凝物质，可以抑制凝血酶的活性。
抗凝血酶实验通过测定血浆中抗凝血酶的活性来评估抗凝血酶功能。
禽流感血凝和血凝抑制试验
禽流感血凝和血凝抑制试验禽流感血凝-血凝抑制试验操作方法及注意事项禽流感血凝和血凝抑制试验可用于血清中抗体水平的监测，也可用于判断未使用疫苗群体的感染状态等。
该试验是目前世界卫生组织和国际动物健康组织进行全球流感监测所普遍采用的方法，而且因其具有经济、快速、可靠、操作简便、能够处理大量的样品，并能在短时间内报告禽流感抗体水平等优点，已经成为当前基层兽医实验室禽流感疫病监测和免疫抗体检测中最为常用的方法。
但因该试验受人为操作影响较大，经常因操作不规范、不严谨等造成结果偏差大、重复性差等问题，现根据几年来的工作经验对该试验过程中应注意的事项做一探讨。
一、血凝试验操作程序1、取96孔90°V形酶标板，用微量移液器在第一至第五排的1~12孔每孔加25 μL PBS液。
2、吸取25 μL标准禽流感抗原加入到第一排第1孔中充分混匀。
3、从第1孔吸取25 μL混匀后的抗原液加到第2孔中，混匀后吸取25μL加入到第3孔中，依次进行倍比稀释至第二排最后一孔即第24孔，最后弃去25 μL。
第三排孔至第四排孔同上操作。
4、依次向第一至第五排孔的每孔中加入25 μL 1%的鸡红细胞悬液。
5、将酶标板置于微量振荡器上振荡10秒，室温（20-25℃）静置30 min观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下）。
6、结果判定：将板作45°倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。
以完全凝集（不流淌）的抗原或病毒最高稀释倍数为1个血凝单位（HAU）二、血凝抑制试验操作程序1、根据血凝试验结果配制4HAU抗原。
（即1HAU抗原除以4）2、取96孔V形酶标板，用移液器在第1~12孔各加入25 μL PBS。
3、在第1孔加入25 μL被检血清，充分混匀后移出25 μL加至第2孔，依次类推，倍比稀释至第12孔，弃去25 μL。
4、按以上步骤加入阳性血清和阴性血清（各做两份），作对照孔。
5、在第1~12孔各加入25 μL 4单位抗原，置于微量振荡器上轻轻混匀，室温20-25℃下静置30 min。
试验四血凝及血凝抑制试验
血凝现象：有些病毒表面有血凝素，可凝集人,鸡,豚鼠等动物RBC。
原理：血凝素与RBC表面相应受体结合，引起RBC凝集；
用途：①滴定病毒的血凝效价，为血凝抑制试验做准备；
②确定病毒的存在；
凝集效价：能使血球产生++凝集的病毒最高稀释度为病毒的凝集效价，
即0.25 ml病毒液含1个血凝单位。在病毒血凝抑制试验中，一般用4个血 凝单位。
(1:64) 0.25
(1:128) (1:256) 0.25 0.25 0.25
0.5%RBC 0.25
(negative control) mix, RT, 45min~1hr，observation
血凝抑制试验
血凝抑制现象： 血凝素抗体使病毒失去凝集红细胞能力的现象。作
为临床检测试验，可用于检测血清中抗体含量或鉴 定病毒。称为血凝抑制试验。
(1:160) 0.25 0.5
(1:320) (1:10) 0.25 0.5 0.25(NS) 0.5 (Serum control)
V(4U)
0.25
0.5%RBC 0.5
Mix, RT, 1hr, observation
RBC凝集状态的解释
++++: agglutination of all RBC +++: agglutination of about 75% RBC
具体方法：
Tube
NS 血清 弃 0.25ml
1
0.45 0.05 (1:10)
2
3
4
5
6
7
0.45 0.05
↘
0.25 0.25
血凝和血凝抑制实验
实验三血凝和血凝抑制实验一、实验目的与要求掌握血凝和血凝抑制实验操作及应用二、实验内容H5亚型猪流感抗体检测与分析三、实验步骤（一）血凝（HA）试验1、用微量移液枪在微量反应板的第一排1-12孔均加入50μLPBS，换枪头；2、吸取50μL抗原，加入第一孔，反复吹打5次混匀；3、从第一孔吸取50μL加入第二孔，吹打混匀吸取50μL加入第三孔，如此稀释至第11孔，从第11孔吸取50μL丢弃，第12孔作为红细胞对照；4、各孔均加入50μL0.5%鸡红细胞悬液（已充分摇匀）；5、轻轻混匀，室温25℃静置20min观察结果；（二）血凝抑制（HI）试验1、血清样品处理：先加150μL胰酶溶液于300μL血清中，56℃水浴灭活30min 后冷却至室温；加900μL高碘酸钾，混合，室温孵育15min；加900μL丙三醇盐溶液，混合，室温孵育15min；加750μL生理盐水混合，4℃保存；2、根据HA试验中测定的HI抗原效价配制4单位抗原；3、在微量反应板第5-8排的2-11孔加入25μLPBS，第12孔加入50μLPBS；4、吸取50μL血清（编号为2-4血清、阳性血清、编号为1-4血清、阴性血清）加入第1孔，混匀后吸取25μL于第二孔，混匀后吸25μL于第三孔，依次稀释至第11孔，第11孔混匀后弃去25μL；5、各排前11孔均加入4单位抗原25μL，第12孔作为红细胞对照，室温下25℃静置30min；6、各孔均加入50μL0.5%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻摇匀，室温下25℃静置30min。
四、实验结果及分析血凝（HA）试验，从第三个孔开始显示“滴泪”第一排为阳性对照第二排为阴性对照第三排，血清5-6第四排，血清6-6参考文献[1]GB/T 27535-2011，猪流感HI抗体检测方法[S].。
血凝和血凝抑制试验
3. 4.
பைடு நூலகம்
0.85%生理盐水。 生理盐水。 生理盐水 被检血清，采自被检鸡的健康血清。 被检血清，采自被检鸡的健康血清。
四、操作步骤
（一）血凝试验（HA） 血凝试验（ ）
1. 在血凝板第一排的 在血凝板第一排的1~12孔加入 孔加入50µl生理盐水。 生理盐水。 孔加入 生理盐水 2. 在第1孔中加入 病毒抗原， 在第 孔中加入50µl病毒抗原，反复吸取混匀 孔中加入 病毒抗原 后吸50µl到第 孔，如此倍比稀释直到第 孔， 到第2孔 如此倍比稀释直到第10孔 倍比稀释直到第 后吸 到第 混匀后弃50µl； 最后两孔 （ 11、 12） 为红细 ； 最后两孔（ 、 ） 混匀后弃 胞对照。 胞对照。
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25 25 25 50
25
弃 50µl /
50 / / 50
25 50
注： 11孔为病毒对照 应该完全凝集， 12孔为细胞对照 孔为病毒对照， 孔为细胞对照， 1) 第 11 孔为病毒对照 ， 应该完全凝集 ， 第 12 孔为细胞对照 ， 应该完全沉积到孔底，只有当对照成立时试验结果方有效。 应该完全沉积到孔底 ， 只有当对照成立时试验结果方有效。 以红细胞100 凝集的稀释度为判定终点。 100% 2) 以红细胞 100% 凝集的稀释度为判定终点 。 血凝抑制滴度大 于等于1 为阳性，小于1 为阴性，等于2 为可疑。 于等于1：24为阳性，小于1：22为阴性，等于23为可疑。
病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开， 2 ） 病毒血凝素与完整成熟的病毒颗粒易于分开 ， 血凝素呈游离状态，例如天花 牛痘、 天花、 血凝素呈游离状态，例如天花、牛痘、鼠痘等 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 病毒，它们的凝集现象是可逆的。 3 ） 脑炎病毒 、 口蹄疫病毒等 ， 凝集红细胞的条 脑炎病毒、 口蹄疫病毒等， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 件很严格，对红细胞的种类有很严格的选择， 同时还要掌握反应的pH和温度等。 同时还要掌握反应的pH和温度等。 pH和温度等
血凝血抑实验操作方法
血凝血抑实验操作方法
血凝血抑实验是用于检测血液中凝血系统的功能活性以及血管壁退行性变的一
种实验方法。
以下是一般的血凝血抑实验的操作方法：
1. 准备实验材料：新鲜的血液样本（采集静脉全血，使用无抗凝剂采血管），离心管，血小板计数管，玻璃片，25ml量瓶，10ml吸管，实验药物（如凝血因子和抗凝剂），计时器等。
2. 静脉全血采血：无菌条件下，采用无抗凝剂采血管从肘静脉采集血液样本。
要确保血液样本无抗凝剂，否则可能会影响实验结果。
3. 离心采血管：将静脉全血样本转移到离心管中，进行离心，用离心管分离血浆和红细胞。
4. 准备血浆：将离心后的上清液（血浆）转移到另一个离心管中，避免污染。
5. 凝血时间测定：取一份血浆加入25ml量瓶中，并在37水浴中预热。
同时，另取一份新鲜全血作为对照。
用吸管将凝血药物垂直加入含血浆的25ml量瓶中，计时器计时，观察血浆的凝固时间。
6. 凝固酶测定：将凝血酶加入血浆中，搅拌均匀后，记录酶加入后的凝固时间。
7. 抗凝物质测定：分别加入抗凝物质（如肝素）到血浆中，搅拌均匀后，记录凝固时间。
8. 结果分析：根据实验结果，可判断凝血系统的功能活性以及抗凝系统的功能活性。
较长的凝血时间可能暗示凝血系统功能较差，而较短的凝血时间可能暗示凝血系统功能较好。
需要注意的是，血凝血抑实验是一种较为复杂的实验，需要在严格的实验条件下进行，并且实验药物的使用应遵循安全操作规范。
此外，实验结果需要结合临床病史和其他检查结果进行综合判断。
病毒血凝与血凝抑制实验报告
病毒血凝与血凝抑制实验报告一、实验目的本次实验旨在研究病毒的血凝现象以及血凝抑制反应，以深入了解病毒的特性和相关的免疫学机制。
通过实验，掌握病毒血凝与血凝抑制实验的操作方法和结果判断，为病毒的检测、诊断以及疫苗研发提供实验依据。
二、实验原理（一）病毒血凝现象某些病毒表面具有能够与红细胞表面受体结合的血凝素，从而使红细胞发生凝集。
这种凝集现象可以在显微镜下观察到，并且凝集的程度与病毒的浓度有关。
（二）血凝抑制反应当特异性抗体与病毒表面的血凝素结合后，会阻断病毒与红细胞的结合，从而抑制血凝现象的发生。
通过检测血清中抗体对血凝的抑制作用，可以判断血清中是否存在特异性抗体以及抗体的效价。
三、实验材料（一）病毒株选用已知血凝特性的病毒株，如流感病毒、新城疫病毒等。
（二）红细胞新鲜采集的鸡、豚鼠或人“O”型红细胞。
（三）血清待检血清和已知阳性、阴性对照血清。
（四）试剂磷酸盐缓冲液（PBS）、生理盐水等。
（五）器材96 孔微量血凝板、移液器、离心机、显微镜等。
四、实验步骤（一）红细胞悬液的制备1、采集新鲜血液，加入抗凝剂。
2、离心去除血浆，用生理盐水洗涤红细胞 3 5 次，直至上清液无色。
3、最后用生理盐水将红细胞配制成 1%的悬液备用。
（二）病毒血凝滴度的测定1、在 96 孔微量血凝板中，从第 1 孔至第 12 孔，每孔加入25μL PBS。
2、在第 1 孔中加入25μL 病毒液，然后从第 1 孔吸取25μL 病毒液至第 2 孔，依次倍比稀释至第 11 孔，从第 11 孔吸取25μL 弃去。
3、每孔加入25μL 1%红细胞悬液，轻轻振荡混匀，室温静置 30 60 分钟。
4、观察血凝结果，以出现“＋＋”凝集的最高稀释度作为病毒的血凝滴度。
（三）血凝抑制实验1、取已测定血凝滴度的病毒液，按照 4 个血凝单位/25μL 的量加入 96 孔微量血凝板的第 1 孔至第 10 孔，第 11 孔为病毒对照，第 12 孔为红细胞对照。
血凝和血凝抑制
二、血凝试验 hemagglutination test
• 原理 病毒粒子上的血凝素蛋白与红细胞特定表 面受体相结合,引起特异性凝集，
——血凝现象：有些病毒可凝集某些动物 如 鸡、鹅、豚鼠、绵羊 和人的红细胞，
HA试验的原理示意图
用途：1确定病毒的存在； 2测定病毒的血凝价
血凝价：能使一定量红细胞发生50%凝集的 病毒最高稀释度
孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 + 12 - H
稀释度 2 4 8
16 32 64 128 256 、、 、、 弃
A
PBS 25 25 25 25 25 25 25 5 25 25 25 25 25 25 25血 x 凝素
PBS
结果判定
1.在各组对照均正确的情况下,按下列标准判定
血凝反应强度示意图 “4＋” 红细胞呈片状凝集,均匀布满孔底,边缘有时不整齐或皱缩， “3＋” 红细胞呈片状凝集,但面积略小于“4+”， “2＋” 红细胞呈片状凝集,但有少许沉积孔底中部呈小圆点状， “＋” 红细胞大部分沉于孔底中央,周围有少量散在凝集颗粒， “－” 红细胞均沉于孔底呈小圆点状,边缘整齐， 2.对照孔正常的情况下,红细胞凝集100%的稀释度为判定血凝价的终 点，凡能使鸡红细胞完全凝集的病毒最高稀释倍数为病毒的凝集价，
实验材料
器材：96孔V型微量反应板、微量移液器、枪头 试剂：1%鸡红细胞 采集健康鸡血液,以阿氏液抗凝,
用PBS洗涤3-5次,用PBS配成1%红细胞悬液备 用， 试验抗原、PBS缓冲液
血凝实验步骤
1.取96孔V型反应板1块置于水平实验台上,在第1排
1-10孔内加入25ulPBS缓冲液,第11孔不加，第12孔
病毒的血凝及血凝抑制试验
病毒的血凝及血凝抑制试验IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】病毒的血凝及血凝抑制试验有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。
通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。
[目的要求]掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。
[材料与试剂]孔“U”形或“V”形微量反应板，50L定量移液器，滴头，微型振荡器。
2.生理盐水，%鸡红细胞悬液。
3.新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。
[实验内容及操作方法]（一）血球凝集(HA)试验1.在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50L生理盐水。
2.于左侧第1孔加50L病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50L 至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50L；第12孔为红细胞对照。
3.自右至左依次向各孔加入%鸡红细胞悬液50L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。
表4-1病毒血凝试验的操作方法（单位：L）4.结果判定：从静置后10min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。
红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。
以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。
从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。
(二)血球凝集抑制(HI)试验1.根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。
血凝和血凝抑制试验的注意事项及操作方法
泰安市山农大药业有限公司血凝和血凝抑制试验随着养殖业的飞速发展和广大养殖户科学意识的不断提高，人们普遍认识到实验室检测技术在临床应用的重要性。
下面简单介绍一下鸡新城疫微量血凝试验和血凝抑制试验的注意事项及操作方法。
应用：用于新城疫、产蛋下降综合征和传梁性支气管炎等的母源抗体的检测、雏鸡首免日龄的确定、疫苗免疫后的免疫应答的监测、临床鸡病的鉴别诊断等。
下面以新城疫病毒为例，介绍血凝和血凝抑制试验的方法：注意事项：一、样本要具有代表性：所采样本要能代表整体，通常采用四角加中间的随机取样法，并且确定适当的样品数量，一般1000只以下的鸡群采样率在2～5%；5000只以下1～2%；5000只以上0.5～1%。
对产蛋期间的鸡群可采鸡蛋；对雏鸡或青年鸡，可采血。
方法是：取青霉素小瓶，洗净后用蒸馏水冲洗、控干水分，并注意不要用消毒剂，以免影响结果。
每只鸡采血量在1ml左右，最好不低于1ml，在室温下静置至血清自然析出。
二、四单位抗原的准确性：要获得准确的监测效果，先做红血球的凝集试验，即测得抗原的血凝价，尔后前移2孔作为四单位抗原的稀释度。
三、红血球洗脱的充分性：原则上，新城疫检测所用的红血球应来源于非疫苗免疫过的健康公鸡，但实际上却多采用免疫过疫苗的健康公鸡，有时甚至是病鸡。
因此，对红血球的洗脱的次数要多、要充分，并注意转速和时间，通常采用五次变速离心法：前四次为每分钟1500转，每次5分钟，最后一次为每分钟3000转，持续7～8分钟。
另外，洗红血球过程中，应注意动作要轻，玻璃仪器之间尽量减少碰撞，以免造成红血球破裂而影响结果。
四、结果判定的及时性：检测中，每次试验均应设抗原与生理盐水对照，加入红血球后，每隔5分钟观察一次，一旦两列对照孔图像清晰地显示出来时，应立即对样本进行结果判定，过早过晚都会影响判定结果的准确性。
血凝与血凝抑制试验的操作方法一、材料与仪器：新城疫抗原、1%鸡红血球、抗凝剂、生理盐水、被检血清、离心机、吸管、滴管、洗耳球、烧杯、量筒、注射器、长针头、96孔V型医用血凝板、微量移液器、微量振荡器、恒温培养箱、冰箱等。
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血凝抑制（HI）试验操作规程
1.仪器、设备和试剂的准备
1.1仪器及设备
V型96孔血凝板、微量振荡器、低速台式离心机、含25μL的单道加样器、含25μL的
八道加样器、小圆底试管、吸管。
1.2抗原和试剂：
1.2.1相应HI抗原
1.2.2相应阳性血清
1.2.3生理盐水、阿氏液（血球保护液）
1.2.41%鸡红细胞悬液
1.2.4.1红细胞的采集从2-6月龄SPF公鸡翅静脉采集血液与等量的阿氏液混合（采集后
上下颠倒使血液和阿氏液混匀，防止凝血）
1.2.4.2红细胞的洗涤将于阿氏液混合的血液，分装于圆底试管中，以1000rpm离心5分
钟，吸弃阿氏液；加入适量生理盐水轻轻吸打将红细胞充分混合，以1500rpm离心5-10分
钟，吸弃上清液时，应注意吸弃红细胞表面的白细胞层，并应尽量吸净上清液。
按上述步骤，
用生理盐水对红细胞进行洗涤三次，最后一次洗涤应1500rpm离心10分钟（确保红细胞的
压积）。
1.2.4.3吸弃上清液，将沉淀的红细胞吸取1ml，加入99ml生理盐水摇匀配制成1%的红细
胞悬液。
（按照需要量配制）
1.2.4.41%红细胞悬液的标定对首次配制的红细胞悬液应进行标定，取配制好的红细胞悬
液60ml，自然沉降后，弃掉上部生理盐水50ml，混匀后装入刻度离心管中，1000rpm离心
5分钟，红细胞压积应为0.6ml
2．HI抗原工作液配制
2.1HI抗原血凝价测定
血凝试验：
1．取一块V型96孔板，按表1每孔加入生理盐水25ul，将HI抗原进行系列倍比稀
释，至11孔后吸取25ul弃去，第12孔为对照，稀释后每孔再加入25ul生理盐水，最后每
孔加入1%鸡红细胞悬液25ul，微量振荡器中速摇匀，置于室温（20—25℃），20~30分钟后
判定结果，以能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数作为判定终点。
表1病毒血凝试验
孔号：123456789101112滴度：1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照
生理盐水252525252525252525252525抗原(病毒)2525252525252525252525弃去生理盐水252525252525252525252525红细胞悬液252525252525252525252525
轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果
图1
如图1所示为禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的血凝价测定，第9孔为能使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数，因此该禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原血凝价为1:512
2.2HI抗原工作液配制及检验
2.2.14HA100单位的抗原配制
4个100%血凝单位（即4HA100）抗原的稀释倍数=使100%红细胞凝集的抗原最高稀释倍数/4
图1所示禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原的4HA100单位的抗原=512/4=128
2.2.24HA100单位抗原的检验
4HA100单位抗原的检验按表2进行。
检查血凝价是否准确，应将配置好的4HA100单位的抗原再用生理盐水稀释，使其稀释度为1:2、1:3、1;4、1:5、1:6、1:7。
将每一稀释度的抗原25ul加入生理盐水25ul，最后加入1%鸡红细胞悬液25ul，用微量振荡器中速振匀，置室温（20~25℃），20~30分钟后判定结果。
将血凝板在20~25℃下放置20~30分钟后，如果1:4稀释度是100%红细胞凝集终点，说明配制的是4HA100单位的抗原；如果100%红细胞凝集终点是1:5或1:6说明配制的4HA100单位抗原实际上高于4个单位；如果100%红细胞凝集终点是1:2或1:3说明配制的4HA100单位抗原实际上低于4个单位。
使用时应根据检验结果做适当调整，使抗原工作液确为4HA100单位
表14HA100单位抗原的检验
孔号：123456
4HA100抗原的稀释度1:21:31:41:51:61:7
稀释的4HA100抗原252525252525
生理盐水252525252525
1%鸡红细胞悬液252525252525轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果
2.2.34HA100单位抗原的调整
稀释倍数=使100%红细胞凝集终点的稀释倍数x原4HA100单位抗原的稀释倍数/4
图2
如图2所示，使100%红细胞凝集终点的稀释倍数为1:3，说明配制的4HA100单位抗原实际
上低于4个单位，所以调整后的4HA100单位抗原稀释倍数=使100%红细胞凝集终点的稀释
倍数x原4HA100单位抗原的稀释倍数/4=3X128/4=96
按1:96稀释禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原，制成4HA100单位抗原。
3．血凝抑制试验（HI）
3.1取96孔微量反应板，分别向1~12孔中加入25ul生理盐水。
3.2吸取25ul待检血清，加至第一孔内，充分混匀后，吸取25ul至第二孔，依次2倍稀释
至第十孔，从第十二孔中吸取25ul弃去。
3.3每块板上设置标准阳性对照和阴性对照，稀释方法同3.2
3.4分别向1~12孔中加入含4HA100单位的抗原25ul，微量振荡器中速混匀后室温（20~25℃
左右）静置20~30分钟。
3.5每孔中加入25ul1%鸡红细胞悬液，微量振荡器上轻轻震荡均匀，室温下（20~25℃）
静置20~30分钟。
3.6结果判定凝集现象表现为红细胞平铺在V型管底壁，凝集严重时红细胞膜片边缘可
能出现卷边现象。
未凝集的红细胞在V型血凝孔中呈现为明显的红色圆点。
将反应板倾斜
45度角后判定结果，当红细胞呈现泪滴状流淌且没有凝集颗粒时为100%抑制。
当阴性血清
HI效价≤2log2、阳性血清HI效价与已知结果相比误差≤1log2时，试验方可成立。
以完全抑制4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度作为HI效价。
表396孔板微量法血凝抑制试验
孔号：123456789101112
血清稀释倍数1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照
生理盐水252525252525252525252525
被检血清2525252525252525252525弃去4HA100抗原252525252525252525252525
轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后加入红细胞悬液
红细胞悬液252525252525252525252525
轻轻振荡1-2min置于20~25℃静置20-25min后判定结果
图3
如图3所示，抗体1完全抑制4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第10孔，故其效价为1:1024；抗体2和抗体3完全抑制4HA100单位抗原凝集的血清最高稀释度为第9孔，其效价为1:512，阴性血清完全凝集，阳性血清与已知效价一致，因此该结果成立。
附：
阿氏液配方：
葡萄糖 2.05克
柠檬酸钠0.8克
柠檬酸0.055克
氯化钠0.42克
加蒸馏水至100毫升，调PH值至6.1，115度，10分钟灭菌。
4度保存。
使用比例：静脉血液与阿氏液1:1。
PBS1L配方pH7.4：
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.28g，
磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.15g，
氯化钠(NaCl)：8g，
加去离子水定容到1L。
抗凝剂配方：
柠檬酸钠3.8g
加蒸馏水至100毫升，10分钟灭菌。
4度保存。
使用比例：静脉血液与抗凝剂1:9。