结核病的实验室诊断
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结核病的实验室诊断
华中科技大学同济医学院附属同济医院 孙自镛
World TB Day 2016: Unite to End Tuberculosis 2016年世界防治结核病日：联合起来消除结核病
内容
• 结核病流行现状 • 结核病实验室诊断技术 • 结核病实验诊断流程
结核病是世界范围内主要的传染病杀手
打印检 测报告
将反应盒放入检测模 块（手工操作完成）
Source: Boehme et al., NEJM 2010
获得检测结果时间：1小时45分钟
Xpert MTB/RIF检测肺结核灵敏度/特异度
Using the Xpert MTB/RIF assay to detect pulmonary and extrapulmonary tuberculosis and rifampicin resistance in adults and children. Expert Group Meeting Report 2013 WHO.
已取得成就： • 2000年以来，发病率年均下降1.5%，现在比2000年低18% • 1990-2015年，结核病死亡率下降了47% • 2000-2014年，估计结核病诊治，已挽救4300万人生命
挑战： • 2014年，960万（含100万儿童）罹患，150万（含14万名
儿童）死于结核病；48万人患耐多药结核病 • ＞95%死亡在中低收入国家，是15-44岁妇女五大死因之一 • 是艾滋病毒阳性患者的首要死因，2015年，三分之一艾滋
Xpert MTB/RIF检测肺外结核灵敏度/特异度
Xpert MTB/RIF检测儿童肺/肺外结核灵敏度/特异度
WHO对Xpert MTB/RIF 对结核检测的推荐意见
强烈建议 怀疑患有多重耐药结核或者结核合并HIV感染的成人 或儿童患者， Xpert MTB/RIF应优先于传统涂片镜 检、培养和药敏而作为初始诊断方法。
中国是结核病高负担国家（2015）
印度
中国
患病人数统计
对结核/疑似结核患者的关怀基本原则： 1.建立快速并准确的诊断方法； 2.使用有效的药物进行标准疗程的治疗； 3.监控疗效； 4.社会应承担重要的公共健康责任。
快速准确的诊断与有效及时的治疗，不仅是患者关怀的重点，也 是与结核相对应的公众健康的核心，是结核控制水平的基石。
怀疑患有结核性脑膜炎的患者中，Xpert MTB/RIF应优 先于传统涂片镜检、培养和药敏而作为初始诊断方法 对来源于患者的脑脊液标本进行检测。
WHO对Xpert Biblioteka BaiduTB/RIF 对结核检测的推荐意见
条件性推荐（适用于资源条件好的地区）： •怀疑为肺外结核的患者中，Xpert MTB/RIF可以用于检 测特殊的非呼吸道标本（如淋巴结和其它组织），替代 传统的涂片镜检、培养、和/或组织病理学检查。
分子灯塔
目标 混合
每个探针用不同的荧光染料标记，允许同时检测。
9
SPC
Rif—敏感界面的示例： 5个探针 & SPC显示荧光
Xpert MTB/RIF检测流程
痰标本与处理液 1：2混合
系统内自动完成
标本自动 清洗过滤
超声裂解 DNA提纯
DNA和PCR 反应试剂混合
半巢式实时荧 光定量核酸扩
增检测
吸取2ml处理样品 到反应盒
原理：
结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T 淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞 因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞抗原特
异性IFN-γ分泌可用于结核病或结核潜伏感染者的
诊断。
IGRA—现症感染的指标
由于效应T细胞存活时间很短（6周左右），而且具有特异性， 因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临 床症状
IGRA实验流程
0-4h：分离外周血单个核细胞，或全血 4-20h：体外诱导
20-24h：酶联免疫斑点实验
T-SPOT结果判断
空白对照
阴性结果
抗原 A ESAT-6
抗原 B CFP10
阳性对照 （PHA）
阳性结果
两种γ-干扰素释放实验：T-SPOT与QFT
Source: Enferm Infecc Microbiol Clin. 2010;28(4):245–252 TSPOT：敏感性高，较少受免疫抑制状态的影响
• 肺外结核难
细菌培养
X射线
• 特异性差 • 主观 • 肺外结核难
血清学检测
试剂灵敏度低； 不能区分既往感 染和发病病人
分子诊断
• 仪器设备 • 技术要求高 • 菌阴PTB检出低
• 肺外结核难 • GeneXpert
检测原理: Xpert MTB/RIF 分子灯塔法
PCR的目标是rpoB基因的81 bp区域： 5个探针结合到野生型，而不是突变体目标
阳性 阴性
总计
结核培养
阳性
阴性
18
3
7
41
25
44
总计 21 48
69
以结核培养作为标准，Xpert MTB/RIF检测肺泡灌洗液 结核分枝杆菌的灵敏度为72.0%，特异性为93.2%，阳性 预测值为85.7%，阴性预测值为85.4%。
结核分枝杆菌的免疫性
γ-干扰素释放实验
interferon gamma release assay，IGRA
International Standards for Tuberculosis Care, 3rd edition, 2014
常规诊断技术
• 假阴性(免 疫力状态)
• 假阳性 （BCG接种）
• 不能区分NTM • PTB近半阴性 • 肺外结核难
PPD
涂片
镜检
结核
诊断
• 耗时长
• 涂阴PTB检出低
病死亡由结核病引起
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/zh/
结核病流行现状
2012 2013 2014 2015
新发病例（万） 900 860 900 960
死亡人数（万） 140 130 100 150
终结结核病战略 WHO2014.5.世界卫生大会通过
•怀疑结核患者，涂片检测阴性， Xpert MTB/RIF应作为 补充检测手段。
70例疑似肺结核患者肺泡灌洗液结核分枝杆菌 检出率
方法
阳性
阴性
其他
涂片镜检
9
59
2份未做该项检查
Xpert MTB/RIF
21
48
1份检测失败
结核培养
25
45
/
检出率 15.5% 30.0% 35.7%
Xpert MTB/RIF
华中科技大学同济医学院附属同济医院 孙自镛
World TB Day 2016: Unite to End Tuberculosis 2016年世界防治结核病日：联合起来消除结核病
内容
• 结核病流行现状 • 结核病实验室诊断技术 • 结核病实验诊断流程
结核病是世界范围内主要的传染病杀手
打印检 测报告
将反应盒放入检测模 块（手工操作完成）
Source: Boehme et al., NEJM 2010
获得检测结果时间：1小时45分钟
Xpert MTB/RIF检测肺结核灵敏度/特异度
Using the Xpert MTB/RIF assay to detect pulmonary and extrapulmonary tuberculosis and rifampicin resistance in adults and children. Expert Group Meeting Report 2013 WHO.
已取得成就： • 2000年以来，发病率年均下降1.5%，现在比2000年低18% • 1990-2015年，结核病死亡率下降了47% • 2000-2014年，估计结核病诊治，已挽救4300万人生命
挑战： • 2014年，960万（含100万儿童）罹患，150万（含14万名
儿童）死于结核病；48万人患耐多药结核病 • ＞95%死亡在中低收入国家，是15-44岁妇女五大死因之一 • 是艾滋病毒阳性患者的首要死因，2015年，三分之一艾滋
Xpert MTB/RIF检测肺外结核灵敏度/特异度
Xpert MTB/RIF检测儿童肺/肺外结核灵敏度/特异度
WHO对Xpert MTB/RIF 对结核检测的推荐意见
强烈建议 怀疑患有多重耐药结核或者结核合并HIV感染的成人 或儿童患者， Xpert MTB/RIF应优先于传统涂片镜 检、培养和药敏而作为初始诊断方法。
中国是结核病高负担国家（2015）
印度
中国
患病人数统计
对结核/疑似结核患者的关怀基本原则： 1.建立快速并准确的诊断方法； 2.使用有效的药物进行标准疗程的治疗； 3.监控疗效； 4.社会应承担重要的公共健康责任。
快速准确的诊断与有效及时的治疗，不仅是患者关怀的重点，也 是与结核相对应的公众健康的核心，是结核控制水平的基石。
怀疑患有结核性脑膜炎的患者中，Xpert MTB/RIF应优 先于传统涂片镜检、培养和药敏而作为初始诊断方法 对来源于患者的脑脊液标本进行检测。
WHO对Xpert Biblioteka BaiduTB/RIF 对结核检测的推荐意见
条件性推荐（适用于资源条件好的地区）： •怀疑为肺外结核的患者中，Xpert MTB/RIF可以用于检 测特殊的非呼吸道标本（如淋巴结和其它组织），替代 传统的涂片镜检、培养、和/或组织病理学检查。
分子灯塔
目标 混合
每个探针用不同的荧光染料标记，允许同时检测。
9
SPC
Rif—敏感界面的示例： 5个探针 & SPC显示荧光
Xpert MTB/RIF检测流程
痰标本与处理液 1：2混合
系统内自动完成
标本自动 清洗过滤
超声裂解 DNA提纯
DNA和PCR 反应试剂混合
半巢式实时荧 光定量核酸扩
增检测
吸取2ml处理样品 到反应盒
原理：
结核感染者体内存在特异的效应T淋巴细胞，效应T 淋巴细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌多种细胞 因子（IFN-γ）。因此，检测效应T淋巴细胞抗原特
异性IFN-γ分泌可用于结核病或结核潜伏感染者的
诊断。
IGRA—现症感染的指标
由于效应T细胞存活时间很短（6周左右），而且具有特异性， 因此可以作为机体是否正处于被感染的指标，无论是否有临 床症状
IGRA实验流程
0-4h：分离外周血单个核细胞，或全血 4-20h：体外诱导
20-24h：酶联免疫斑点实验
T-SPOT结果判断
空白对照
阴性结果
抗原 A ESAT-6
抗原 B CFP10
阳性对照 （PHA）
阳性结果
两种γ-干扰素释放实验：T-SPOT与QFT
Source: Enferm Infecc Microbiol Clin. 2010;28(4):245–252 TSPOT：敏感性高，较少受免疫抑制状态的影响
• 肺外结核难
细菌培养
X射线
• 特异性差 • 主观 • 肺外结核难
血清学检测
试剂灵敏度低； 不能区分既往感 染和发病病人
分子诊断
• 仪器设备 • 技术要求高 • 菌阴PTB检出低
• 肺外结核难 • GeneXpert
检测原理: Xpert MTB/RIF 分子灯塔法
PCR的目标是rpoB基因的81 bp区域： 5个探针结合到野生型，而不是突变体目标
阳性 阴性
总计
结核培养
阳性
阴性
18
3
7
41
25
44
总计 21 48
69
以结核培养作为标准，Xpert MTB/RIF检测肺泡灌洗液 结核分枝杆菌的灵敏度为72.0%，特异性为93.2%，阳性 预测值为85.7%，阴性预测值为85.4%。
结核分枝杆菌的免疫性
γ-干扰素释放实验
interferon gamma release assay，IGRA
International Standards for Tuberculosis Care, 3rd edition, 2014
常规诊断技术
• 假阴性(免 疫力状态)
• 假阳性 （BCG接种）
• 不能区分NTM • PTB近半阴性 • 肺外结核难
PPD
涂片
镜检
结核
诊断
• 耗时长
• 涂阴PTB检出低
病死亡由结核病引起
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/zh/
结核病流行现状
2012 2013 2014 2015
新发病例（万） 900 860 900 960
死亡人数（万） 140 130 100 150
终结结核病战略 WHO2014.5.世界卫生大会通过
•怀疑结核患者，涂片检测阴性， Xpert MTB/RIF应作为 补充检测手段。
70例疑似肺结核患者肺泡灌洗液结核分枝杆菌 检出率
方法
阳性
阴性
其他
涂片镜检
9
59
2份未做该项检查
Xpert MTB/RIF
21
48
1份检测失败
结核培养
25
45
/
检出率 15.5% 30.0% 35.7%
Xpert MTB/RIF