荧光光谱法研究亚甲基蓝与蛋白质的结合反应

荧光光谱法在生物分析中的应用
---亚甲基蓝与蛋白质的结合反应
刘超-生物化工-2009010236
荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段。

荧光测试中的发射峰特征、荧光偏振、能量转移及荧光寿命等指标可以对蛋白质分子中荧光生色基团的结构及其所处的微环境提供有用的信息。

在生物体中，蛋白质是必不可少的生命物质，有关蛋白质的各类研究，是目前生命科学、化学和临床医学中共同关注和感兴趣的课题。

亚甲基蓝是一种具有平面结构（结构式见图1）的碱性生物染色剂，在医学临床诊断及化学分析中已有较长的应用历史，且可用于亚硝酸盐、磺氨类、氰化物及一氧化碳等中毒的解毒药。

近年来又发现MB对DNA具有插入作用，MB可被用于抗癌药物的体外筛选；此外MB的光化学性质及作用机理与血卟啉很相似，被认为可能成为一种新型光敏剂而用于癌症的光化学治疗。

新近的研究还表明MB在溶液中分子的聚集状态与溶剂及介质有关。

本文应用荧光光谱法研究了人体生理pH值条件下，亚甲基蓝与牛血清白蛋白间的相互作用，测定了结合常数、结合位点数及结合距离，从而由分子水平的角度认识蛋白质分子与小分子之间相互作用的机理，为生命科学研究提供有用的信息和数据。

实验方法：配制0.05mol/L的Tris-HCl并含0.10mol/LNaCl的缓冲溶液
(pH=7.0),恒定体系pH值和离子强度，以此缓冲溶液分别配制MB溶液和BSA贮备液。

测定方法：在10ml的容量瓶中，依此加入一定量的BSA,MB溶液，以缓冲溶液稀释至刻度，混匀后室温下测定荧光光谱、同步荧光光谱及与蛋白质分子比为1:1的MB吸收光谱，测定中固定BSA的浓度而改变MB浓度。

结果与讨论:MB对BSA荧光猝灭的机理外加分子与荧光体分子相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭，并有动态和静态猝灭之分。

通过观察MB对BSA 猝灭曲线（图2）可知，对于MB 从低到高整个浓度范围内曲线都呈现出好的线性，表明室温下MB 对BSA 的荧光猝灭为静态过程。

为进一步证实此猝灭特征，把此过程按动态猝灭处理，即式(1)
为双分子猝灭过程速率常数，为动态猝灭常称为Stern-Volmer猝灭方程，K
Q
数，为猝灭剂不存在时荧光体分子平均寿命，猝灭剂的浓度。

而
，由于生物大分子荧光平均寿命约为，故可由猝灭曲线的斜率求得猝灭常数。

由图2实验数据，按式（1）可以求得MB对BSA
猝灭的，而各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为，显然MB对BSA荧光的猝灭过程速率常数远大于扩散控制的，可见其猝灭过程确
为形成化合物所引起的静态猝灭，而不是由于动态碰撞引起的动态猝灭。

在静态猝灭作用中，静态猝灭荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光体-猝灭剂分子间的结合常数表达式推导求出。

设生物大分子P与药物D成键时有n个等同且独立
的结合位置，则有下述反应：其中为生成物，相应的结合常数为
设生物大分子的总浓度为，药物的总浓度为，则由反应（2）的计量关系可得：。

当反应体系中仅有生物大分子P为荧光体时，则有，这里分别为加入和不加入药物D时浓度为的生物大分子溶液的荧光强度。

将这些浓度关系代入
式（3）可得固
定浓度而改变，按式（4）的线性关系可以确定与n。

根据图2 的MB对BSA荧光发射谱的猝灭关系，将343nm处的相对荧光强度实验数据按式（4）以对做一元线性回归，由回归系数可进一步求出MB 与BSA 反应时的结合常数，结合
位点数n=1.03，相应的线性相关系数为0.9988。

这一结果表明MB与BSA有较强的结合作用，且可形成一个结合位点，并服从独立等同的位点结合模型。

若小分子化合物与血清白蛋白的结合为顺序结合，则依据非辐射能量转移机制可以求出小分子的结合位置与蛋白质分子中产生荧光的残基间的距离。

按能量转移理论，转移效率E与授体-受体间距离r及临界能量距离
相关，这里是
时的临界距离式中，为偶极空间取向子，N为介质的折射指数，为授体的光量子效率，J为授体（蛋白质）荧光发射光谱与受体（药物）吸收光谱间的光谱重叠积分，可表示为
其中为授体在波长r处的荧光强度，则为受体在波长r处的摩尔消光系数，能量转移
效率E可按下式确定：图3为MB 与BSA分子比为1:1时的吸收光谱及BSA荧光光谱的重叠光谱图。

将图中谱重叠部分（300-500nm的波长范围）分割成极小的矩形面积求和，得重叠积分
J=1.27810-15cm.(mol/L)。

BSA有两个色氨酸残基，分别位第134 位和212位，而BSA 的荧光主要来自于第212位的色氨酸残基。

在
上述实验条件下，取色氨酸残基量子效率,N取水和有机物的平均值1.366，取向因子取授体’受体各向随机分布的平值2/3，将以上各量代入式（6），
求得临界距离，由式（8）及图2荧光强度（分子比1:1）得能量转
移效率E=0.54，进而按式（5）得BSA中第212位色氨酸残基与MB 分子间的距离.r=1.67nm.
固定激发波长与发射波长的间距，同步扫描激发和发射单色器即得同步荧光光谱。

这光谱已被用于蛋白质构象变化的分析，由=15nm所得的同步荧光只显示蛋白质酪氨酸残基的光谱特性，而=60nm同步荧光仅表现出色氨酸
残基的荧光。

因残基的最大发射波长与其所处环境之极性有关，故由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化。

固定BSA的浓度，逐渐增加MB的浓度，绘制BSA 的同步荧光光谱。

图4(a)和（b）分别为BSA中的色氨酸和酪氨酸残基的荧光谱图，可以看出在此实验条件下BSA的荧光主要源于色氨酸残基，且随MB浓度增大，色氨酸的最大荧光发射波长有一定的蓝移，而酪氨酸的最大发射波长产生红移，表明MB的加入引起了BSA的构象变化。