分子生物学电子教案第九章

•第九章分子生物学研究方法

1．课程教学内容

(1)核酸技术1—基本操作

(2)核酸技术2—克隆技术

(3)核酸技术3—测序

(4)基因表达和表达分析基因定点诱变

(5)蛋白质与核酸的相互作用

(6)其他（热点）技术

2．课程重点、难点

基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术

3．课程教学要求

掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。

本章内容

•核酸的凝胶电泳

•DNA分子的酶切割

•核酸的分子杂交

•基因扩增

•基因的克隆和表达

•细菌的转化

•DNA核苷酸序列分析

•蛋白质的分离与纯化

•研究DNA与蛋白质相互作用的方法

一、核酸的凝胶电泳

基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。

由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。

在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。

Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.

Agarose (琼脂糖):

(1) a much less resolving power than polyacrylamide,

(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kb

DNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)

Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):

(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differ from each

other as little as a single base pair/nucleotide.

(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a few hundred

bp).

Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)

(1)The electric field is applied in pulses that are oriented orthogonally

(直角地) to each other.

(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as well as to

their shape and topological properties.

(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up to several

Mb in length.

二、DNA分子的酶切割

Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sites

Restriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.

RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRI

The random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46) (1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.

(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.

(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).

(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.

三、核酸的分子杂交

原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。如果彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，那么如

此形成的双链分子就叫做杂种核酸分子。

在大多数的核酸杂交反应中，经过凝胶电泳分离的DNA或RNA分子，都是在杂交之前，

通过毛细血管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地

吸印上去。

常用的滤膜有尼龙膜、硝酸纤维素滤膜，叠氮苯氧甲基纤维素滤纸和二乙氨基乙基纤维

素滤膜

核酸杂交通常包括两个步骤：

第一，将核酸样品转移到固体支持物滤膜上，这个过程称为核酸印迹转移

第二，将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。Southern Blotting：

根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的 DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链DNA 或RNA探针的杂交作用检测这些被转移的DNA片段，这种实验方法叫做DNA 印迹杂交技术。是由E.Southern于1975年首先设计出来的，故又叫做Southern DNA印迹技术。

Northern Blotting

1979年，J.C.Alwine 等人发展出的一种用于RNA杂交的新方法。将电泳凝胶中的RNA转移到叠氮化的或其它化学修饰的活性滤纸上，通过共价交联作用而使它们永久地结合在一起。称为Northern Blotting

将蛋白质从电泳凝胶中转移并结合到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射同位素标记的

特定蛋白的抗体反应，这种技术叫做Western Blotting.