哺乳动物细胞DNA损伤修复非程序性DNA合成体外试验编制说明
食品毒理学-江南大学现代远程教育第2阶段测试题及参考答案(第七章至第十二章)
江南大学现代远程教育第二阶段测试卷考试科目:《食品毒理学》第七章至第十二章（总分100分）时间：90分钟学习中心（教学点）批次：层次：专业：学号：身份证号：姓名：得分：一、单项选择题（本题共10小题，每小题1分，共10分。
）1、（ D ）时间查受试外源化学物能否通过妊娠母体引起胚胎毒性或后代畸形的动物试验。
A、雌性生殖毒性试验B、急性毒性试验C、致突变试验D、致畸试验2、细胞或生物体的一套完整的遗传物质称为（ A ）。
A、基因组B、染色体C、基因D、核酸3、迄今为止，只有（ D ）可以准确判别人类致癌物的致癌性。
A、急性毒性试验B、致畸试验C、致突变试验D、动物诱癌试验4、化学物对免疫系统的作用具有（ C ），同一化学物可在不同条件下分别表现为对机体的免疫抑制或过敏。
A、互动性B、单相性C、双相性D、累加性5、对毒理学试验不仅要了解每项试验所能说明的问题，还应该了解试验的（ D ），以便为安全性评价作出一个比较恰当的结论。
A、设计方案B、详细步骤C、合理结论D、局限性和难以说明的问题6、原位杂交是在保持组织、细胞或染色体原有形态结构的基础上，对其内部（ A ）进行检测及定位的分子生物学手段。
A、特殊核酸序列B、染色体C、基因D、基因组7、已证实，重金属铅可干扰下丘脑－垂体－睾丸轴的正常功能，主要是影响（ C ）的释放。
A、前列腺激素B、睾酮C、促性腺释放激素D、雄激素8、化学致突变物造成的DNA损伤，在DNA复制过程中转变为（ B ）的变化，导致基因突变。
A、基因组B、碱基排列顺序C、染色体D、基因9、抗原性物质进入机体后激发免疫细胞活化、分化和效应的过程称为（ D ）。
A、免疫分化B、免疫调节C、免疫诱导D、免疫应答10、分子毒理学探讨众多外源化合物对生物机体组织中的各种分子，特别是（ C ）的作用机制。
A、聚合物B、有机分子C、生物大分子D、生物分子二、多项选择题(本题共10小题，每小题2分，共20分。
实验一-哺乳动物基因组DNA的提取及纯化
二、实验原理 基因组DNA的特性：分子量较大、易断
如何保证DNA分子的完整性
DNA抽提思路：
破碎组织细胞 去除细胞内杂质
匀浆或液氮研磨 蛋白、多糖、脂类、RNA和小分子物质
所提取的DNA片段的大小：100 ～150kb
纯化DNA
、实验原理
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
鲁东大学 生命科学学院 四、操作步骤
基因组DNA的提取：
School of Life Sciences
0.1g猪肝，冰冷生理盐水洗3次，剪碎 转入玻璃匀浆器中，加入1mL匀浆液，匀浆至无组织块（冰上操作） 将匀浆液转入1.5 mL小指管， 加入蛋白酶K20 uL（20mg/mL），颠倒混匀 650C 恒温水浴锅中水浴30min 12000rpm，离心5min，取上清移入另一离心管
超净台中干燥后加 100～200uL TE, 40C溶解过夜，-200C保存 （可进一步通过凝胶电泳检测所获取基因组DNA质量）
鲁东大学 生命科学学院
五、注意事项
1.肝的处理时间不宜过长；
School of Life Sciences
2.加入细胞裂解液前，细胞需均匀分散，以减少DNA团块形成； 3.提取的DNA不宜过分干燥，否则会导致DNA溶解困难。
DNA纯化
加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀，冰上平倒静置10min 40C，12000rpm离心10min，用扩口枪头取出上清
鲁东大学 生命科学学院
School of Life Sciences
上清加等体积氯仿/异戊醇，慢慢颠倒混匀 40C,12000rpm，离心10min，用扩口枪头取上清 上清加1/10体积的3mol/L NaAc（pH5.2)和加2倍体积的无水乙醇 慢慢混匀，-200C静置20min 12000rpm离心10min，弃上清 沉淀用1mL 70%冷乙醇洗两次，每次12000rpm离心10min，弃上清
ICH关于遗传毒性体外、体内试验的建议--ICHS2(R1)人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则介绍(二)
发布日期20080729栏目化药药物评价>>综合评价ICH关于遗传毒性体外、体内试验的建议--ICHS2（R1）人用药物遗传毒性标题试验和结果分析指导原则介绍（二）作者黄芳华部门正文内容审评二部黄芳华前文已介绍了ICH关于遗传毒性标准试验组合的要求，以下介绍ICHS2（R1）Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation forPharmaceuticals Intended for Human Use（人用药物遗传毒性试验和结果分析指导原则）中关于体外、体内试验的建议。
一、对体外试验的建议1、试验重复和分析实验结果的重现性是涉及新方法或意外发现的研究的基本组成部分。
但是，用标准的、已广泛应用的遗传毒性试验进行常规试验时往往不需要完全重复。
这些试验都经过很好的充分验证且有有效的内部控制，对明确的阳性或阴性结果试验通常不需要重复。
理想状态是可明确宣称试验结果是明确的阳性或明确的阴性。
但是，试验结果有时达不到阳性或阴性称谓的预先设定的标准，因此被定为“可疑”。
统计学方法的应用有助于数据分析；但是，充足的生物学分析是至关重要的。
可疑试验的重复可致(i) 一个明确的阳性结果，因此作为整体阳性结果；(ii) 一个阴性结果，所以结果不需要重复和总体结果为阴性；或(iii)另一个可疑的结果，最后结论仍维持可疑。
2、对细菌突变试验的推荐方案OECE指导原则（1997）和IWGT报告(Gatehouse et al, 1994) 给出了对方案的建议。
2.1 高剂量水平的选择最高剂量水平当不受溶解度或细胞毒性限制时，推荐最高浓度为5000µg/皿。
溶解度的限制对于细菌培养，如果沉淀不干扰评分应对沉淀量进行评分，毒性不限制，最高剂量不超过5000µg/皿。
有证据表明在用细菌遗传毒性试验检测某些受试物时，在不溶解的浓度范围内也能检测出剂量相关性的遗传毒性。
非程序性DNA合成试验
1 范围本方法规定了非程序性DNA合成试验的基本技术要求。
本方法适用于评价保健食品的诱变性和/或致癌性。
用这种短期筛选方法可以检测出一些短期体外试验法所不能检出的诱变剂和/或致癌剂。
2 术语和定义下列术语和定义适用于本方法。
非程序性DNA合成（Unscheduled DNA Synthesis，UDS）：当DNA受损伤时，损伤修复的DNA 合成主要在S期以外的其它细胞周期，称非程序性DNA合成。
3 原理正常情况下，于细胞有丝分裂周期中，仅S期是DNA合成期。
当DNA受损伤时，损伤修复的DNA合成主要在其它细胞周期，称程序外DNA合成，即UDS，因此发现UDS增高，即表明DNA发生过损伤。
在体外培养细胞中，用UDS的测量来显示DNA修复合成的主要关键在于如何鉴别很高水平的半保留DNA复制和水平较低（充其量只有半保留DNA复制的5％）的UDS 。
这可以用同步培养将细胞阻断于G1期并用药物（常用羟基脲）抑制残留的半保留DNA复制后显示。
同步培养可用缺乏必需氨基酸精氨酸的培养基（ADM）使DNA合成的始动受阻而使细胞同步于G1期。
在这些半保留DNA合成明显抑制和阻断了的细胞中，UDS即可用3H-胸腺嘧啶核苷的掺入增加显示。
它可用放射自显影或液体闪烁计数法进行测量。
4 试剂与器材4.1 试剂全部试剂除注明外，均为分析纯，试验用水为双蒸水。
4.1.1 参考阳性物对照物：可用7,12-二甲基苯并蒽（7,12-dimethylbenzathracene），2-乙酰氨基芴（2-acetylaminofluorene），4-硝基喹啉氧化物（4-nitroquinoline oxide），N-甲基亚硝胺（N-dimethylnitrosamine）。
细胞增殖用培养基：Eagle氏最低要求培养基（Minimal Essential Medium，简称EMEM）85份，小牛血清15份，加入青霉素、链霉素贮存液1份，使青霉素、链霉素的最终浓度分别为100单位及100 mg/mL。
保健食品毒理学评价程序
保健食品及其原料毒理学评价程序本程序适用于保健食品及其原料的毒理学安全性评价。
1术语1.1保健食品是指声称保健功能，不得对人体产生急性、亚急性或者慢性危害的特别食品。
包括属于补充维生素、矿物质等养分物质的养分素补充剂，以及声称保健功能的产品。
1.2保健食品原料形成保健食品成效成分和配方的初始物料。
2受试物2.1受试物可以是保健食品或保健食品原料。
2.2资料性要求2.2.1应供给受试物的名称、性状、规格、批号、生产日期、保质期、保存条件、申请单位名称、生产企业名称、配方、生产工艺、质量标准、保健功能以及推举摄入量等信息。
2.2.2受试物为保健食品原料时应供给动物和植物类原料的产地和食用部位、微生物类原料的分类学地位和生物学特征、食用条件和方式、食用历史、食用人群等根本信息，以及其他有助于安全性评估的资料。
2.2.3原料为从动物、植物、微生物中分别的成分时，还需供给当成分的理化特性和化学构造等资料。
2.2.4供给受试物的主要成分、成效成分/标志性成分及可能的有害成分的分析报告。
2.3受试物的特别要求2.3.1保健食品应供给包装完整的定型产品。
毒理学试验所用样品批号应与功能学试验所用样品批号全都，并且为卫生学试验所用三批样品之一〔益生菌、奶制品等产品保质期短于整个试验周期的产品除外〕。
依据技术审评意见要求补做试验的，假设原批号样品已过保质期，可使用批号的样品试验，但应供给批号样品按产品技术要求检验的全工程检验报告。
2.3.2由于推举量较大等缘由不适合直接以定型产品进展试验时，可以对送检样品适当处理，如浓缩、局部去除辅料或安全的食品成分等。
应供给受试样品处理过程的说明和相应的证明文件，处理过程应与原保健食品的主要生产工艺步骤保持全都。
3.毒理学试验的主要工程依据 GB15193 开展以下试验。
3.1急性经口毒性试验3.2遗传毒性试验：细菌回复突变试验，体内哺乳动物红细胞微核试验，哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验，小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验，体外哺乳类细胞 HGPRT 基因突变试验，体外哺乳类细胞 TK 基因突变试验，体外哺乳类细胞染色体畸变试验、啮齿类动物显性致死试验，体外哺乳类细胞 DNA 损伤修复〔非程序性 DNA 合成〕试验，果蝇伴性隐性致死试验。
食品检验方法标准.
GB 15193.26-2015 食品安全国家标准 慢性毒性试验
GB 15193.27-2015 食品安全国家标准 致癌试验
GBT 23179-2008 饲料毒理学评价 亚急性毒性试验
GBT27406-2008 实验室质量控制规范 食品毒理学检测
GB31604.10-2016 食品安全国家标准 食品接触材料及制
品 丙烯酰胺迁移量的测定
GB 31604.21-2016 食品安全国家标准 食品接触材料及制
品 对苯二甲酸迁移量的测定
GB 31604.26-2016 食品安全国家标准 食品接触材料及制
品 环氧氯丙烷的测定和迁移量的测定
GB 31604.27-2016 食品安全国家标准 食品接触材料及制
品 塑料中环氧乙烷和环氧丙烷的测定
GB 31604.31-2016 食品安全国家标准 食品接触材料及制 品 氯乙烯的测定和迁移量的测定 GB 31604.43-2016 食品安全国家标准 食品接触材料及制
品 乙二胺和己二胺迁移量的测定
GB 31604.44-2016 食品安全国家标准 食品接触材料及制
品 乙二和二甘醇迁移量的测定
DNA损伤修复（非程序性DNA合成）试验
GB 15193.13-2015 食品安全国家标准 90天经口毒性试验
GB 15193.16-2014 食品安全国家标准 毒物动力学试验
GB 15193.17-2015 食品安全国家标准 慢性毒性和致癌合
并试验
GB 15193.19-2015 食品安全国家标准 致突变物、致畸物
和致癌物的处理方法
GB 15193.20-2014 食品安全国家标准 体外哺乳类细胞TK 基因突变试验 GB 15193.22-2014 食品安全国家标准 28天经口毒性试验
体外哺乳动物细胞微核试验及起草说明
推荐用姬姆萨染色（5％～10％姬姆萨染液，15min～20min），也可用DNA特异性荧光染料（如：吖啶 橙或Hoechst 33258）。
如果需要区分染色体断裂剂和非整倍体诱变剂，可用荧光原位杂交（FISH）或引物原位标记等方法。 6.4 阅片 6.4.1 微核的判断标准 微核一般为圆形或椭圆形；直径不超过主核的1/3；与主核在一个焦点平面上，与主核的颜色、结构特 征及折光性一致；与主核之间没有核物质相连，可以和主核有边界的重叠，但能看清各自的核膜。 6.4.2 方案一：使用cytoB 每个剂量组至少分析2000个双核细胞，计算微核细胞率（一个双核细胞不论含有几个微核，都只算作 一个含微核细胞）。如果单次培养可供计数的双核细胞数少于2000，则应采用多次细胞培养或平行培养， 以获得足够分析的细胞。对不规则的双核细胞（如两个核大小相差悬殊）和多于两个核的细胞不进行分析。 6.4.3 方案二：不使用cytoB 每个剂量组至少分析2000个细胞，计算微核细胞率。如果单次培养可供计数的细胞数少于2000，则应 采用多次细胞培养或平行培养。 6.5 统计处理： 数据按不同剂量列表，指标包括细胞毒性、观察细胞数、含微核细胞数及微核细胞率。受试物各剂量 组与阴性对照组（溶剂对照组）、阳性对照组的微核细胞率用适当的统计学方法（如χ２检验）进行处理。 6.6 结果判定： 在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中为阳性结果： 6.6.1 受试物引起微核细胞率的增加具有统计学意义，并与剂量相关； 6.6.2 受试物在任何一个剂量条件下，引起的微核细胞率增加具有统计学意义，并有可重复性。 7 结果解释
5.1 细胞株 可选用中国仓鼠肺细胞株（V79、CHL）或卵巢细胞株（CHO）、小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）、人 外周血淋巴细胞株（如 TK6）或原代培养细胞。推荐使用CHL或L5178Y细胞株。细胞在使用前应进行染色 体数目稳定性和有无支原体污染的检查。 5.2 培养基
日用化学品体外哺乳动物细胞微核试验
日用化学品安全性评价体外哺乳动物细胞微核试验1范围本标准规定体外哺乳动物细胞微核试验的基本原理、规范性引用文件、术语及定义、试验方法、数据处理及结果评价和报告。
本标准适用于评价日用化学品及化学品原料的遗传毒性。
2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
OECD Guidelines for the testing of chemicals:In Vitro Mammalian Cell Micronucleus Test(No.487),2016年GB/T28646-2012《化学品体外哺乳动物细胞微核试验方法》3术语及定义GB/T28646-2012界定的以及下列术语及定义适用于本文件。
为了便于使用，以下重复列出了GB/T 28646-2012中的某些术语及定义。
3.1非整倍体诱发剂aneugen任何与细胞有丝分裂和减数分裂周期中有关的成分相互作用后导致细胞出现非整倍体现象的物质或因子。
3.2染色体断裂剂clastogen任何引起细胞或生物体中染色体结构畸变的物质或因子。
3.3胞质分裂cytokinesis随着核分裂（有丝分裂和减数分裂）之后的细胞质的分裂。
3.4细胞阻滞cytostasis细胞生长被抑制。
3.5细胞毒性cytotoxicity对细胞结构或功能的有害作用，最终可导致细胞死亡。
3.6微核micronuclei独立于细胞核主核以外的小核，由有丝分裂或减数分裂末期滞后的染色体片段或整条染色体构成。
3.7胞质分裂阻断增殖指数cytokinesis-block proliferation index,CBPI使用细胞松弛素B时计算细胞毒性的方法。
处理组中二次分裂细胞数相对于对照组的比值。
3.8复制指数replication index,RI使用细胞松弛素B时计算细胞毒性的方法。
医疗器械生物相容性概述
第一页，共65页
相关概念
生物相容性：
生命体组织对非活性材料产生反应的一种性能。
医疗器械：制造者专门或主要设计成为下列目的应用于人体的， 不论是单独使用还是组合使用的，包括使用所需软件在内的任 何仪器、设备、器具、材料或者其他物品。
预期用于人体的任何材料或器械的选择与评价需遵循一定的评价程
在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使培养的哺乳动 物细胞暴露于受试物中。用中期分裂相阻断剂（如秋水仙 素或秋水仙胺）处理，使细胞停止在中期分裂相，随后收 获细胞，制片，染色，分析染色体畸变。
第十八页，共65页
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验
测试系统：
中国地鼠卵巢（CHO）细胞株；中国地鼠肺（CHL）细胞株；
D6610
修复
urvBurvBurvB-
缺失
LPS VIT
rfa-
bio-
rfa-
bio-
rfa-
bio-
质粒
----pKM101
可检测的 突变类型
碱基置换 移码
移码
TA 98 TA 100
D3052 urvB-rvB- rfa-
bio-
TA 102
G428 urvB+ rfa-
处理条件：
包括代谢活化和非代谢活化条件 在处理后6和24小时收获细胞 代谢活化条件下，受试物处理时间为3小时
第二十页，共65页
体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 读片分析：
有丝分裂指数－毒性 染色体结构畸变
染色体数目畸变
第二十一页，共65页
a.染色单体断
裂
b. 三辐射体
c. 染色体断片
有杀菌作用，最高剂量可为最低抑菌浓度， 无杀菌作用的受试物，最高剂量可为原液，最低剂量 为0.1μg/皿。
致突变作用及其试验方法与评价
③环状染色体（ring chromosome） 染色体两臂各发生一次断裂，其带有着丝粒 的节段的两断端连接形成一个环时，称为环 状染色体。
④倒位（inversion） 当某一染色体发生两次 断裂后，其中间节段倒 转180再重接，称为 倒
二、突变类型
遗传毒理学家主要关注两类遗传学损伤： 基因突变
染色体畸变
端粒
着丝粒
姊 妹 染 色 单 体
端粒
染色体畸变 染色体的结构及数目改变。
组 蛋 白
基因突变 一个或几个DNA碱基对的改变。
碱基对
双 螺 旋
这些损伤多因DNA受损所致，也可能因DNA
以外的靶组织受损所致。
基因突变、染色体畸变及染色体数目变化的本
无误 修复
染色体分 离异常
重组事件 SCE 有丝分裂性交换
染色体结 构异常
基因 突变
细胞 死亡
非整倍体 多倍体
常用的致突变试验
1、细菌回复突变试验 （Ames试验） 2、哺乳动物细胞基因突变 试验 3、果蝇伴性隐性致死试验 4、染色体畸变分析 7、显性致死试验 8、小鼠可遗传易位试验
9、细菌DNA修复试验
4、细胞周期、有丝分裂与减数分裂
细胞周期指细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂
终了所经历的过程。
G0 ：DNA合成前期； G1 ：DNA合成期；
S：完成DNA复制；
G2：为有丝分裂做准备；
M：有丝分裂期
有丝分裂过程
有丝分裂指细胞核分 裂的过程，一个细胞 由此生成两个子细胞，
体外哺乳类细胞基因突变(HGPRT)试验原理及注意事项
体外哺乳类细胞基因突变（HGPRT）试验原理及注意事项In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test【试验原理】体外哺乳动物细胞基因突变试验是利用培养的哺乳动物细胞作指示生物的体外遗传毒理学试验，可用于检测有化学物质诱导的基因突变，适用的细胞系包括小鼠淋巴瘤细胞（L5178Y），中国仓鼠肺细胞（V79），中国仓鼠卵巢细胞（CHO），人类淋巴母细胞（TK6）等。
这些细胞系，最常用的遗传学终点是检测胸苷激酶（TK）图标，次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶（HPRT/HGPRT）图标，黄嘌呤转磷酸核糖激酶（XPRT）基因突变。
TK、HPRT/HGPRT、XPRT突变试验可以检测不同的遗传事件谱。
细胞在正常情况下，能产生HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine,6-TG）的选择性培养液中，HGPRT催化产生核苷-5，-单磷酸（NMP），NMP掺入DNA中致细胞死亡。
在致癌和（或）致突变物作用下，某些细胞X染色体上控制HGPRT 的结构基因发生突变，不能再产生HGPRT，从而使突变细胞对6-TG具有抗性作用，能够在含有6-TG的选择性培养液中存活生长。
在有或无代谢活化系统的条件下，将细胞培养物暴露于受试物中适当时间，然后将细胞再传代培养，在含有6-TG的选择性培养液中，突变细胞会继续分裂并形成集落，计数突变集落形成数，计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。
【参考标准】GB 15193.12-2014 体外哺乳类细胞HGPRT基因突变试验【材料和试剂】细胞：常用中国仓鼠肺细胞株（V79）和中国仓鼠卵巢细胞株（CHO），其他如小鼠淋巴瘤细胞株（L5178Y）和人类淋巴母细胞株（TK6）亦可。
细胞在使用前应进行有无支原体污染的检查。
培养液：应根据试验所用系统和细胞类型来选择适宜的培养基。
对于 V79和 CHO 细胞，常用最低必需培养基（MEM，Eagle）、改良 Eagle培养基（DMEM）加人10%胎牛血清和适量抗菌素。
我国食品安全性毒理学评价的试验方法
一、《食品安全性毒理学评价程序（试行）》（GB15193.1-2003）
该程序规定了我国食品安全性毒理学评价的总体原则、程序、方法和结果判定，适用于拟用于食品的化学和生物物质，如食品添加剂、食品加工用微生物等。
该程序规定的试验方法包括：
* 急性毒性试验
* 蓄积毒性试验
* 亚慢性毒性试验
* 慢性毒性试验
* 致癌试验
* 生殖毒性试验
* 致突变试验
* 免疫毒性试验
二、《食品安全性毒理学评价方法标准》
该标准系列包括《细菌回复突变试验》、《哺乳动物红细胞微核试验》、《哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验》、《小鼠精原细胞或精母细胞染色体畸变试验》、《啮齿类动物显性致死试验》、《28天经口喂养试验》、《6个月经口喂养试验》、《12个月经口喂养试验》、《致癌试验》、《生殖发育毒性试验》等。
这些标准规定了我国食品安全性毒理学评价中常用的试验方法的具体要求，包括试验目的、试验动物、试验剂量、试验方法、试验评价等。
此外，国家食品药品监督管理总局还发布了《食品安全风险评估技术指导原则》（2022版），其中第4章“毒理学评估”对食品安全性毒理学评价的一般原则、方法和结果判定进行了详细说明。
食品毒理学评价程序及方法标准的清理建议
30天和90天喂养试验（GB15193.13-2003）
修订为食品安全国家标准《90天经口毒性试验》
13
致畸试验（GB15193.14-2003）
修订为食品安全国家标准《致畸试验》
14
繁殖试验（GB15193.15-2003）
修订为食品安全国家标准《生殖毒性试验》
15
代谢试验（GB15193.16-2003）
修订为食品安全国家标准《毒物动力学试验》
16
慢性毒性和致癌试验（GB15193.17-2003）
修订为食品安全国家标准《慢性毒性和致癌合并试验》
17
日容许摄入量（ADI）的制定（GB15193.18-2003）
修订为食品安全国家标准《健康指导值》
18
致突变物、致畸物和致癌物的处理方法(GB15193.19-2003）
食品毒理学评价程序及方法标准的清理建议
（征求意见稿）
序号
现行标准
清理建议
1
食品安全性毒理学评价程序(GB15193.1-2003)
修订为食品安全国家标准《食品安全性毒理学评价程序》
2
食品毒理学实验室操作规范(GB15193.2-2003)
修订为食品安全国家标准《食品毒理学实验室操作规范》
3
急性毒性试验（GB15193.3-2003）
修订为食品安全国家标准《哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验》
7
小鼠睾丸染色体畸变试验（GB15193.8-2003）
修订为食品安全国家标准《小鼠精原细胞/精母细胞染色体畸变试验》
8
显性致死试验（GB15193.9-2003）
修订为食品安全国家标准《啮齿动物显性致死试验》
9
非程序性DNA合成试验（GB15193.10-2003）
锰的致突变、致癌、致畸作用
锰的致突变、致癌、致畸作用樊卫萍;龚建福;黄贤仪【摘要】锰是人体必需的微量元素,在体内具有重要的生理功能.它不仅是机体中重要酶的组成部分 ,也是许多酶的活化剂.但长期接触过量锰及其化合物会对机体造成损害.锰及其化合物除了广泛应用于工业生产以外,近来还出现了许多锰的新的化合物,例如:杀虫剂 MANEB、汽油防爆剂 MMT、核磁断层扫描中的对照剂 MnDPDP,因而人们对锰的毒性也日益关注.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2004(016)005【总页数】4页(P315-317,320)【关键词】锰;致突变;致癌;致畸【作者】樊卫萍;龚建福;黄贤仪【作者单位】新疆医科大学,新疆,乌鲁木齐,830054;新疆医科大学,新疆,乌鲁木齐,830054;新疆医科大学,新疆,乌鲁木齐,830054【正文语种】中文【中图分类】R114锰是精氨酸酶、脯氨酸酶、丙酮酸羧化酶、超氧化物歧化酶等酌组成成分［1］。
有上百种酶在体外由锰激活，如水解酶、脱酰酶、脱羧酶、激酶、转移酶、肽酶等，又是碱性磷酸酶和黄素激酶酌激动剂［2］。
RNA聚合酶需经锰离子激活后，才能催化三磷酸腺苷、三磷酸鸟嘌呤核苷、三磷酸胞嘧啶核苷及三磷酸尿嘧啶核苷，聚合形成RNA。
锰还能激活DNA聚合酶。
自从DNA和RNA内检出锰以后，不少人认为锰不但参与蛋白质酌合成，还参与遗传信息酌传递，锰和其他阳性离子，与DNA带阴性电荷酌磷酸基团一同起电稳定作用，对维持DNA酌二级结构具有重要意义。
因此，锰是机体酌必需微量元素。
缺锰后有些酶酌活性降低、内分泌失调、免疫功能降低、造血功能下降；人酌肝细胞出现粗面内质冈肿胀和破坏、高尔基体肿大、线粒体异常［1］。
脱氧核糖核酸（DNA）是生命活动中最重要酌遗传物质，在维护机体酌正常功能上有举足轻重酌作用。
由于其结构特点及半保留复制特性，DNA分子易出现损伤，引起细胞及机体损害。
DNA损伤酌现象，包括DNA链酌断裂，氧化损伤、DNA 加合物，链间酌交叉联结，化学物与DNA酌共价结合，DNA酌合成抑制和非程序性DNA修复合成（UDS）等［3］，是化学致癌过程中早期可检测酌关链步骤。
体外哺乳动物细胞TK基因突变试验原理及注意事项
体外哺乳动物细胞TK基因突变试验原理及注意事项TK基因突变试验的检测终点是TK基因的突变。
TK基因突变属于常染色体基因突变。
TK基因的产物胸苷激酶在体内催化从脱氧胸苷(TdR)生成胸苷酸(TMP)的反应。
在正常情况下，此反应并非生命所必需，原因是体内的TMP主要来自于脱氧尿嘧啶核苷酸(dUMP),即由胸苷酸合成酶催化的dUMP甲基化反应生成TMP。
但如在细胞培养物中加入胸苷类似物(如三氟胸苷,即trifluorothymidine,TFT)，则TFT在胸苷激酶的催化下可生成三氟胸苷酸，进而掺入DNA，造成致死性突变,故细胞不能存活。
若TK基因发生突变，导致胸苷激酶缺陷,则TFT不能磷酸化，亦不能掺DNA，故突变细胞在含有TFT的培养基中能够生长，即表现出对TFT的抗性。
根据突变集落形成数可计算突变频率，从而推断受试物的致突变性。
在TK基因突变试验结果观察中可发现两类明显不同集落，即大/小集落(L5178Y细胞)或正常生长/缓慢生长集落(TK6细胞)，有研究表明，大集落/正常生长集落主要由点突变或较小范围的缺失等引起，而小集落/缓慢生长集落主要由较大范围的染色体畸变，或由涉及调控细胞增殖的基因缺失引起。
北京汇智泰康医药技术有限公司针对小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验开发染TK基因突变试剂盒，本试剂盒针对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y开展TK基因突变试验，试剂盒省去了阳性底物成分、筛选培养基准备、诱导 S9 制备，可以直接使用，大大缩短了实验周期；试剂盒各成分均经过严格的质量检测，无杂菌污染，诱导 S9 活性均符合小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验要求，实验结果准确、可靠、重现性高。
染色体畸变试验试剂盒应用广泛，可进行食品、化学品、农药、消毒剂、食品添加剂、药物残留、化妆品、容器与包装材料等多个方面的遗传毒理学检测。
TK基因突变试验导则1 范围本标准规定了体外哺乳类胸苷激旃(thymidine kinase TK)基因突变试验的基本试验方法与技术要求。
高中生物 体外哺乳动物细胞基因突变试验
十、体外哺乳动物细胞基因突变试验In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test1 范围本规范规定了体外哺乳类细胞基因突变试验的基本原则、要求和方法。
本规范适用于检测化妆品原料及其产品的致突变性。
2 规范性引用文件OECD Guidelines for Testing of Chemicals (No. 476, 1997)3 试验目的该测试系统用于检测化妆品原料及其产品引起的突变，包括碱基对突变、移码突变和缺失等，从而评价受试物引起突变的可能性。
4 定义正向突变（Forward mutation）：从原型至突变子型的基因突变，这种突变可引起酶和功能蛋白的改变。
突变频率（Mutant frequency）：所观察到的突变细胞数与存活细胞数之比值。
5试验原理在加入和不加入代谢活化系统的条件下，使细胞暴露于受试物一定时间，然后将细胞再传代培养，突变细胞在含有6-硫代鸟嘌呤（6-thioguanine，6-TG）或三氟胸苷（trifluorothymidine，TFT）的选择性培养液中能继续分裂并形成集落。
基于突变集落数，计算突变频率以评价受试物的致突变性。
6 试验方法6.1 试剂和受试物制备6.1.1 受试物6.1.1.1 受试物的配制：固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中，用前稀释至适合浓度；液体受试物可以直接加入试验系统/或用前稀释至适合浓度。
受试物应在使用前新鲜配制，否则就必须证实储存不影响其稳定性。
6.1.1.2 溶剂的选择：溶剂必须是非致突变物，不与受试物发生化学反应，不影响细胞存活和S9活性。
首选溶剂是水或水溶性溶剂。
二甲基亚砜（DMSO）也是常用溶剂，但使用时浓度不应大于0.5%。
6.1.1.3 受试物浓度设置6.1.1.3.1 最高浓度的选择：决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗克分子浓度（osmolality）的改变。
6.1.1.3.2 细胞毒性的确定：应使用指示细胞完整性和生长情况的指标，在活化系统存在或不存在两种条件下确定细胞毒性，例如相对集落形成率或相对细胞总生长情况（total growth）。
化妆品 体外哺乳动物细胞基因突变试验报告单(样式)(日化品 化妆品 护肤品 表单资料 体例)
体外哺乳动物细胞基因突变试验报告
检验受理编号：第页/ 共页
样品中文名称检验开始日期
检验项目体外哺乳动物细胞基
因突变试验
检验完成日期
一、材料和方法
1. 细胞株
2. 代谢活化系统
3. 受试物：物态，溶剂、溶解度、配制方法，前处理方法。
剂量设计及最高剂量设计依据（说明受试物对细胞毒性、溶解情况等）。
4. 试验方法：包括试验方法、选择剂及其浓度、阳性对照物的内容，细胞毒性的测定
方法，培养液和培养容器的种类、细胞接种密度、受试物与试验系统的接触时间，
表达时间，结果评价等。
二、试验结果
1. 受试物最高剂量的确定及结果：包括细胞毒性的测定；细胞悬浮增长率；溶解情况；对pH和渗克分子浓度的影响。
2. 试验组和对照组的突变频率及统计结果。
体外哺乳动物细胞基因突变试验结果
组别终浓度（μg/mL）□细胞相对存活率（%）
□相对总生长率（%）
突变率（⨯10-6）＋S9－S9＋S9－S9
阴性对照
受试物
阳性对照
三、试验结论
体外哺乳动物细胞基因突变试验结果：
（本页以下空白）。
新化学物质健康风险评价技术方法-环境与健康数据中心
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
《食品安全国家标准哺乳动物细胞DNA损伤修复/非程序性DNA合成
体外试验》(征求意见稿)
编制说明
一、标准起草的基本情况
本项目受卫生部食品安全综合协调与卫生监督局委托，由广东省疾病预防控制中心作为主要修订单位，对GB15193.10-2003《非程序性DNA合成试验》进行修订。
本标准的主要起草人为黄俊明、杨杏芬、杨颖、李志、赵敏、陈壁锋、张紫虹、熊习昆、吕颖坚。
为了做好标准的制定工作，营养与食品安全所于2006年8月17-18日召开了“《食品安全性毒理学评价程序和检验方法》标准制修订课题协作组第一次工作会议，参会的有中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、广东省疾病预防控制中心、上海市疾病预防与控制中心、北京市疾病预防控制中心和北京大学的专家近20人，会上确定了《食品安全性毒理学评价程序和方法》（GB15193.1-15193.21）2003版修订的原则和框架，又分别征求了相关专家的意见，根据反馈意见对文本进行了修改，最终形成了该征求意见稿。
二、标准的重要内容及主要修改情况
本标准的重要内容包括范围、术语和定义、实验原理、实验方法、数据处理和结果评价。
在与国际OECD《化学品测试指南》和USEPA《健康效应评估指南》接轨的原则基础上，试验内容更具体，更具有可操作性，语言编写更具有通俗性。
本标准与GB15193.10-2003中《非程序性DNA合成试验》差异及提出的依据见下：
1.本标准名称由《非程序性DNA合成试验》修改为《哺乳动物细胞DNA损伤修复/非程序性DNA合成体外试验》，以明确试验名称与OECD指南和USEPA指南保持一致。
2.对“原理”中的内容进行修订，补充内容，使其更加完整
根据哺乳动物细胞DNA损伤修复/非程序性DNA合成的生成规律及遗传毒性的发生机制，参照OECD、EPA指南有关哺乳动物细胞DNA损伤修复/非程序性DNA合成试验基本原理的描述，对该条目的内容进行补充，使其更加具体清晰，有助于实验人员对显性致死试验方法的理解和掌握。
3.根据对试验方法的修改需要，对“试验方法”中的部分技术内容进行了增加和修订，并删除了一些不必要的内容，相应的标题序号进行了更改：
3.1由于原标准对于溶剂的设置浓度、对照、细胞的培养条件等重要的关键技术内容没有提及，根据OECD指南和USEPA指南的内容，在现标准中增加相关新内容：
在“5.1受试物”中增加“溶剂的终浓度不能影响细胞活性”。
增加了“5.2对照”、“5.3染毒浓度”、“5.4代谢活化”、“5.5细胞培养”、“ 5.5.1细胞的选择”、“5.5.2 培养条件”。
在“5.6.1 UDS的放射自显影显示法”增加“为了区分UDS和正常的DNA半保留复制，可采用精氨酸缺乏的培养基、低血清培养基或在培养基中添加羟基脲的方法来减少和抑制正常的DNA半保留复制”。
3.2删除的内容：“
4.1.8”的内容与新标准中“4.1.7试剂制备，”重复，删去。
4对“数据处理”条目及其内容进行修订，各项指标的统计方法更加明确具体；
4.1 将原标准中“t检验”改为“合适的统计方法”，便于操作者对结果进行合适的统计。
4.2 将原标准中“7 或者最小剂量组反应阳性，与对照组比较具有统计学意义”改为“7 或者至少在一个测试点得到可重复并有统计学意义的掺入量增加”，使得将结果评价的内容细化，与OECD指南和USEPA指南一致。
三、国际标准情况
本部分标准的起草参考了OECD《化学品测试指南》中“体外哺乳动物细胞DNA损伤与修复/非程序性DNA合成试验方法”[OECD Guidelines for Testing of Chemicals,Test method of DNA damage and repair/unscheduled DNA synthesis with mammalian cells in vitro]、USEPA《健康效应测试指南》中“非程序性
DNA合成试验”[USEPA Health Effects Test Guidelines OPPTS 870.5550，Unscheduled DNA Synthesis in Mammalian Cells in Culture]，最大限度地做到了与这些国际指南无明显的原则性差异。
3。