siRNA表达载体与阳离子脂质体复合物转染HepG2.2.15细胞实验研究

siRNA 表达载体与阳离子脂质体复合物转染

HepG2.2.15细胞实验研究*

杨慧 刘明社 张国英 张芸 赵中夫

山西长治医学院肝病研究所（046000）

E­mail：zhaozf_1226@

摘 要：目的 观察针对 HBV X 的 siRNA 表达载体 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体的 复合物对 HepG2.2.15 细胞转染效果及其对 HBVM 表达的影响。 方法 以 pGenesil-siAFP 表 达载体和非转染细胞分别作非特异性序列对照组和空白对照组，用不同配比浓度 pGenesil-HBV X与阳离子脂质体的复合物转染 HepG2.2.15 细胞，荧光显微镜下观察并计算 转染阳性细胞百分率，筛选出最佳转染效率的剂量配比。于转染后 24、48、72 小时采用时 间分辨荧光免疫测定技术（TRFIA）检测上清液中 HBsAg 和 HbeAg。结果 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体复合物 8μl：2.5μg 剂量配比组的平均转染率达到了 55.1±4.3％，且不 影响细胞活性；

转染后48小时和72小时后该siRNA表达载体对HepG2.2.15细胞表达HBsAg 和 HbeAg 抑制作用显著（P＜0.05）；结论 8μl：2.5μg 剂量配比组的 pGenesil-HBV X与 阳离子脂质体复合物是最佳的转染剂量配比，能有效抑制 HepG2.2.15 细胞表达 HBsAg 和 HbeAg。

关键词：siRNA，转染，阳离子脂质体，HepG2.2.15细胞

1. 引 言

RNA 干扰技术，是由 21～23nt 组成的双链 RNA 介导的、序列特异性诱发同源基因转录 后沉默（post-transcriptional gene silence , PTGS）的技术。这一技术为抗病毒治疗提 供了新策略 [1-3] 。

在已报道应用 RNAi 抑制乙肝病毒的实验中大多采用体外转录合成 siRNA 或构建 siRNA 表达载体与病毒基因表达载体共同转染目的细胞的方法 [4,5] 。这些研究注重对转染阳性细胞 靶基因的抑制效果，较少考虑转染阳性率。为使 RNAi 抗病毒治疗试验研究能为它的实际应 用提供更有用的证据，我们采用了与共转染不同的试验条件，选用可以持续分泌 HBV 各种病 毒标志物及 HBV-DNA 的 HepG2.2.15 细胞为实验对象，仅转染 siRNA 表达载体，对培养于同 一体系中的转染细胞与未转染细胞上清液 HBVM进行检测。探讨不同配比浓度 pGenesil-HBV X 与阳离子脂质体 Metafectene 的复合物转染 HepG2.2.15 细胞的转染效率和 RNAi 的抗 HBV 作用。

* 本课题得到山西省自然基金（项目编号：20051114）资助。

2. 材料与方法

2.1 主要试剂：高糖型 DMEM 培养基购自美国 GIBCO 公司，新生牛血清购自杭州四季 青生物制品公司，Metafectene 转染试剂购自德国 BIONTEX， HBsAg、HBeAg 荧光免疫分析 试剂盒购自苏州新波生物技术有限公司。

2.2 HepG2.2.15细胞的培养及准备：HepG2.2.15细胞由北京大学医学部病毒研究 室惠赠，本室传代与培养。HepG2.2.15 细胞生长于高糖型 DMEM 中（含 10％新生牛血清、 2mmol/l 谷氨酰胺、100U/ml 青霉素及 100μg/ml 链霉素），并在 37℃、5％CO2 孵箱中进行 培养。细胞自复苏后，3-4 天规律传代，随传代次数的增加连续监测相同种植密度细胞上清 液中病毒标志物的变化，传至 7～8 代时病毒表达及复制水平达 HBV-DNA 达 10 7 拷贝时，开 始用于实验。转染前选择对数生长期细胞，用 0.25％ 胰酶-0.02％ EDTA 消化后吹打成单细 胞悬液，以 4×10 5 密度培养于放置了无菌处理盖玻片的 6 孔培养板中，每孔 2ml。24 小时 后观察细胞生长铺满孔底面积约 70％时用于转染。

2.3 靶序列的选择：针对 HepG2.2.15 细胞 HBV X 区选择作用靶点。为了避免只选择 一个序列可能出现无效或低效的情况，我们选用在 Amir shlomai的 RNAi抗 HBV 实验中被证 实有效的 1649 i — GGTCTTACATAAGAGGACT — 为靶点 。 同时以 AFP 1275i — GCATTGGCAAAGCGAAGCT—为与 HBV 无关的内对照作用位点（已经本室证实有效，另文报道）。

2.4 SiRNA 表达载体的构建：构建质粒载体 pGenesil-siHBV X插入的 DNA 模板序 列为：

5’-GATCCGGTCTTACATAAGAGGACTTTCAAGACGAGTCCTCTTATGTAAGACCTTTTTTGTCGACA-3’（正义 链），3’-GCCAGAATGTATTCTCCTGAAAGTTCTGCTCAGGAGAATACATTCTGGAAAAAACAGCTGTTCGA-5’ （反义链）；构建质粒载体 pGenesil-1-siAFP插入的 DNA 模板序列为：

5’-GATCCGCATTGGCAAAGCGAAGCTTTCAAGACGAGCTTCGCTTTGCCAATGCTTTTTTGTCGACA-3’（正义 链），3’-GCGTAACCGTTTCGCTTCGAAAGTTCTGCTCGAAGCGAAACGGTTACGAAAAAACAGCTGTTCGA-5’ （反义链）。pGenesil 质粒载体上游限制性酶切位点为 BamHI，下游限制性酶切位点为 Hind Ⅲ。以重组有 EGFP的 pGenesil-1-siAFP 作非特异性序对照组。两种载体质粒的构建及酶切 鉴定、DNA 序列分析由武汉晶赛生物工程公司协助完成。

2.5 质粒载体的转染：转染试剂 Metafectene与 pGenesil 质粒载体复合物的剂量配 比在说明书建议范围（2～7：1）内选择， pGenesil-siHBV X与 META的复合物按照可获得 最大转染效率的剂量比进行配制。

2.6 转染效果观察：荧光显微镜下观察不同配比的转染效果，每孔找三个具有代表 性的视野，各观察 100个细胞，计算阳性细胞百分率， 确定出 RNAi实验的最适 Metafectene / pGenesil比例。

2.7 细胞活性测定：0.4％的台盼蓝拒染实验评估细胞活性。 每样本随机取三个视野， 计数其中着色细胞。细胞活力=（总细胞数—着色细胞数）÷总细胞数×100％ 。