偶联酶催化分光光度法测定黄嘌呤
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Abstract A novel technology to determine the concentration of Xanthine through the chromogenic reaction of Phenic Acid(PA), 4-Aminoantipyrine(AAP) and hydrogen peroxide (H2O2), which was produced via the oxidation of Xanthine catalyzed by Xanthine oxidase(XO), under the help of Horseradish Peroxidase(HRP) was proposed in this paper. The influences of temperature and pH on the system were investigated. The optimal conditions to determine the concentration of xanthine were obtained as follows: XO(0.32 U/mL), HRP(7.0U/mL), 4-Aminoantipyrine(1mmol/L), and Phenic Acid(6mmol/L) were dissolved in 100mmol/L Tris-HCl buffer solution (pH8.4), the reaction system was incubated in thermostat of 37℃ for 20min, the absorptive wave was 508nm. Under the conditions mentioned above, the linear range of calibration curve was between 0.2 mmol/L and 10.0mmol/L, the correlation coefficient was 0.9978, and the limit of detection was 0.05 mmol/L. All these show this technology is a potential alternative method to determine the concentration of Xanthine in areas like for example in laboratory or clinical diagnosis. Keywords Xanthine oxidase, Horseradish peroxidase, Activity determination, Spectrophotometry
果表明(表 1，表 2)，温度和 pH 对体系反应速率均有较大影响，两者具有相似的变化规律。随着温度的 升高，体系吸光度值先增大后减少，即显色物的生成量先增后减。在 37℃时，chromogen 的吸光度达到 最高值。在 pH8.0~8.4 范围内，随着 pH 的提高，显色吸光度增大。故确定该反应体系的最适反应温度 和 pH 分别为 37℃和 8.4。
2 结果与讨论
2.1 酶偶联测定法原理 黄嘌呤氧化酶在催化黄嘌呤氧化的反应过程中，每氧化 1mol 黄嘌呤，将消耗 1mol 分子氧和水，
产生 1mol 尿酸和 1mol 过氧化氢。H2O2 再经辣根过氧化物酶作用分解，可使 4-氨基安替比林与苯酚形 成亚醌类呈红色的化合物(chromogen)[6]。在可见光范围内测定该显色化合物的吸光度，根据 XO 酶活力
按 1.2 实验方法，分别反应 1、3、6、9、10、12、13、18、20、25、30 min 后终止，在 508nm 测
其吸光度值，结果见图 2。由图 2 可以看出，在 XAN 加入测定体系后，吸光度值随反应时间增加逐渐
增大。至 20min 后，吸光度值达到最大，用 Amax 表示。用一级动力学方程描述吸光度与时间之间的关
1.3 试样处理 Arthrobacter sp. XL 摇瓶发酵 46h 后，在 10000r/min 转速下离心 10min，分别收集发酵液和菌体。
将细胞重新悬浮于 50mmol/L Tris-HCL 缓冲液(pH7.5)中，采用 350W 超声处理 15min 破碎细胞壁；然 后以 8000rpm 转速离心 10min，取其上清液。同时测定发酵液和细胞破碎上清液中黄嘌呤的含量。
1.2 实验方法 配制反应显色液：4-氨基安替比林(4-Aminoantipyrine, AAP)，1mmol/L；苯酚（Phenic Acid，PA），
6mmol/L；Tris-HCL 缓冲液(pH8.6)，100mmol/L；叠氮钠，0.2g/L；辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)，7.0U/mL。
http://www.hxtb.org
《化学通报》在线预览版
偶联酶催化分光光度法测定黄嘌呤
李忠琴 1，2 邬敏辰 1 许小平 1，2# 王武 1
(#江南大学工业生物技术教育部重点实验室 无锡 214036； 福州大学化学化工学院 福州 350002)
摘 要 研究了以黄嘌呤氧化酶-辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应显色体系，测定不同样液中黄嘌呤浓度的的新方法。确定该测定方法 的最佳反应条件为：黄嘌呤氧化酶(XO) 0.32 U/mL，辣根过氧化物酶(HRP) 7.0U/mL，4-氨基安替比林(AAP) 1mmol/L，苯酚(PA) 6mmol/L 溶于 100mmol/L Tris-HCL 缓冲液(pH8.4)；反应温度为 37℃，保温时间为 20min；检测波长为 508nm。本方法测定黄嘌呤浓度的线性范围为 0.2~10.0mmol/L，线性关系良好(R=0.9978)，检测限为 0.05 mmol/L。该方法操作简单易行，测定结果准确可靠。可有效应用于普通实验室和常 规临床血液生化检测。
系曲线得到图 3，结果显示该体系反应很好地符合一级反应，动力学方程为：ln(Amax–At)=-0.1724t–1.2326，
相关系数 R=0.9973。虽然体系中包含两步酶反应，但是由于 HRP 的催化效率极高，H2O2 一经生成立刻 分解出初生态氧，而且 H2O2 氧化苯酚反应比黄嘌呤的氧化反应要快得多，故该体系的综合反应是准一
2.2 吸收光谱 按实验方法依次加入除 XAN 的所有试剂，以 Tris-HCL 缓冲液为参比，从 300~700nm 扫描该体系
的可见吸收光谱。如图 1 中曲线 1 所示，仅在 300nm 有 1 个强吸收峰。加入 XAN 反应后再扫描体系的 吸收光谱，从曲线 2 可看出体系反应产物在可见光区 450~650nm 之间只有 1 个吸收峰，选择吸收峰值 最高的波长 508nm 作为 XAN 含量检测波长，可降低干扰，提高检测灵敏度。
T=37℃，pH8.6
图 3 检测反应体系的动力学曲线 Fig.3 Kinetic curve of the XO-HRP-PA-AAP-XAN reaction system
T=37℃，pH8.6
2.4 显色反应体系的温度和 pH 在 XO 和 HRP 酶促反应的稳定 pH 和温度范围内，考察不同温度和 pH 对显色反应的影响。实验结
2
图 1 黄嘌呤检测反应体系的可见光扫描图谱 Fig.1 Visable absorption spectra for catalyzing reaction system of quantitifying xanthine
1. 体系不添加黄嘌呤； 2. 体系添加黄嘌呤
2.3 酶催化反应动力学性质
2.5 测定方法的线性范围和检测限 配制不同浓度的黄嘌呤溶液加入测定体系，以反应终止后测得的吸光度值 Amax 为横坐标，XAN 浓
度为纵坐标，绘制一条标准曲线(见图 4)。结果表明本体系中测定 XAN 含量的线性范围在 0.2~10.0mmol/ Ｌ之间，线性回归方程为：CXAN= 0.0423A508–0.2237，其相关系数 R=0.9978，检测限为 0.05mmol/L。
1 实验部分
1.1 主要试剂及仪器
工业生物技术教育部重点实验室基金( KLIB-KF200502)和福建省自然科学基金(Ｃ0410006)资助项目. 李忠琴，女，博士生，讲师，现从事药物分析及氧化酶分子研究。 *许小平，教授，博导，xu@fzu.edu.cn。
紫外-可见分光光度仪(日立 U-300 型，日本)，恒温水浴锅(H.H.S 11-2R，上海医疗器械五厂)，高速 冷冻离心机(Hitachi CR22G 型，日本)。黄嘌呤氧化酶(0.67U/mg，Sigma)，辣根过氧化物酶(250U/mg， 上海双向西巴斯科技有限公司)，4-氨基安替比林(AR，华东师范大学化工厂)，苯酚(AR，国药集团上海 化学试剂公司)，黄嘌呤(99%，Fluka)，Tris(BR，国药集团化学试剂有限公司)，HCL(盐酸，AR，国药 集团上海化学试剂公司)，叠氮钠(BR，厦门新隆达试剂有限公司)。
即可推算出体系中黄嘌呤的含量。总反应式如下：
O
ห้องสมุดไป่ตู้
H
N
O
N
O
NH
XO
+ O2 + H2O
+ H2O2
N H
N
O
H
HN
NH
O
Xanthine
Uric acid
H2O2 + CH3
N N
O+
CH3
NH2
HRP OH
CH3
N N
O
CH3
N
+ H2 O
O
AAP
PA
Chromogen
AAP----4-Aminoantipyrine; PA---- Phenic Acid
在具塞试管中，依次加入 3mL 反应显色液，100μL 黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XO)酶液(终 浓度为 0.32U/mL)，及一定量的黄嘌呤(Xanthine, XAN)溶液。混匀在 37℃保温 20min，然后煮沸 3min 终止反应。以不加 XAN 的反应体系作为参比，测定其可见吸收光谱。
黄嘌呤是核酸的代谢产物，其氧化产物尿酸和氧自由基具有重要的生理及病理功能。黄嘌呤氧化酶 是嘌呤代谢途径中的关键酶，催化黄嘌呤氧化形成尿酸和过氧化氢。目前黄嘌呤浓度测定主要是选用高 效液相色谱法(HPLC)法[1]，易受到核酸类化合物的干扰。本文根据辣根过氧化物酶(HRP) [2~4]与黄嘌呤 氧化酶(XO) [5]的催化特性，提出了两者相偶联酶促反应，分光光度法检测黄嘌呤的新方法。采用 XO-HRP-PA-AAP-XAN 反应新体系生成氧化型色素，定量检测细胞内的黄嘌呤。该方法简便易行，结 果准确可靠。可应用于临床常规检测的自动生化检测仪及普通实验室的可见分光光度仪进行测定。
关键词 黄嘌呤氧化酶 辣根过氧化物酶 酶活测定 分光光度
Catalytic Spectrophotometric quantitation for Xanthine By Conjugating Xanthine oxidase with Horseradish Peroxidase
Li Zhong-qin1,2 Wu Mingchen1 Xu Xiao-ping1,2# Wang Wu1 (#The Key Laboratory of Industry Biotechnology, Ministry of Education, Southern Yangtze University, Wuxi 214036; College of Chemistry and Chemical Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350002)
级反应。
0
4
8
12
16
2
0
0.3 -1
A 506
ln(A −A ) max t
0.2
-2
-3
0.1 -4
0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 t/min
-5
t/min
图 2 检测反应体系随时间吸收变化曲线 Fig.2 Curve of absorbance versus time in reaction system
果表明(表 1，表 2)，温度和 pH 对体系反应速率均有较大影响，两者具有相似的变化规律。随着温度的 升高，体系吸光度值先增大后减少，即显色物的生成量先增后减。在 37℃时，chromogen 的吸光度达到 最高值。在 pH8.0~8.4 范围内，随着 pH 的提高，显色吸光度增大。故确定该反应体系的最适反应温度 和 pH 分别为 37℃和 8.4。
2 结果与讨论
2.1 酶偶联测定法原理 黄嘌呤氧化酶在催化黄嘌呤氧化的反应过程中，每氧化 1mol 黄嘌呤，将消耗 1mol 分子氧和水，
产生 1mol 尿酸和 1mol 过氧化氢。H2O2 再经辣根过氧化物酶作用分解，可使 4-氨基安替比林与苯酚形 成亚醌类呈红色的化合物(chromogen)[6]。在可见光范围内测定该显色化合物的吸光度，根据 XO 酶活力
按 1.2 实验方法，分别反应 1、3、6、9、10、12、13、18、20、25、30 min 后终止，在 508nm 测
其吸光度值，结果见图 2。由图 2 可以看出，在 XAN 加入测定体系后，吸光度值随反应时间增加逐渐
增大。至 20min 后，吸光度值达到最大，用 Amax 表示。用一级动力学方程描述吸光度与时间之间的关
1.3 试样处理 Arthrobacter sp. XL 摇瓶发酵 46h 后，在 10000r/min 转速下离心 10min，分别收集发酵液和菌体。
将细胞重新悬浮于 50mmol/L Tris-HCL 缓冲液(pH7.5)中，采用 350W 超声处理 15min 破碎细胞壁；然 后以 8000rpm 转速离心 10min，取其上清液。同时测定发酵液和细胞破碎上清液中黄嘌呤的含量。
1.2 实验方法 配制反应显色液：4-氨基安替比林(4-Aminoantipyrine, AAP)，1mmol/L；苯酚（Phenic Acid，PA），
6mmol/L；Tris-HCL 缓冲液(pH8.6)，100mmol/L；叠氮钠，0.2g/L；辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)，7.0U/mL。
http://www.hxtb.org
《化学通报》在线预览版
偶联酶催化分光光度法测定黄嘌呤
李忠琴 1，2 邬敏辰 1 许小平 1，2# 王武 1
(#江南大学工业生物技术教育部重点实验室 无锡 214036； 福州大学化学化工学院 福州 350002)
摘 要 研究了以黄嘌呤氧化酶-辣根过氧化物酶-苯酚-4-氨基安替比林反应显色体系，测定不同样液中黄嘌呤浓度的的新方法。确定该测定方法 的最佳反应条件为：黄嘌呤氧化酶(XO) 0.32 U/mL，辣根过氧化物酶(HRP) 7.0U/mL，4-氨基安替比林(AAP) 1mmol/L，苯酚(PA) 6mmol/L 溶于 100mmol/L Tris-HCL 缓冲液(pH8.4)；反应温度为 37℃，保温时间为 20min；检测波长为 508nm。本方法测定黄嘌呤浓度的线性范围为 0.2~10.0mmol/L，线性关系良好(R=0.9978)，检测限为 0.05 mmol/L。该方法操作简单易行，测定结果准确可靠。可有效应用于普通实验室和常 规临床血液生化检测。
系曲线得到图 3，结果显示该体系反应很好地符合一级反应，动力学方程为：ln(Amax–At)=-0.1724t–1.2326，
相关系数 R=0.9973。虽然体系中包含两步酶反应，但是由于 HRP 的催化效率极高，H2O2 一经生成立刻 分解出初生态氧，而且 H2O2 氧化苯酚反应比黄嘌呤的氧化反应要快得多，故该体系的综合反应是准一
2.2 吸收光谱 按实验方法依次加入除 XAN 的所有试剂，以 Tris-HCL 缓冲液为参比，从 300~700nm 扫描该体系
的可见吸收光谱。如图 1 中曲线 1 所示，仅在 300nm 有 1 个强吸收峰。加入 XAN 反应后再扫描体系的 吸收光谱，从曲线 2 可看出体系反应产物在可见光区 450~650nm 之间只有 1 个吸收峰，选择吸收峰值 最高的波长 508nm 作为 XAN 含量检测波长，可降低干扰，提高检测灵敏度。
T=37℃，pH8.6
图 3 检测反应体系的动力学曲线 Fig.3 Kinetic curve of the XO-HRP-PA-AAP-XAN reaction system
T=37℃，pH8.6
2.4 显色反应体系的温度和 pH 在 XO 和 HRP 酶促反应的稳定 pH 和温度范围内，考察不同温度和 pH 对显色反应的影响。实验结
2
图 1 黄嘌呤检测反应体系的可见光扫描图谱 Fig.1 Visable absorption spectra for catalyzing reaction system of quantitifying xanthine
1. 体系不添加黄嘌呤； 2. 体系添加黄嘌呤
2.3 酶催化反应动力学性质
2.5 测定方法的线性范围和检测限 配制不同浓度的黄嘌呤溶液加入测定体系，以反应终止后测得的吸光度值 Amax 为横坐标，XAN 浓
度为纵坐标，绘制一条标准曲线(见图 4)。结果表明本体系中测定 XAN 含量的线性范围在 0.2~10.0mmol/ Ｌ之间，线性回归方程为：CXAN= 0.0423A508–0.2237，其相关系数 R=0.9978，检测限为 0.05mmol/L。
1 实验部分
1.1 主要试剂及仪器
工业生物技术教育部重点实验室基金( KLIB-KF200502)和福建省自然科学基金(Ｃ0410006)资助项目. 李忠琴，女，博士生，讲师，现从事药物分析及氧化酶分子研究。 *许小平，教授，博导，xu@fzu.edu.cn。
紫外-可见分光光度仪(日立 U-300 型，日本)，恒温水浴锅(H.H.S 11-2R，上海医疗器械五厂)，高速 冷冻离心机(Hitachi CR22G 型，日本)。黄嘌呤氧化酶(0.67U/mg，Sigma)，辣根过氧化物酶(250U/mg， 上海双向西巴斯科技有限公司)，4-氨基安替比林(AR，华东师范大学化工厂)，苯酚(AR，国药集团上海 化学试剂公司)，黄嘌呤(99%，Fluka)，Tris(BR，国药集团化学试剂有限公司)，HCL(盐酸，AR，国药 集团上海化学试剂公司)，叠氮钠(BR，厦门新隆达试剂有限公司)。
即可推算出体系中黄嘌呤的含量。总反应式如下：
O
ห้องสมุดไป่ตู้
H
N
O
N
O
NH
XO
+ O2 + H2O
+ H2O2
N H
N
O
H
HN
NH
O
Xanthine
Uric acid
H2O2 + CH3
N N
O+
CH3
NH2
HRP OH
CH3
N N
O
CH3
N
+ H2 O
O
AAP
PA
Chromogen
AAP----4-Aminoantipyrine; PA---- Phenic Acid
在具塞试管中，依次加入 3mL 反应显色液，100μL 黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase，XO)酶液(终 浓度为 0.32U/mL)，及一定量的黄嘌呤(Xanthine, XAN)溶液。混匀在 37℃保温 20min，然后煮沸 3min 终止反应。以不加 XAN 的反应体系作为参比，测定其可见吸收光谱。
黄嘌呤是核酸的代谢产物，其氧化产物尿酸和氧自由基具有重要的生理及病理功能。黄嘌呤氧化酶 是嘌呤代谢途径中的关键酶，催化黄嘌呤氧化形成尿酸和过氧化氢。目前黄嘌呤浓度测定主要是选用高 效液相色谱法(HPLC)法[1]，易受到核酸类化合物的干扰。本文根据辣根过氧化物酶(HRP) [2~4]与黄嘌呤 氧化酶(XO) [5]的催化特性，提出了两者相偶联酶促反应，分光光度法检测黄嘌呤的新方法。采用 XO-HRP-PA-AAP-XAN 反应新体系生成氧化型色素，定量检测细胞内的黄嘌呤。该方法简便易行，结 果准确可靠。可应用于临床常规检测的自动生化检测仪及普通实验室的可见分光光度仪进行测定。
关键词 黄嘌呤氧化酶 辣根过氧化物酶 酶活测定 分光光度
Catalytic Spectrophotometric quantitation for Xanthine By Conjugating Xanthine oxidase with Horseradish Peroxidase
Li Zhong-qin1,2 Wu Mingchen1 Xu Xiao-ping1,2# Wang Wu1 (#The Key Laboratory of Industry Biotechnology, Ministry of Education, Southern Yangtze University, Wuxi 214036; College of Chemistry and Chemical Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350002)
级反应。
0
4
8
12
16
2
0
0.3 -1
A 506
ln(A −A ) max t
0.2
-2
-3
0.1 -4
0.0 0 5 10 15 20 25 30 35 t/min
-5
t/min
图 2 检测反应体系随时间吸收变化曲线 Fig.2 Curve of absorbance versus time in reaction system