细胞化学染色68627
《细胞化学染色》PPT课件 (2)
PO43-，与Pb2+作用生成磷酸铅沉淀， 定位于胞浆中酶活性存在处，再与硫化 铵作用，生成棕黑色的硫化铅沉淀。
• 试剂：
• 1.固定剂：40%甲醛溶液〔福尔马林〕。
• 2. 工作液配制：
• 蒸馏水
37ml
• 0.2mol/L pH4.7醋酸缓冲溶液 6ml
试剂：
• 1.固定剂：1∶9福尔马林乙醇液，即40％甲醛溶液 〔福尔马林〕10ml加无水乙醇90ml混合即得。
• 2.a-磷酸萘酚钠溶液：100mg a-磷酸萘酚钠溶于 100ml0.2mol/L〔pH9.1～9.7〕Tris缓冲溶液中，混 匀后4℃保存。
• 3.Tris缓冲溶液〔0.2 mol/L pH9.2〕：Tris粉〔三羟甲 基氨基甲烷〕2.43g溶于100ml蒸馏水中，加浓盐酸 0.2ml〔0.167ml〕。
Ⅱ级 ++ 胞浆呈棕色片状沉淀， 小到中等颗粒约占胞浆面积 的50%～75%。
Ⅱ级 ++ 胞浆呈棕色片状沉淀，小 到中等颗粒约占胞浆面积的50% －75%。
• Ⅲ级 +++ 胞浆充满棕黑色沉淀， 分布均匀，中到大颗粒占胞浆面 积的75%－100%。
Ⅲ级 +++ 胞浆充满棕黑色沉淀， 分布均匀，中到大颗粒占胞浆面 积的75%－100%。
• 0.15mol/L〔5%〕硝酸铅
1ml
• 0.1mol/L〔3.2%〕β－甘油磷酸钠 2ml
• 3.稀硫化铵溶液〔临用时现配〕：取硫 化铵水剂0.75ml加蒸馏水至50ml。
• 4.甲基绿溶液：1g甲基绿溶于50ml蒸馏
细胞化学染色
细胞化学染色细胞化学染色是将形态和功能相结合的细胞科学。
它是在保持完整的细胞形态和细胞结构的前提下,运用化学反应将被检细胞内的各类化学成分和细胞结构及生理活性物质原位地显示。
因而对于探索细胞内的化学成分、生理功能、新陈代谢及细胞生理和病理改变有着重要意义。
血液细胞化学染色的范围一般可分为：蛋白质类（氨基酸、酶)、核酸类、多糖类、脂类、盐类或金属类,采用的方法通常为化学结合和物理溶解及酶-底物反应。
临床评价:1.细胞化学染色的开展,已有数十年的历史。
其在结合细胞形态学的基础上对各类白血病的确诊，对许多血液疾病鉴别诊断中的帮助，对各种良、恶性血液系统疾病疗效和预后估计提供一定的信息。
2.血液系统各种恶性疾病，特别是急性白血病，因其多为早期分化较差的病理细胞增殖,客观上存在着形态变异、畸形发育，即使是有经验的检验人员仅凭细胞形态也难以避免错误诊断的发生。
如将细胞形态和细胞化学染色相结合，能提高急性白血病的诊断和较正确地对其分型及亚型分型，即为急性白血病FAB 分型。
3.近年来，由于细胞免疫学、细胞遗传学、分子生物学和细胞超微结构等迅速发展，进一步推动了细胞化学染色这一领域的进展，并出现了细胞免疫组织化学染色、细胞超微化学染色等更新、更准确的检验方法与手段，对探讨各类血液疾病发病原理和观察治疗反应及预后起了极其重要的作用。
如将细胞免疫化学、细胞遗传学、分子生物学这三者与细胞化学染色及细胞形态学相结合，对各种白血病进行分型，即成为白血病的MICM分型诊断。
4.细胞化学染色通常应用在各种血液系统疾病特别是对各种急性白血病的诊断与鉴别诊断中。
但白血病细胞因其呈高度的异质性和多态性，有时即使是同一类型的白血病也可在细胞形态、细胞化学染色结果、细胞免疫表型及分子生物学等方面存在较大的差异。
所以对各类型白血病作一套较完整的细胞化学是补充了单凭形态对细胞辨认的不足。
因此我们在实际工作中若要对各类型白血病作出比较准确的诊断与鉴别诊断，应尽可能采用多项细胞化学染色或双（多）重染色。
细胞化学染色检验方法和要求
定义：
细胞化学染色是细胞学和化学相结合的一 门科学。它是以细胞形态学为基础，根据 化学反应的原理、应用涂片染色的方法观 察细胞的化学成分及其变化的重要方法。
各种类型血细胞的化学成分（酶，脂，糖， 蛋白，核酸）,分布及其量不完全相同,在病 理情况下,血细胞的成分可发生改变.
二、中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）
原理:成熟中性粒细胞内的AKP在PH 9.4~9.6缓 冲
液中能水解基质液中的α-磷酸柰酚，产生α-奈 酚，其与重氮盐偶联，形成不溶性灰黑色偶氮染 料沉淀，定位于酶活性处。
AKP主要存在于中性成熟粒细胞内,其他细胞基 本阴性.
阳性程度：
- —— 胞浆中无紫黑色颗粒 + —— 胞浆中有一层棕黑色不透明或局限地 方 有紫黑色颗粒(约1/4) ++—— 胞浆中颗粒占胞浆1/2或遍布整个胞 浆，但较疏松 +++—— 胞浆中颗粒占3/4，颗粒染色浓 ++++——仅见核影，其余均是黑色
原理： 正常人骨髓中的储存铁主要存在于骨髓
小粒和幼红细胞中。骨髓小粒中的含铁血黄素 称细胞外铁，其中的三价铁与分子中的蛋白质 结合不牢，经稀盐酸处理后而游离，并能在酸 性亚铁氰化钾溶液中产生普鲁士蓝反应。细胞 内铁也可用此法显示。根据反应的强弱了解骨 髓中铁的含量。
细胞内铁：中、晚幼红细胞胞浆中有蓝绿色颗 粒,为铁蛋白. 铁粒幼细胞：胞质内有蓝绿色颗粒的幼红细胞. 环铁粒幼红细胞：胞质内有蓝绿色颗粒在6个以 上，并围绕于核周排列成环形者，超过1/2区
4.再障与PNH的鉴别 再障—— NAP增高 PNH —— NAP减低
慢粒与中性粒细胞性类白血病反应的鉴别
三、过氧化物酶染色（POX）
细胞化学染色
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6、临床意义 （1）正常分布 粒系:早期原粒阴性，晚期原粒及以下各阶段呈 不同程度阳性。 单核系:早期原单阴性，其它阶段皆呈弱阳性。 淋巴、红系、浆细胞、巨核均呈阴性。
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（2）急性白血病的鉴别诊断 幼稚细胞POX阳性率≥3% ：急非淋（AML) 幼稚细胞POX阳性率＜3% ：急淋（ALL)
至9.2，4℃保存！
（3）作用(基质液): 磷酸萘酚钠
5mg
N-N二甲基酰胺 1ml
Tris-Hcl液
4ml
坚固蓝RR盐
5mg
（4）复染液：1%中性红
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3.操作步骤 1、新鲜、干燥的外周血或骨髓涂片（标本片及 对照片）加固定剂作用30秒（染缸），水洗待干； 2、滴加作用液，室温染色15min，水洗待干； 3、1%中性红复染1min
过氧化物酶染色 中性粒细胞碱性磷酸酶染色 糖原染色 非特异性酯酶染色 特异性酯酶染色 骨髓铁染色
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（一)过氧化物酶(POX)染色
1、原理：
pox
H2O2
O
联苯胺
联苯胺蓝 +
亚硝基铁氰化钠
蓝黑色颗粒
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2.试剂 (1)联苯胺酒精溶液： 取0.3g联苯胺加亚硝基铁氰化钠饱合液（36%）1ml, 再加95%乙醇至100ml，存在于棕色瓶中，可存一年。 (2) 稀过氧化氢（新鲜配制）：取50ml蒸馏水加 30%H2O21滴。 （3）瑞吉氏复染液
细胞化学染色检验
申家辉
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一、概述 二、细胞化学染色的基本方法 三、临床应用
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一、概 述
1、概念： 细胞化学染色是细胞学和化学相结合而成的一门
细胞化学染色
细胞化学染⾊细胞化学染⾊检验前⾔细胞化学是细胞和化学相结合的⼀门科学。
细胞化学染⾊是根据化学反应的原理，应⽤涂⽚染⾊的⽅法，观察细胞的化学成分及其变化的重要⽅法。
在病理情况下，⾎细胞的化学成分可发⽣改变。
因此，细胞化学染⾊不仅对研究⾎细胞的代谢活动、⽣理功能，⽽且对⽣理和病理情况下⾎细胞的化学成分的变化、各种类型⾎细胞的鉴别、某些⾎液病的鉴别诊断、疾病的疗效观察以及发病机制的探讨均有重要意义。
研究⾎细胞的化学物质较多，如各种酶类、脂类、糖元、铁等。
下⾯主要介绍⾎液学中常⽤的⼀些细胞化学染⾊⽅法。
瑞⽒染⾊法：瑞⽒染⾊液的配制：瑞⽒染料（粉）1g纯甲醇60ml将染料放在乳钵内加少量甲醇研磨使染料溶解，然后将已溶解得倒⼊洁净的玻璃瓶内，剩下未溶解的再加少量甲醇研磨，如此继续操作，直到全部染料溶解及⽤完甲醇为⽌。
制配好的染液保存于温室中⼀周便可应⽤。
新鲜配制的染液偏碱性，放置后可呈酸性，染液储存愈久染⾊愈好。
缓冲液的配制及其作⽤:1% KH2PO4 (即1g KH2PO4+100ml蒸馏⽔) 30ml1% Na2HPO420ml加蒸馏⽔⾄1000mlPH 6.4~6.8过氧化物酶染⾊⼀、原理：细胞中的过氧化物酶（POX）分解底物过氧化氢（H2O2）产⽣新⽣态氧，后者使联苯胺氧化为联苯胺蓝沉淀⽽定位于POX活性部位。
⼆、过氧化物酶染⾊法染液的配制：（1）联苯胺（Benzidine）0.3g95%⼄醇（Ethye alcohol）99ml36%亚硝基铁氰化钠（Sodium Nitroprusside）1ml (0.36g+1ml蒸馏⽔，置于37℃⽔浴箱中促溶。
)（2）30%mlml过氧化氢溶液：30%双氧⽔，吸取⼀滴约0.05ml放⼊50ml蒸馏⽔内，每次⽤时必须新鲜配制。
三、结果判断：细胞质中有蓝⾊颗粒的为阳性细胞。
四、临床意义：粒细胞中除早期原粒细胞呈阴性反应外，晚期原粒细胞及以后各阶段粒细胞均呈阳性反应，细胞越成熟反应越强。
细胞化学染色
细胞化学染色细胞化学染色2011年03月02日老三届极品居认真做事，低调做人。
记住该记住的，忘记该忘记的，改变能改变的，接受不能改变的。
一、概述细胞化学是组织学的一个分支，是在细胞形态学的基础上研究细胞的生物化学成分,及其定位、定量及代谢功能状态的学科。
在细胞形态学的基础上，运用化学反应的原理对血细胞内的各种生化组成及其代谢产物（酶类、脂类、糖类、铁、蛋白质、核酸等）作定性、定位、半定量分析的方法。
细胞化学染色临床上主要用于：①辅助判断白血病的细胞类型。
白血病的诊断以形态学为基础，但有时仅采用瑞式染色是难以判断白血病细胞的类型的。
不同的细胞系列，其所含的化学物质成分、含量及分布各不相同，随着细胞的分化阶段及病理生理状态变化，这些物质的含量也会发生相应改变。
因此根据细胞化学染色结果的不同，可推断细胞的所属系列。
因此临床上细胞化学染色成为辅助诊断白血病必要的、有力的手段。
②其他血液系统疾病的诊断和鉴别诊断。
在病理情况下，血细胞的化学物质的成分及含量会发生改变，据此可以辅助疾病的鉴别诊断。
如中性粒细胞碱性磷酸酶染色、铁染色等。
③观察疾病的疗效和预后。
当病理状况纠正后，血细胞的化学物质的成分及含量会发生改变。
④发病机制的研究。
细胞化学染色的基本步骤为固定、显示及复染。
1、固定为了保持细胞结构及化学成分的不变，需要对细胞进行固定。
根据染色的成分不同，选择合适的固定液，使细胞内的蛋白质、酶类、糖等变成不溶性物质。
固定的方法有物理法和化学法，临床常用化学法固定。
物理法包括干燥和火焰固定，化学法包括甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定。
采用蒸气或液体固定。
（1）蒸气固定：甲醛是常用的固定剂，极易挥发、氧化，常用40％甲醛蒸气固定。
方法为在封闭的玻璃器皿中加入40％甲醛，将涂片血膜朝下，固定5～10分钟。
（2）液体固定：将涂片浸在甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等固定液中，也可将两种或两种以上固定液混合，如10％甲醛甲醇液，甲醛丙酮液等。
(推荐)《细胞化学染色》PPT课件
【试剂】 ▪ 1%TMB ▪ 亚硝基铁氰化钠饱和溶液 ▪ 1%过氧化氢溶液 ▪ 稀过氧化氢溶液 ▪ 瑞氏染色液
▪ 【操作】 ▪ 1. 取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亚硝基铁氰
化钠饱和溶液10ml，溶液呈淡棕黄色。 ▪ 2. 在新鲜干燥的血片上，加混合溶液0.5ml,
放置lmin后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml， 染色6min 。 ▪ 3. 瑞氏染液复染15～20min 。 ▪ 4. 油镜镜检。
▪ 【结果】 ▪ （1）粒细胞系： ▪ 原粒细胞多呈阴性反应，也可弱阳性。
▪ 苏丹黑B染色较过氧化物酶染色更敏感， 但特异性不如过氧化物酶染色（极少数急 性淋巴细胞白血病可为阳性）。
M1-SBB(+)
M2-SBB(+)
三、过碘酸一雪夫（PAS)染色
▪ 【原理】
胞浆内存在糖原或多糖类物质（如粘多糖 、粘蛋白、糖蛋白、糖脂等）中的乙二醇 基（CHOH-CHOH）经过碘酸（periodic acid）氧化，转变为二醛基（CHO-CHO ），与雪夫(Schiff )试剂中的无色品红结 合，形成紫红色染料而沉积于胞浆中。该 反应称为过碘酸一雪夫(PAS)阳性反应。
粒逐渐增加。
▪ 早期原粒细胞一般为阴性，少数细小点状 颗粒代表线粒体被染色
▪ 晚期原粒细胞可出现阳性颗粒，其颗粒限 于胞浆的某一区域。
2. 单核细胞系 阳性，颗粒细小，分布弥散，形状不规则 。原单核细胞为阴性。 3．红细胞系、淋巴细胞系均呈阴性反应 4．尼曼一匹克细胞和戈谢细胞均为阳性 反应。
5．苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相 似，主要用于急性白血病类型的鉴别。
Hale Waihona Puke ▪ 下面介绍几种常用的细胞化学染色 方法
▪ 这些方法学在白血病的鉴别诊断上 具有重要意义。
《细胞化学染色》课件
标记染色剂
2
于最佳状态以获得清晰的染色结果。
选择适当的染色剂，与细胞内的目标
分子发生特异性反应。
3
洗涤
去除多余的染色剂，减少非特异性背
显微镜观察
4
景染色。
使用显微镜观察和记录染色后的细胞 结构和染色结果。
细胞化学染色的应用领域
1 病理学研究
方法
包括直接染色、间接染色和特殊染色等方法， 根据目的和需求选择适当的方法。
技术
需要合适的实验步骤和条件，包括样品制备、 染色剂选择和显微镜观察。
常用的细胞化学染色方法
伊纳尔反应
用于检测脱氧核糖核酸(DNA)的存在和分布。
酸性磷酸酶染色
用于检测酸性磷酸酶活性和酶的分布。
特殊染色
用于检测细胞中特定结构或分子的存在和分布，如免疫组化染色。
结论及展望
细胞化学染色是一种强大的技术，帮助我们深入了解细胞结构与功能。未来， 随着技术的不断发展和创新，细胞化学染色将在多个领域继续发挥重要作用。
细胞化学染色
细胞化学染色是一种通过特定染色剂使细胞内的化学成分显现的技术。它在 细胞研究和诊断中起着重要的作用，帮助我们更好地了解细胞的结构和功能。
细胞化学染色的定义
目的
通过染色剂将细胞内的特定化学成分显现出 来，例如核酸、蛋白质、多肽等。
原理
染色剂与细胞内化学成分之间的特异性反应， 例如酶活性、酸碱性和亲和性。
通过染色剂对病理变化 进行观察和鉴定，辅助 诊断和治疗决策。
2 细胞生物学研究
了解细胞结构和功能， 探索细胞内分子的表达 和相互作用。
3 药物研发
评估药物对细胞内目标 分子的作用和影响，辅 助药物研发过程。
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M1-SBB(+)
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M2-SBB(+29)
三、过碘酸一雪夫（PAS)染色
• 4、雪夫反应：过碘酸氧化细胞内糖类中乙 二醇基形成乙醛基，醛基与雪夫试剂作用， 使无色品红形成红色沉淀。
• 5、金属沉着法
• 其他尚有物理学方法，如脂溶性染料染色 （显示脂质）、荧光显示、放射自显影以 及体外活体染色亦常用于临床血液细胞学 诊断。
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• （三）细胞化学定量
• 粗略估量，以染色反应的强弱，受色的深浅， 人为地区别为阴性和各种程度的阳性。
（一）四甲基联苯胺法 • 【原理】 粒细胞和单核细胞的胞浆内的
髓过氧化物酶（POX orMPO）分解过氧 化氢，释放新生态氧，使无色联苯胺氧 化成蓝色联苯胺，后者进一步变成棕色 化合物沉着于细胞质内。
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【试剂】 • 1%TMB • 亚硝基铁氰化钠饱和溶液 • 1%过氧化氢溶液 • 稀过氧化氢溶液 • 瑞氏染色液
1/4有致密的颗粒。 （++）颗粒较少，或胞质面积的1/2出现黑色颗粒。 （+++）颗粒较密，或胞质面积的3/4出现黑色颗粒。 （++++） 颗粒极密，颗粒间无间隙。
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• 【临床意义】
• 1. 粒细胞系
• 早幼粒及以下阶段随着细胞成熟，阳性颗 粒逐渐增加。
• 早期原粒细胞一般为阴性，少数细小点状 颗粒代表线粒体被染色
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• （5）过氧化物酶染色 • 主要用于鉴别急性白血病类型， • 急性髓细胞白血病多呈阳性反应，以M3和
M2型反应最强，MI和M5型反应较弱， • 故有助于区别M3和M5型。 • 急性淋巴细胞白血病呈POX阴性反应，故
为急性髓细胞和淋巴细胞白血病鉴别的重 要指标。
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AML-M1
• 百分法，只能反映细胞阳性率，不能反映受 色强弱。
• 积分法，是常用的半定量法，将等级估量与 百分率相结合它既反映了细胞阳性率的高低， 又反映了细胞受色的强弱。
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• 下面介绍几种常用的细胞化学染色方 法
• 这些方法学在白血病的鉴别诊断上具 有重要意义。
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一、过氧化物酶染色（POX）
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M1 - POX(1+9)
×
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二、苏丹黑B染色
【原理】 苏丹黑B (sudan black B , SB )是一种能 溶解于脂肪中的色素染料，可使细胞内的 中性脂肪、磷脂和类固醇着色，即使细胞 内微细结构的脂类物质也能显示出来。
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• 【试剂】 • 1. 10%甲醛液。 • 2. 苏丹黑B乙醇溶液
• 晚期原粒细胞可出现阳性颗粒，其颗粒限 于胞浆的某一区域。
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2. 单核细胞系 阳性，颗粒细小，分布弥散，形状不规则。 原单核细胞为阴性。 3．红细胞系、淋巴细胞系均呈阴性反应 4．尼曼一匹克细胞和戈谢细胞均为阳性 反应。
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5．苏丹黑B和过氧化物酶染色临床意义相 似，主要用于急性白血病类型的鉴别。
丙酮和醋酸等。
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（二）显示
1、偶氮偶联法：利用人工合成的酶底物， 在酶作用下，产生分解产物，再与重氮盐 结合引起偶氮偶联，使其形成不溶性的偶 氮色素，以此证明酶的存在。
2、联苯胺法：粒细胞和单核细胞中的过氧 化物酶作用于过氧化氢，释放新生态氧， 使无色的联苯胺形成蓝色沉淀。
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• 3、普鲁士蓝法：细胞内、外铁与酸性亚铁 氰化钾作用，形成蓝色亚铁氰化铁沉淀。
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【结果】 细胞质内有蓝黑色颗粒者为阳性。
（－） 无颗粒沉着； （±） 颗粒细小 ，分布稀疏； （+） 颗粒较粗，局灶分布； （++） 颗粒粗大，分布较密，占胞质 1/2~2/3； （+++） 颗粒粗大，呈团块分布； （++++） 全部胞质均部满颗粒，可覆盖胞核。
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• 【临床意义】 • （1）粒系： • POX主要分布在粒细胞和单核细胞内，随
细胞化学染色
沧州医专医学技术系 侯振江
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• 细胞化学染色，是一种以形态为基础，结 合运用化学或生物化学技术对血细胞内各 种化学成分作定位、定性及半定量分析的 方法。
• 用于研究血细胞生理、病理和化学结构； • 临床上为某些血液病的诊断、鉴别诊断、
疗效观察、预后监测和发病机制的探讨， 提供重要依据。
着粒细胞成熟的程度而逐渐增强，中性分 叶核粒细胞为强阳性。
• 嗜酸性粒细胞阳性程度最强，其阳性颗粒 比中性粒细胞粗大，有折光。
• 碱性粒细胞为阴性。
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（2）单核细胞： 原始单核细胞为阴性反应， 幼稚单核细胞和成熟单核细胞呈弱阳性 反应，颗粒细小，弥散分布。
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（3）其他细胞 淋巴细胞、浆细胞、幼红细胞、组织细 胞、巨核细胞均呈阴性反应。 （4）血小板过氧化物酶 主要定位于幼稚型巨核细胞的核膜上，可 作为原巨核细胞的一种标志物，有助于 FAB M7的识别。
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• 血细胞化学染色的基本要求是在原位 显示细胞成分和结构，反应产物应是 有色沉淀物，具有一定的稳定性。
• 血细胞化学染色可显示糖原、脂类、 酶、蛋白质等。
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3
血细胞化学染色流程
• （一）固定 • 固定有物理法与化学法， • 物理法为干燥和火焰固定， • 化学法最常用的是甲醛、乙醇、
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• 【操作】 • 1. 取0.1%TMB乙醇溶液lml，加亚硝基铁氰
化钠饱和溶液10ml，溶液呈淡棕黄色。 • 2. 在新鲜干燥的血片上，加混合溶液0.5ml,
放置lmin后，再加稀过氧化氢溶液0.7ml， 染色6min 。 • 3. 瑞氏染液复染15～20min 。 • 4. 油镜镜检。
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• 【操作】 • 1．干燥血片或骨髓片在甲醛蒸气中固定。 • 2．自来水冲洗。 • 3．放人染色液中，37 ℃染色30~60min。 • 4．用70%乙醇脱色1~2min，水洗lmin。. • 5．瑞氏染液复染20~30min。
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【结果】
脂类呈黑色或棕黑色颗粒，定位于细胞浆中 （+） 颗粒很小，细小、稀疏，或胞质局部面积的