高直链淀粉消化前后结构变化与抗性淀粉结构剖析_周中凯
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
B C
DΒιβλιοθήκη Baidu
a：来源于原淀粉；b：来源于干热处理淀粉；c：来源于湿 热处理淀粉
Changes of high amylose starch structure before and after digestion and resistant starch structural analysis
ZHOU Zhong-kai， ZHANG Yan， CHEN Xiao-shan， ZHENG Pai-yun， YANG Yan （College of Food Engineering and Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China） Abstract： Three high amylose starches with different structures were obtained by different heating processes， and then were digested through a simulating human small intestine digestion model. The changes in molecular structure and morphology before and after digestion were analyzed using SEM、 XRD、 SAXS and HPLC. The results showed that there are difference in the internal packing of crystalline and amorphous regions and the space size. The similarity in the structure of the three RS is that they all have large proportion of low molecules weight（MW）amylose with minor proportion of molecules with high and medium MW. UV/visible scanning spectrum and de–branching treatment revealed that low MW amylose has very low branching degree compared to the anylose molecules of medium MW. Key words： starch； resistant starch； digestion； molecular structure 中图分类号： TS235.1 文献标识码： A 文章编号： 1008― 9578 （2013） 12― 0014― 05
UV/ 可见光分光光度计测定吸光强度， 每 1 nm 读数 一次， 扫描范围 350~800 nm。 1.2.7 X 射线衍射 （XRD） 分析淀粉颗粒结晶结构 用 Panalytical X’ Pert 蛋 白 质 衍 射 仪 测 定 淀 粉 X 射线衍射。仪器配有铜制的精细调焦管、 光束发 散狭缝、 电子束散射狭缝 （两者均设定在 0.125° ）和 X’ celerator 高速检测器。衍射角 （2θ） 的旋转范围为 2° ~40° ， 扫描速度为 1.2° /min， 检测步长 0.033 2° ， 计数间隔为每点 800 s。 1.2.8 小角 X 射线散射 （SAXS） 分析淀粉精细结构 利用 Bruker NanoStar SAXS 测量仪测定小角 X 射线衍射。采用铜质的旋转阳极 （0.03mm 丝状体） ， 操作条件为 45 kV 和 110 mA， 配备交叉耦合 Göbel 反光镜， 产生的 Cu Kα 辐射波长为 1.54 Å。SAXS 照 相仪配有 Hi–star 二维检测器 （有效像素尺寸为 100 μm） 。样品与检测器距离选为 650 mm， 可使 q 向量范 –1 –1 围产生于 0.02 Å 到 0.3 Å 之间。将样品吸入 2 mm 毛细管中， 镜片和样品室处于真空条件以减少空气 散射。 1.2.9 FTIR 分析淀粉结构 淀 粉 样 品 及 抗 性 淀 粉 的 ATR–FTIR 分 析 参 考 Sevenou 等〔16〕方法进行， 并作适当修改。扫描光谱范 –1 围为 3 600~600 cm ， 分辨率为 4 cm–1， 傅里叶变换 红外光谱， 采用 DTGS 检测器， 衰减全反射 （ATR） 附 TM 件为 MIRacle 晶片和数显高压钳。样品直接加载到 晶片上并在上述的范围内扫描， 选取 1 200~800 cm–1 区域谱图， 利用 Varian Resolutions Pro 软件进行基线 修订并处理得到最终谱图。 2 结果与讨论 2.1 RS 形态观察
收稿日期： 2013–09–18 ， 男， 博士， 教授， 研究方向： 谷物科学与营养。 作者简介： 周中凯 （1964~ ）
0413ls12-09
2013 年第 26 卷第 12 期
粮食与油脂
15
冷冻干燥仪：Millrock Technology公司；JSM-6610 Scanning Electron Microscope 扫描电子显微镜： JEOL 公司； LC1150 排阻液相色谱： GBC Instruments 公司； cary 1E UV/ 可见光分光光度计： Varian 公司； X'Pert PRO MRD XL X 射线衍射仪： PANalytical B.V. 公司； NanoStar 小角 X 射线散射仪： Bruker Biosciences Pty Ltd.， 公司。 1.2 方法 1.2.1 样品制备 高直链玉米淀粉蒸煮处理： 将淀粉与蒸馏水混合 制成水分含量 60% 淀粉乳， 置于高压锅中于 121 ℃处 理 20 min， 冷却后重复高压处理两次， 取出后冷却， 冷 冻干燥， 干燥后固体经粉碎机粉碎后过 0.5 mm 筛网， 密封， 备用。 高直链玉米淀粉干热处理： 将淀粉先在 50 ℃干燥 箱中脱水 （总约 12 h） ， 然后将烘箱温度升至 135~140 ℃并维持 3.0 h， 将样品取出， 冷却， 密封， 备用。 1.2.2 高直链玉米淀粉体外代谢试验〔15〕 将原淀粉及经过不同热处理淀粉进行体外消化 试验， 收集消化残渣并进行相关结构与形态分析。 1.2.3 扫描电子显微镜 （SEM） 观察形态 将消化前后淀粉样品均匀洒在贴有双面胶样品 面盘上， 用 Hitachi 1B–3 离子涂布器喷金固定， 然后利 用扫描电子显微镜观察淀粉与 RS 形态。每种淀粉样 品至少记录三次颗粒形态。 1.2.4 排阻液相色谱分析淀粉分子分布 将约含 30 mg 淀粉样品加入 25 ml 玻璃离心管 中， 然后加入 8 ml 二甲亚砜 （DMSO）和水的混合液 （DMSO 与 H2O 的体积比为 90∶10） 。 每只离心管封盖， 置于沸水浴中加热 30 min， 冷却后加入 20 ml 无水乙 醇， 封盖后均匀震荡 3 min， 静置 5 min 后于 3 000 rpm 条件下离心， 弃去上清液， 加入 20 ml 无水乙醇再次震 荡离心。再用乙醇洗涤， 重复该操作 2 次， 得淀粉沉 淀物。 取 20 mg 该 淀 粉 沉 淀 物， 用 0.5 mol/L 的 NaOH 溶液溶解该淀粉， 震荡混合 10 s。向所得溶液加入 0.5 ml 0.05 mol/L 的乙酸钠缓冲液 （pH 4.0） 进行中和， 然 后加入离子交换树脂 （美国） ， 并于 50 ℃水浴锅中保持 1.5 h。于 10 000 rpm 离心 10 min 后， 取上清液进行 HPLC 分析。 1.2.5 切枝酶处理 取上述制备淀粉溶液 1.2 ml， 加入 10 μl 异淀粉酶： 于 50 ℃水浴锅中保持 3.5 h， 沸水浴灭酶 10 min， 离子 交换树脂处理， 离心， 超滤膜过滤， 取清夜进行 HPLC 分析。 1.2.6 直链淀粉—碘络合物紫外 / 可见扫描光图谱 取上述制备淀粉沉淀物， 加入 0.5 ml 的蒸馏水快 （I21.27 g/mL， 速震荡， 然后迅速加入 25 μl I2–KI 溶液 KI 3 g/mL） 并快速摇匀， 用蒸馏水调整颜色强度。用
0413ls12-09
14
粮食与油脂
2013 年第 26 卷第 12 期
高直链淀粉消化前后结构变化与抗性淀粉结构剖析
周中凯， 张 岩， 陈晓姗， 郑排云， 杨 艳 天津 300457） （天津科技大学食品工程与生物技术学院， 该研究通过不同加热方式获得三种结构不同高直链淀粉， 然后进行模拟人体小肠消化实 摘 要： 验， 分别采用 SEM、 XRD、 SAXS 和 HPLC 等分析手段对其消化前后的分子结构及形态变化进行 分析。结果显示三种抗性淀粉 （RS） 内部结晶区与无定型区交错堆叠的方式不同。三种 RS 结构 共同点是均含有高比例低分子量的直链淀粉及少量高分子量和中等分子量淀粉分子。UV/ 可见 光扫描与切枝酶处理实验揭示了该低分子量直链淀粉具有分枝程度极低结构特征。 关键词： 淀粉； 抗性淀粉； 消化； 分子结构
淀粉是人类饮食中最主要能量来源之一， 其由直 链淀粉和支链淀粉两种分子组成。根据天然淀粉 X– 射线衍射图像不同， 淀粉分为 A 型、 B 型和 C 型三种， 其中 C 型是 A、 B 型两种晶型混合体， 此外淀粉颗粒 还存在少量 V 型结构， 是由直链淀粉和脂肪酸、 乳化 〔1–10〕 剂等络合而成 。不同来源淀粉在分子结构、 晶型 及与水结合形式不同， 最终影响到其消化速率。根据 这一特性又将淀粉分为快速消化淀粉、 慢速消化淀粉 和抗性淀粉 （RS） 。这三类淀粉各有其独特功能， 第 一类 （快速消化淀粉） 能够快速补充人体所需的能量； 第二类 （慢速消化淀粉） 对有效控制葡萄糖释放有帮 助， 有助于开发功能性食品如低血糖指数食品等； 第 三类 （RS） 是不能被小肠中的淀粉酶水解， 即能脱离 小肠， 而成功到达大肠， 从而被大肠道中微生物所利 用。目前被普遍接受对 RS 的定义是 1993 年， 世界粮 农组织 （FAO） 根据 Englyst 和欧洲抗性淀粉研究协作 网 （EURESTA）的建议， 将 RS 定义为： “健康者小肠 中不吸收的淀粉及其降解产物总和” 。RS 消化特征和 其在人体大肠中功效与膳食纤维有共同之处， 仍被认 为是膳食纤维中的一种。RS 被大肠发酵利用后， 生成
短链脂肪酸， 这些短链脂肪酸对维持肠道健康非常有 益。短链脂肪酸中丁酸是肠道细胞重要能量剂， 也是 预防和杀死癌细胞重要化合物〔11–13〕 ， 摄入一定量抗性 淀粉对改善糖代谢有一定帮助。 人 们 对 RS 的 结 构 有 了 一 定 的 研 究， 也已证实 淀 粉 来 源 不 同， RS 结 构 不 同， 其生理功能也不相 同〔14〕 。本文在以往研究基础上， 通过体内代谢模型， 利用扫描电镜 （SEM） 、 HPLC、 X 射线 （X–ray）和 α 角 X 射线散射 （SAXS）等分析手段， 进一步从不同 侧面研究 RS 精细结构， 揭示淀粉在人体小肠中消化 行为。 1 材料和方法 1.1 试剂与仪器 因为 RS 含量随直链淀粉含量增高而增加， 因此 本文以高直链玉米淀粉为原料： 澳大利亚国民淀粉公 司。对照组淀粉为玉米淀粉： 美国 sigma 公司。 淀 粉 体 外 消 化 试 验 采 用 的 酶 均 来 源 于 SigmaAldrich；异淀粉酶：澳大利亚 Megazyme 公司；样品 制备及色谱分析测定所需试剂均为分析纯或色谱级。 EC1X2 高压锅： ASC Process Systems 公司 ； BT85
DΒιβλιοθήκη Baidu
a：来源于原淀粉；b：来源于干热处理淀粉；c：来源于湿 热处理淀粉
Changes of high amylose starch structure before and after digestion and resistant starch structural analysis
ZHOU Zhong-kai， ZHANG Yan， CHEN Xiao-shan， ZHENG Pai-yun， YANG Yan （College of Food Engineering and Biotechnology， Tianjin University of Science and Technology， Tianjin 300457， China） Abstract： Three high amylose starches with different structures were obtained by different heating processes， and then were digested through a simulating human small intestine digestion model. The changes in molecular structure and morphology before and after digestion were analyzed using SEM、 XRD、 SAXS and HPLC. The results showed that there are difference in the internal packing of crystalline and amorphous regions and the space size. The similarity in the structure of the three RS is that they all have large proportion of low molecules weight（MW）amylose with minor proportion of molecules with high and medium MW. UV/visible scanning spectrum and de–branching treatment revealed that low MW amylose has very low branching degree compared to the anylose molecules of medium MW. Key words： starch； resistant starch； digestion； molecular structure 中图分类号： TS235.1 文献标识码： A 文章编号： 1008― 9578 （2013） 12― 0014― 05
UV/ 可见光分光光度计测定吸光强度， 每 1 nm 读数 一次， 扫描范围 350~800 nm。 1.2.7 X 射线衍射 （XRD） 分析淀粉颗粒结晶结构 用 Panalytical X’ Pert 蛋 白 质 衍 射 仪 测 定 淀 粉 X 射线衍射。仪器配有铜制的精细调焦管、 光束发 散狭缝、 电子束散射狭缝 （两者均设定在 0.125° ）和 X’ celerator 高速检测器。衍射角 （2θ） 的旋转范围为 2° ~40° ， 扫描速度为 1.2° /min， 检测步长 0.033 2° ， 计数间隔为每点 800 s。 1.2.8 小角 X 射线散射 （SAXS） 分析淀粉精细结构 利用 Bruker NanoStar SAXS 测量仪测定小角 X 射线衍射。采用铜质的旋转阳极 （0.03mm 丝状体） ， 操作条件为 45 kV 和 110 mA， 配备交叉耦合 Göbel 反光镜， 产生的 Cu Kα 辐射波长为 1.54 Å。SAXS 照 相仪配有 Hi–star 二维检测器 （有效像素尺寸为 100 μm） 。样品与检测器距离选为 650 mm， 可使 q 向量范 –1 –1 围产生于 0.02 Å 到 0.3 Å 之间。将样品吸入 2 mm 毛细管中， 镜片和样品室处于真空条件以减少空气 散射。 1.2.9 FTIR 分析淀粉结构 淀 粉 样 品 及 抗 性 淀 粉 的 ATR–FTIR 分 析 参 考 Sevenou 等〔16〕方法进行， 并作适当修改。扫描光谱范 –1 围为 3 600~600 cm ， 分辨率为 4 cm–1， 傅里叶变换 红外光谱， 采用 DTGS 检测器， 衰减全反射 （ATR） 附 TM 件为 MIRacle 晶片和数显高压钳。样品直接加载到 晶片上并在上述的范围内扫描， 选取 1 200~800 cm–1 区域谱图， 利用 Varian Resolutions Pro 软件进行基线 修订并处理得到最终谱图。 2 结果与讨论 2.1 RS 形态观察
收稿日期： 2013–09–18 ， 男， 博士， 教授， 研究方向： 谷物科学与营养。 作者简介： 周中凯 （1964~ ）
0413ls12-09
2013 年第 26 卷第 12 期
粮食与油脂
15
冷冻干燥仪：Millrock Technology公司；JSM-6610 Scanning Electron Microscope 扫描电子显微镜： JEOL 公司； LC1150 排阻液相色谱： GBC Instruments 公司； cary 1E UV/ 可见光分光光度计： Varian 公司； X'Pert PRO MRD XL X 射线衍射仪： PANalytical B.V. 公司； NanoStar 小角 X 射线散射仪： Bruker Biosciences Pty Ltd.， 公司。 1.2 方法 1.2.1 样品制备 高直链玉米淀粉蒸煮处理： 将淀粉与蒸馏水混合 制成水分含量 60% 淀粉乳， 置于高压锅中于 121 ℃处 理 20 min， 冷却后重复高压处理两次， 取出后冷却， 冷 冻干燥， 干燥后固体经粉碎机粉碎后过 0.5 mm 筛网， 密封， 备用。 高直链玉米淀粉干热处理： 将淀粉先在 50 ℃干燥 箱中脱水 （总约 12 h） ， 然后将烘箱温度升至 135~140 ℃并维持 3.0 h， 将样品取出， 冷却， 密封， 备用。 1.2.2 高直链玉米淀粉体外代谢试验〔15〕 将原淀粉及经过不同热处理淀粉进行体外消化 试验， 收集消化残渣并进行相关结构与形态分析。 1.2.3 扫描电子显微镜 （SEM） 观察形态 将消化前后淀粉样品均匀洒在贴有双面胶样品 面盘上， 用 Hitachi 1B–3 离子涂布器喷金固定， 然后利 用扫描电子显微镜观察淀粉与 RS 形态。每种淀粉样 品至少记录三次颗粒形态。 1.2.4 排阻液相色谱分析淀粉分子分布 将约含 30 mg 淀粉样品加入 25 ml 玻璃离心管 中， 然后加入 8 ml 二甲亚砜 （DMSO）和水的混合液 （DMSO 与 H2O 的体积比为 90∶10） 。 每只离心管封盖， 置于沸水浴中加热 30 min， 冷却后加入 20 ml 无水乙 醇， 封盖后均匀震荡 3 min， 静置 5 min 后于 3 000 rpm 条件下离心， 弃去上清液， 加入 20 ml 无水乙醇再次震 荡离心。再用乙醇洗涤， 重复该操作 2 次， 得淀粉沉 淀物。 取 20 mg 该 淀 粉 沉 淀 物， 用 0.5 mol/L 的 NaOH 溶液溶解该淀粉， 震荡混合 10 s。向所得溶液加入 0.5 ml 0.05 mol/L 的乙酸钠缓冲液 （pH 4.0） 进行中和， 然 后加入离子交换树脂 （美国） ， 并于 50 ℃水浴锅中保持 1.5 h。于 10 000 rpm 离心 10 min 后， 取上清液进行 HPLC 分析。 1.2.5 切枝酶处理 取上述制备淀粉溶液 1.2 ml， 加入 10 μl 异淀粉酶： 于 50 ℃水浴锅中保持 3.5 h， 沸水浴灭酶 10 min， 离子 交换树脂处理， 离心， 超滤膜过滤， 取清夜进行 HPLC 分析。 1.2.6 直链淀粉—碘络合物紫外 / 可见扫描光图谱 取上述制备淀粉沉淀物， 加入 0.5 ml 的蒸馏水快 （I21.27 g/mL， 速震荡， 然后迅速加入 25 μl I2–KI 溶液 KI 3 g/mL） 并快速摇匀， 用蒸馏水调整颜色强度。用
0413ls12-09
14
粮食与油脂
2013 年第 26 卷第 12 期
高直链淀粉消化前后结构变化与抗性淀粉结构剖析
周中凯， 张 岩， 陈晓姗， 郑排云， 杨 艳 天津 300457） （天津科技大学食品工程与生物技术学院， 该研究通过不同加热方式获得三种结构不同高直链淀粉， 然后进行模拟人体小肠消化实 摘 要： 验， 分别采用 SEM、 XRD、 SAXS 和 HPLC 等分析手段对其消化前后的分子结构及形态变化进行 分析。结果显示三种抗性淀粉 （RS） 内部结晶区与无定型区交错堆叠的方式不同。三种 RS 结构 共同点是均含有高比例低分子量的直链淀粉及少量高分子量和中等分子量淀粉分子。UV/ 可见 光扫描与切枝酶处理实验揭示了该低分子量直链淀粉具有分枝程度极低结构特征。 关键词： 淀粉； 抗性淀粉； 消化； 分子结构
淀粉是人类饮食中最主要能量来源之一， 其由直 链淀粉和支链淀粉两种分子组成。根据天然淀粉 X– 射线衍射图像不同， 淀粉分为 A 型、 B 型和 C 型三种， 其中 C 型是 A、 B 型两种晶型混合体， 此外淀粉颗粒 还存在少量 V 型结构， 是由直链淀粉和脂肪酸、 乳化 〔1–10〕 剂等络合而成 。不同来源淀粉在分子结构、 晶型 及与水结合形式不同， 最终影响到其消化速率。根据 这一特性又将淀粉分为快速消化淀粉、 慢速消化淀粉 和抗性淀粉 （RS） 。这三类淀粉各有其独特功能， 第 一类 （快速消化淀粉） 能够快速补充人体所需的能量； 第二类 （慢速消化淀粉） 对有效控制葡萄糖释放有帮 助， 有助于开发功能性食品如低血糖指数食品等； 第 三类 （RS） 是不能被小肠中的淀粉酶水解， 即能脱离 小肠， 而成功到达大肠， 从而被大肠道中微生物所利 用。目前被普遍接受对 RS 的定义是 1993 年， 世界粮 农组织 （FAO） 根据 Englyst 和欧洲抗性淀粉研究协作 网 （EURESTA）的建议， 将 RS 定义为： “健康者小肠 中不吸收的淀粉及其降解产物总和” 。RS 消化特征和 其在人体大肠中功效与膳食纤维有共同之处， 仍被认 为是膳食纤维中的一种。RS 被大肠发酵利用后， 生成
短链脂肪酸， 这些短链脂肪酸对维持肠道健康非常有 益。短链脂肪酸中丁酸是肠道细胞重要能量剂， 也是 预防和杀死癌细胞重要化合物〔11–13〕 ， 摄入一定量抗性 淀粉对改善糖代谢有一定帮助。 人 们 对 RS 的 结 构 有 了 一 定 的 研 究， 也已证实 淀 粉 来 源 不 同， RS 结 构 不 同， 其生理功能也不相 同〔14〕 。本文在以往研究基础上， 通过体内代谢模型， 利用扫描电镜 （SEM） 、 HPLC、 X 射线 （X–ray）和 α 角 X 射线散射 （SAXS）等分析手段， 进一步从不同 侧面研究 RS 精细结构， 揭示淀粉在人体小肠中消化 行为。 1 材料和方法 1.1 试剂与仪器 因为 RS 含量随直链淀粉含量增高而增加， 因此 本文以高直链玉米淀粉为原料： 澳大利亚国民淀粉公 司。对照组淀粉为玉米淀粉： 美国 sigma 公司。 淀 粉 体 外 消 化 试 验 采 用 的 酶 均 来 源 于 SigmaAldrich；异淀粉酶：澳大利亚 Megazyme 公司；样品 制备及色谱分析测定所需试剂均为分析纯或色谱级。 EC1X2 高压锅： ASC Process Systems 公司 ； BT85