荧光光谱法研究亚甲基蓝与蛋白质的结合反应
实验验证亚甲基蓝测蛋白质含量的可靠性
实验验证亚甲基蓝测蛋白质含量的可靠性
简介
本文档旨在讨论亚甲基蓝作为测量蛋白质含量的可靠性。
亚甲基蓝是一种广泛应用于生物学实验中的染色剂，常被用于测定蛋白质含量。
我们将探讨使用亚甲基蓝的优点和局限性，并进行一系列实验来验证其可靠性。
优点
- 亚甲基蓝是一种价格相对较低的染色剂，易于获得和使用。
- 它与蛋白质结合紧密，不易与其他物质相互作用，从而减少了测量误差的可能性。
- 亚甲基蓝对不同类型的蛋白质都有较好的反应性，使其适用于各种样品。
局限性
- 亚甲基蓝与蛋白质的反应是基于吸光度的测量，而非直接定量。
因此，测得的结果只能提供蛋白质含量的相对信息。
- 亚甲基蓝对某些蛋白质不够敏感，可能导致低测量值误差。
- 在使用亚甲基蓝进行测量时，可能会出现与其他物质的非特
异性结合，从而干扰蛋白质含量的准确测量。
实验验证
我们将设计一系列实验来验证亚甲基蓝测蛋白质含量的可靠性。
实验包括以下步骤：
1. 准备一系列已知蛋白质浓度的样品。
2. 使用亚甲基蓝染色方法对样品进行处理。
3. 通过吸光度测量法确定处理后样品的吸光度值。
4. 使用标准曲线对吸光度值进行校正，以获得相对蛋白质含量。
结论
通过一系列实验证明，亚甲基蓝是一种可靠的用于测量蛋白质
含量的方法。
尽管存在一些局限性，亚甲基蓝的优点仍然使其成为
一种常用的选择。
对于大多数实验室，亚甲基蓝是一种简便且经济
的方法，可以提供对蛋白质含量的相对测量。
但在特定研究领域或
需要精确定量的情况下，可能需要考虑其他更精确的方法。
时间分辨光谱技术研究亚甲基蓝与小牛胸腺DNA的相互作用
态电荷转移生成 自由基 ， 称为 Ｉ 型反应．当 Ｍ Ｂ的浓度较高时， Ｂ自身就可以作为还原剂 ； Ｍ 在低浓 度 （ ０ ｍ ｌＬ 的 ＭＢ溶液 中 ，ＭＢ对 自身 的 Ｉ型反 应 可 以忽 略 ，同 时在 该浓 度 下 ＭＢ主 要 以单 体 １ ｏ ） Ｘ１ ／ 存 在 ¨ 基 态 ＭＢ分 子与 的 Ⅱ型 （ ； Ｏ 化学猝 灭 ） 自氧 化反 应 可 以忽 略 ．ＭＢ具 有 高 的光 敏 化单 态 氧 量 子产率（ ０５ ， ． ） 本实验采用偏离强吸收带波长 的 ５２ｎ ３ ｍ脉 冲光激发得到 了较强的单态氧发射信
刘 涛等 ：时间分辨光谱技 术研 究亚 甲基蓝与 小牛胸腺 Ｄ Ａ的相互作用 Ｎ
公 司 ） ３ Ｄ １０ Ｐ型长通 滤光 片和 １ ５ ＷＢ ０ ； Ｒ Ｉ０ Ｌ ２ ０ １０型带通 滤光 片 （ 国 Ｏ ｉ 美 ｍｇ 司 ） ａ公 ．
１ ２ 实验 方法 ．
用重水充分溶解 ｃ Ｎ 于 ４ｑ下静置 ２ ． ｔ Ａ， Ｄ Ｃ ４ｈ 将适量的 Ｍ Ｂ晶体溶 于重水 中， 配制成浓度为 １ × １ ｍｏ Ｌ的 ＭＢ溶 液 ．保持 ＭＢ的浓 度为 １×１ ｍ ｌＬ ０ ｌ ／ ０一 ｏ ，配 制 ８份不 同浓 度 比例 的 ｃ Ｎ — ／ ｔ ＡＭＢ混合 Ｄ
Ｔ ９ １ Ｕ ０ 双光束型紫外一 可见分光光度计 （ 北京普析通用仪器有限公司） Ｓｅｔ Ｐｏ ０ ｉ ； ｐｃａｒ ３ ０ 光谱仪 ｒ
（ 国 Ａ ｔｎ 司 ） Ｙ 一０ Ｃ型皮 秒激 光器 （ 国 Ｑ ａｔｍ公 司 ） Ｓ ４ ５型前置 放大 器 和 Ｓ ４０型 多 美 ｃ 公 ｏ ； Ｇ ３０ 法 ｕｎｕ ；Ｒ４ Ｒ３ 通 道信 号平 均器 （ 国 Ｓａｆｒ ｅｅｒｈＳｓ ｍ ） 美 ｔ ｏｄＲ ｓａ ｙｔ ｓ ；Ｈ１３０４ ｎ ｃ ｅ ０ ３－５型 近红 外 光 电倍 增 管 （日本 Ｈａ ｍ ｔ ｍａ ａｓ ｕ
荧光光谱法研究亚甲基蓝与蛋白质的结合反应
荧光光谱法在生物分析中的应用---亚甲基蓝与蛋白质的结合反应刘超-生物化工-2009010236荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段。
荧光测试中的发射峰特征、荧光偏振、能量转移及荧光寿命等指标可以对蛋白质分子中荧光生色基团的结构及其所处的微环境提供有用的信息。
在生物体中，蛋白质是必不可少的生命物质，有关蛋白质的各类研究，是目前生命科学、化学和临床医学中共同关注和感兴趣的课题。
亚甲基蓝是一种具有平面结构（结构式见图1）的碱性生物染色剂，在医学临床诊断及化学分析中已有较长的应用历史，且可用于亚硝酸盐、磺氨类、氰化物及一氧化碳等中毒的解毒药。
近年来又发现MB对DNA具有插入作用，MB可被用于抗癌药物的体外筛选；此外MB的光化学性质及作用机理与血卟啉很相似，被认为可能成为一种新型光敏剂而用于癌症的光化学治疗。
新近的研究还表明MB在溶液中分子的聚集状态与溶剂及介质有关。
本文应用荧光光谱法研究了人体生理pH值条件下，亚甲基蓝与牛血清白蛋白间的相互作用，测定了结合常数、结合位点数及结合距离，从而由分子水平的角度认识蛋白质分子与小分子之间相互作用的机理，为生命科学研究提供有用的信息和数据。
实验方法：配制0.05mol/L的Tris-HCl并含0.10mol/LNaCl的缓冲溶液(pH=7.0),恒定体系pH值和离子强度，以此缓冲溶液分别配制MB溶液和BSA贮备液。
测定方法：在10ml的容量瓶中，依此加入一定量的BSA,MB溶液，以缓冲溶液稀释至刻度，混匀后室温下测定荧光光谱、同步荧光光谱及与蛋白质分子比为1:1的MB吸收光谱，测定中固定BSA的浓度而改变MB浓度。
结果与讨论:MB对BSA荧光猝灭的机理外加分子与荧光体分子相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭，并有动态和静态猝灭之分。
通过观察MB对BSA 猝灭曲线（图2）可知，对于MB 从低到高整个浓度范围内曲线都呈现出好的线性，表明室温下MB 对BSA 的荧光猝灭为静态过程。
荧光光谱法在蛋白质研究中的应用
如 果 这 时 分 子通 过 发 射 相应 的光 量子 来 释放 剩 余 能
量 而 回到基 态 的各 个 不 同 的 振 动 能 级 ， 产 生 了荧 就 光 。因此 ， 低 第 一 级 电 子 激 发 态 振 动 能 级 是 产 生 最 荧 光 的基 础 。 由于 分 子发 射 荧 光 前 已有 一 部 分 能 量
Ａｂ ｔａ ｔ Ｆ ｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｓ ｅ ｔ ｏ ｃ ｐ ｉ ｅ ｙ ｍｐ ｒａ ｔ ｏ ｓ ｕ ｙ ｎ ｐ ｏ ｅｎ ｔ ｕ ｔ ｒ ｎ ｃ ｎ ｏ ｍａ ｉｎ ｓｒ ｃ ： ｌ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｐ ｃ ｒ ｓ ｏ ｙ ｓ ｖ ｒ ｉ ｏ ｔ ｎ ｆ ｒ ｔ ｄ ｉ ｇ ｒ ｔ ｉ ｓｒ ｃ ｕ ｅ ａ ｄ ｏ ｆ ｒ ｔ ｏ ｃ ａ ｇ ｓ Ｔｈ ｏ ｃ ｐ ｎ ｒｎ ｉ ｌ ｆｆｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｐ ｃ ｒ ｓ ｏ ｙ ａ ｅ ｉ ｔｏ ｕ ｅ ｔ ｉｓ ， ｈ ｎ ｔ ｅ ａ ｐ ｉａ ｉｎ ｏ ｈｎ ｅ． ｅ ｃ ｎ ｅ ｔａ ｄ ｐ ｉ ｃｐ ｅ ｏ ｌ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｓ ｅ ｔｏ ｃ ｐ ｒ ｎ ｒ ｄ ｃ ｄ ａ ｒ ｔ ｔ ｅ ｈ ｐ ｌ ｔ ｆ ｆ ｃ ｏ
4测定酶的活性em荧光光谱法是测定酶活性的一种方法主要是氨基酸中仅有芬香族氨基酸trptyrphe是发荧光根据底物或产物的荧光性质的差别来进行测定其的基团但由于三者在普通荧光光谱中的激发光谱和灵敏度要比紫外及可见分光光度法高若干个数量发射光谱相互重叠不能同时测定给研究蛋白质的工作带来困难
亚甲基蓝mb检测ros原理
亚甲基蓝mb检测ros原理
亚甲基蓝(Methylene Blue，MB)是一种常用的染色剂，常用于细
胞学、生化学和临床诊断等领域。
而亚甲基蓝MB检测ROS则是现代医
学领域中应用较广的ROS检测试剂之一，其原理如下。
ROS即活性氧自由基，是细胞生命活动中必不可少的一种物质，
但过量的活性氧自由基会破坏细胞中的结构与各种相关生物分子，从
而引发多种疾病。
因此，现代医学研究中对ROS的检测就显得尤为重要。
传统的ROS检测方法一般包括荧光分子探针法和化学方法，荧光
分子探针法通常通过观察分子的荧光强度或某个荧光基团的发射光谱
来检测ROS的含量，但其常常存在灵敏度低、特异性不高等不足；化
学方法则易受其他物质的影响、难以直观观察等问题。
而亚甲基蓝MB检测ROS则具有运行简单、灵敏度高、可靠性强
等优点。
它的原理是，亚甲基蓝MB与ROS发生氧化反应后，生成顺式
亚甲基蓝（MB+），顺式亚甲基蓝比亚甲基蓝MB+的吸收峰红移，吸收
峰在665nm处，可以通过比色法、荧光法、光谱法等方法，检测出顺
式亚甲基蓝的含量，并反映ROS的浓度。
其中，荧光法中通常用于激
发顺式亚甲基蓝而不影响其结构与性质的波长为630nm的激光。
总之，亚甲基蓝MB检测ROS是一种快速、具有较高灵敏度和可
靠性的检测方法，可广泛应用于细胞工程、基因检测、抗氧化剂筛查、药物筛选等领域，为医学研究与临床诊断提供了有力的技术支持。
荧光光谱法研究克仑特罗与蛋白质的结合作用
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第 23 卷第 1 期 分析试验室 Vol. 23. No. 1 2004 年 1 月 Chinese Journal of Analysis Laboratory 2004 - 1
2 结果与讨论 2. 1 CLT 对 BSA 荧光猝灭的机理 BSA 的内源荧光来自于分子中色氨酸残基和
Volmer 常数 。对图 1 结果做动态猝灭处理 ,得猝灭
常数 Ksv = 3. 157 ×10 LΠ mol , 直线相关系数 r =
3
019989 ,由无猝灭剂时生物大分子平均寿命 τ 0 = 10
- 8Biblioteka s得[7 ]( mol ・ τ : Kq = KsvΠ 10 LΠ s) 。 0 = 3. 157 ×
图2 BSA 的荧光光谱 ( a) 和 CLT 的吸收光谱 ( b)
Fig. 2 Fluorescence spectra of BSA (a ) and absorption spec2 tra of CL T ( b)
cBSA = cCLT = 110 × 10
-4
利用同步荧光光谱可以分析蛋白质的构象 。 同步荧光光谱即固定激发波长与发射波长的间距 Δ λ,同步扫描激发和发射单色器所得到的荧光光 λ= 15 nm 所得的同步荧光只显示蛋白质 谱 。由Δ λ = 60 nm 的同步荧 酪氨酸残基的光谱特性 , 而 Δ 光只表现色氨酸残基的荧光 。因为残基的最大发 射波长与其所处环境极性有关 ,故由发射波长的改 [9 ] 变可判断蛋白质构象的变化 。测定中 ,固定 BSA 的浓度 ,改变 CLT 的浓度 。由图 3 可以看出 BSA 的荧光主要由色氨酸残基发出 , 且随 CLT 浓度的 增大 ,色氨酸残基发射峰蓝移 ,酪氨酸发射峰红移 , 表明 CLT 的加入引起了 BSA 的构象变化 。
荧光光谱法在蛋白质研究中的应用
荧光光谱法在蛋白质研究中的应用尹燕霞;向本琼;佟丽【摘要】荧光光谱法对研究蛋白质结构及其构象变化是很重要的.描述了荧光光谱的概念、发光机理及特点,介绍了荧光光谱仪的仪器原理和结构,记述了荧光光谱技术在检测蛋白质的构象变化、蛋白质的含量和酶活性方面的具有应用.【期刊名称】《实验技术与管理》【年(卷),期】2010(027)002【总页数】5页(P33-36,40)【关键词】荧光光谱法;蛋白质;构象【作者】尹燕霞;向本琼;佟丽【作者单位】北京师范大学,生命科学学院,北京,100875;北京师范大学,生命科学学院,北京,100875;北京师范大学,生命科学学院,北京,100875【正文语种】中文【中图分类】O657.3;TQ937某些物质被一定波长的光照射时,会在较短时间内发射出波长比入射光长的光,这种光称为荧光。
荧光光谱在各方面的应用及有关的方法称为荧光光谱技术。
1.1 荧光发光机制每一个分子具有一系列分离的电子能级,每一电子能级中又有一系列的振动能级和转动能级。
当物质被光照射后,大约在10-15s内光被物质吸收,物质分子获得能量,分子内的电子跃迁到较高能级而变成激发态。
处于激发态的分子很不稳定,它首先通过内转换将部分能量转移给周围分子,回到最低电子激发态振动能级(称为第一级电子激发态振动能级),处于这一能级的分子平均寿命大约是10-8s,如果这时分子通过发射相应的光量子来释放剩余能量而回到基态的各个不同的振动能级,就产生了荧光。
因此,最低第一级电子激发态振动能级是产生荧光的基础。
由于分子发射荧光前已有一部分能量被消耗,所以荧光能量要比物质吸收的光能量小,因而荧光的发射波长总比激发波长长。
1.2 常用荧光参数荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、方法简便以及能提供较多的物理参数等优点。
因而被广泛地应用于各个研究领域。
它能提供包括激发谱、发射谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命等许多物理参数,这些参数从各个角度反映分子的构象情况,通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定量分析,而且可以推断生物大分子在各种环境下的构象变化,从而阐明蛋白质结构与功能的关系。
亚甲基蓝染色的原理
亚甲基蓝染色的原理亚甲基蓝（Methylene Blue）是一种常用的染料，广泛应用于生物学、医学等领域中。
其原理是通过与细胞内的某些成分产生特定的相互作用，从而实现染色效果。
亚甲基蓝的分子结构中含有一个碱性亚甲基蓝阴离子（B）和一个酸性次甲基蓝阳离子（C）。
这两个离子通过电荷交换作用而保持相互结合。
在水溶液中，亚甲基蓝可以完全解离为B阴离子和C阳离子。
亚甲基蓝在染色过程中，常常与细胞内的一些生物分子或结构发生特异性的化学反应。
对于细胞和组织来说，主要表现为与核酸、蛋白质和多肽等大分子化合物的相互作用。
亚甲基蓝的染色作用主要包括以下几个方面：1. 与核酸的相互作用：亚甲基蓝可以通过静电相互作用或氢键形成复合物与DNA或RNA分子相结合。
当亚甲基蓝与DNA分子结合时，可以通过两种机制实现染色效果：一种是静电相互作用，亚甲基蓝的阳离子与DNA的阴离子相互吸引；另一种是插入机制，亚甲基蓝的分子结构可以插入到DNA的双链结构中，从而与DNA分子相互作用并染色。
2. 与蛋白质的相互作用：亚甲基蓝可以通过静电相互作用、氢键和范德华力等力作用与蛋白质结合。
与DNA分子不同，亚甲基蓝与蛋白质的结合是非特异性的，即亚甲基蓝可以与细胞中的各种蛋白质结合而染色。
这种染色机制主要是利用亚甲基蓝分子结构的亲脂性，与蛋白质亲和力的形成。
3. 与细胞内其他小分子的相互作用：亚甲基蓝还可以通过与细胞内其他小分子的氧化还原反应形成某些特定的有色产物。
例如，亚甲基蓝与细胞内的一些氧化还原酶如谷胱甘肽还原酶等反应，会形成蓝色的氧化产物。
这种染色机制主要是利用亚甲基蓝作为还原剂，与细胞内的氧化产物发生反应而形成染色的产物。
总的来说，亚甲基蓝染色的原理是通过与细胞内大分子化合物如DNA、RNA和蛋白质等发生特异性的相互作用，从而实现染色效果。
亚甲基蓝的分子结构中含有碱性离子和酸性离子，可以与细胞内的化合物发生电荷交换作用。
在染色过程中，亚甲基蓝还可以通过与细胞内其他小分子的反应形成染色产物。
荧光光谱法研究昂丹司琼与人血清白蛋白的相互作用
荧光光谱法研究昂丹司琼与人血清白蛋白的相互作用王琛【摘要】目的利用荧光光谱法研究昂丹司琼(OND)与人血清白蛋白(HSA)的相互作用。
方法采用荧光光谱法。
结果在296K和310K时OND与HSA的结合常数分别为3.24×104L/mol，4.68×104L/mol，热力学参数ΔH为20.08kJ/mol。
结论 OND对HSA的荧光猝灭机制主要为静态猝灭，二者有一个结合位点，其作用力类型以疏水作用力为主。
% Objective Study on the interaetion for human serum albumin with ondansetron by Fluorescence Spectrometry. Methods Fluorescence spectrometry was used. Results The binding constants were 3.24×104 L/mol, 4.68×104 L/mol. The thermodynamic parametersΔH was 20.08kJ/mol. Conclusion The fluorescence quenchin g of HSA by OND indicated that the quenching mechanism was a static quenching, and the thermodynamic parameters showed that the interaction of OND and HSA was mainly driven by hydrophobic force.【期刊名称】《中国医药指南》【年(卷),期】2013(000)015【总页数】3页(P10-11,12)【关键词】昂丹司琼;人血清白蛋白;荧光光谱【作者】王琛【作者单位】山西医科大学，山西太原 030001; 山西省眼科医院，山西太原030002【正文语种】中文【中图分类】R914昂丹司琼（Ondansetron，OND）为一种新型强效、高度选择性的5-HT3受体拮抗剂，已广泛地应用于治疗各种原因所致的恶心、呕吐[1-2]。
荧光光谱在蛋白质结构中的应用
对实验准确性的一些影响因子
环境 溶剂 温度 pH
环境极性的影响
光谱在极性溶剂中蓝移 Tyr的吸收在极性溶剂中更加微弱
溶剂的吸收
பைடு நூலகம் 温度
荧光一般随温度上升而减弱，所以荧光实验需要恒温
Tyr的吸收谱与pH有关
没有考虑Tyr在蛋白质 的外部还是内部
与环境的极性有关
主要参考文献
1. 王守业; 徐小龙; 刘清亮; 解永树：荧光光谱在蛋 白质分子构象研究中的应用；化学进展 （Progress In Chemistry）;2001年 04期;
荧光光谱的相关概念
1、激发光谱 2、发射光谱 3、荧光寿命和荧光量子产率 4、荧光强度与溶液浓度的关系
1、激发光谱
激发光谱是指引起荧光的激发辐射在不同 波长的相对效率。把荧光样品放入光路之 后，选择合适的发射波长与狭缝宽度，并 使之固定不变，然后令激发单色器扫描， 即可得到激发光谱。激发光谱的形状与选 择的发射波长无关，但其相对强度与所选 择的发射波长有关。发射波长固定在它的 峰位时，所得的激发光谱最大。
蛋白质中含苯基侧链的氨基酸的紫外吸收光谱
总结
T rp、Tyr 以及Phe 由于其侧链生色基团的不同而有 不同的荧光激发和发射光谱。其中T rp 的荧光强度 最大, Tyr 次之, Phe 最小。因为蛋白质的荧光通常在 280 nm 或更长的波长被激发,Phe 在绝大多数实验条 件下不被激发, 所以很少能观察到Phe 的发射。这样 蛋白质的内源荧光主要来自T rp 和Tyr 残基。T rp 残 基对微环境的变化很敏感, 并且大多数蛋白质中都 含有几个不同种类的T rp 残基, 而且在Trp存在的条 件下，Tyr吸收的能量常常不是自己通过荧光发射释 放出来，而是传递给Trp，由Trp发出荧光。因而常 将Trp作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的 构象。
基于光波导分光光谱技术研究蛋白质与亚甲基蓝的竞争吸附行为
（ｔ ｅ ｅ ａ ｏａｏｙ ｆＴａｓｕｅ ｅｈ ｏｏｙ Ｉｓｔｔ ｏ Ｅｅ ｔ ｎｃ， ｈｎｓ ｃｄｍ Ｓｉｎｅ， Ｓａ ｙ ｂ ｒｔ ｒｎｄ ｃｒ ｃ ｎ ｌ ，ｎｔｕｅ ｆ ｌ ｒ ｉ Ｃ ｉｅｅ ａ ｅ ｙｏ ｃｅｃｓ ｔＫ Ｌ ｒｏ Ｔ ｇ ｉ ｃｏ ｓ Ａ ｆ
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[学位论文]荧光光谱法研究DNA和蛋白质的相互作用
![[学位论文]荧光光谱法研究DNA和蛋白质的相互作用](https://img.taocdn.com/s3/m/9ea4d2a768dc5022aaea998fcc22bcd126ff4224.png)
摘要摘要蛋白质和核酸是组成生命的主要生物大分子，研究蛋白质和核酸的相互作用，发展能对重要蛋白质进行实时检测的高灵敏度的分析方法是后基因组时期重要的研究领域之一。
本论文工作围绕发展荧光光谱法研究DNA/蛋白质相互作用性质机理以及利用DNA/蛋白质特异相互作用发展蛋白质检测新方法两个方面开展工作，论文的主要内容包括：1. 利用荧光各向异性法详细研究了DNA甲基化转移酶M.Eco R I与两种不同链长DNA的相互作用，得到不同温度下的结合常数和它们结合的热力学参数。
表明M.Eco R I与短链DNA的结合强于与长链DNA的结合。
M.Eco R I与靶向DNA的结合过程是熵驱动的。
为理解DNA和M.Eco R I相互作用机理和调控DNA和M.Eco R I的结合提供了新的信息。
2. 用荧光共振能量转移的方法研究了M.Eco R I与标记荧光给体和受体的DNA结合后诱导的DNA弯曲，在溶液中直接测得DNA的弯曲角度为57.8°。
3. 进一步探讨了在单分子水平研究M.Eco R I诱导DNA弯曲的实验方法和条件。
实现了单对荧光分子标记DNA的双波长同时成像，为利用单分子荧光共振能量转移研究DNA弯曲打下了基础。
4. 利用单链DNA核酸适体既可以与靶蛋白特异结合又能与互补寡聚核苷酸形成双链的特点，以α-凝血酶为模型体系，发展了一种基于核酸适体和DNA光开关配合物[Ru(phen)2(dppz)]2+的蛋白质检测新方法，该方法具有灵敏度高、选择性高，无需对核酸适体进行荧光标记，适合于不同构象核酸适体等优点，对于促进核酸适体在生物分子的实时监测分析、生物传感器等方面的应用有重要意义。
关键词： DNA甲基化转移酶，DNA结合蛋白，DNA弯曲，核酸适体，光开关配合物，α-凝血酶I荧光光谱法研究DNA和蛋白质的相互作用AbstractBaocheng Ma( Physical Chemistry)Supervised by Prof. Xiaohong FangProtein and nucleic acid are two classes of important biomacromolecules in biological systems. The study of protein-nucleic acid interaction and the development of analytic methods with high sensitivity and specificity for real-time protein monitoring are of particularly interest in post-genomic era.In this dissertation, we have developed the fluorescence spectroscopic methods to study the DNA-protein interaction and to detect protein using novel DNA probes. The major results are shown as following:1. Fluorescence anisotropy has been applied to study the interaction between Eco RIDNA methyltransferase (M.Eco RI), and its two target DNA fragments in solution.Their binding constants at different temperatures from 20 to 40 ℃ were obtained and the thermodynamic parameters of binding were derived. The results showed M.Eco RI had higher binding affinity to the short dsDNA than that to the long one, and its binding to DNA was primarily entropy driven. This provides the new information for the understanding of the forces that drive M.Eco R I-DNA complex formation, and for research on the regulation and control of the interaction between DNA and M.Eco R I.2. The M.Eco R I binding induced distance change between the donor FAM and theacceptor TMR labeled at the tow ends of 20bp dsDNA containing GAATTC has been studied by fluorescence resonance energy transfer. The bending angle of DNA was measured directly in solution as 57.8°.3. The study of DNA bending by M.Eco R I binding at the single molecule level hasbeen further explored. Single molecule imaging of the dual labeled DNA immobilized on the coverslips has been achieved by total internal reflectionAbstractfluorescence microscopy equipped with a dual-view system. This provides the basis for the application of single-pair fluorescence resonance energy transfer to DNA bending study.4. Taking the advantage of the dual natural property of DNA aptamers that can notspecifically binds with target proteins but also form duplexes with their complementary oligonucletides, and the DNA light switching probe of [Ru(phen)2(dppz)]2+, we have developed a new label-free method for protein detection which can be used for the aptamer probes with different foldings. Using α-thrombin as a model protein, the results showed high sensitivity and specificity.The newly developed signaling strategy is expected to promote the exploitation and application of aptamers in biochemical and biomedical studies.Keywords: DNA methyltransferase, DNA binding protein, DNA bending, aptamer, light switching complex, α-thrombin.荧光光谱法研究DNA和蛋白质的相互作用目录摘要 (I)Abstract (III)第一章 引言 (1)第一节 DNA和蛋白质相互作用的研究方法 (1)第二节 荧光光谱法研究DNA和蛋白质的相互作用 (5)第三节 新型蛋白质探针—核酸适体的研究进展 (27)第四节 本论文的选题意义 (37)参考文献 (39)第二章 甲基化转移酶M.Eco R I和DNA结合的热力学性质研究 (56)2.1 引言 (56)2.2 实验部分 (58)2.3 结果与讨论 (61)2.4 小结 (68)参考文献 (69)第三章 荧光共振能量转移研究M.Eco R I所引起的DNA弯曲 (73)3.1. 引言 (73)3.2. 实验部分 (78)3.3. 结果与讨论 (79)3.4. 小结 (85)参考文献 (85)第四章 单分子荧光共振能量转移研究M.Eco R I所引起的DNA弯曲 (91)4.1. 引言 (91)4.2. 实验方法及数据处理 (91)4.3. 结果与讨论 (95)4.4. 小结 (101)参考文献 (102)第五章 基于核酸适体/互补DNA和光开关配合物检测蛋白质 (104)5.1 引言 (104)5.2 实验部分 (109)5.3 结果与讨论 (110)5.4 小结 (115)参考文献 (116)第六章 结论 (120)攻读博士期间发表的论文 (122)致谢 (123)第一章 引言生命科学是20世纪最重要的前沿领域之一，其重点在于了解各种生命活性物质的结构、功能及它们之间的相互关系。
荧光光谱在蛋白质研究中实际应用
3. Zn2+对氨基酰化 酶的影响: 荧光降低且红移, Trp从疏水内部向 外部移动.
荧光光谱在蛋白质研究中实际应用
4. 外源荧光的应用
荧光光谱在蛋白质研究中实际应用
5、共振能量转移
荧光光谱在蛋白质研究中实际应用
荧光共振能量（FRET）转移及应用
辐射能量转移 荧光分子发射的荧光为某一物质分子吸收，前
33
荧光素
荧光素
44
BODIPY FL4
BODIPY FL
57
BODIPY FL
四甲基罗丹明
四甲基罗丹明
CY5
53
1-氯蒽
苝
41
1-氯蒽
红荧烯
38
1-氰蒽
红荧烯
84
菲
荧光素
35*
三苯胺
叶绿素
54*
N,N-二甲胺
9-甲蒽
24*
*三重态-单重态能量转移；1.5-[[[(碘乙酰)氨基]乙基]氨基]萘－1-磺酸;
k A1
k B2
C
30
25
20
15
10
5
0
0
1
2
3
4
荧光光谱T在im蛋白e质(研s究) 中实际应用
2. Ca2+对 phosphocalsequestri n蛋白的影响
亚甲基蓝荧光拍摄激发波长
亚甲基蓝荧光拍摄激发波长亚甲基蓝荧光拍摄技术是一种多功能的光度学技术，它可以用来对存在于生物样品中的某些化学物质进行测试。
该技术可以快速、准确地测定发出荧光的样品中的激发波长，从而实现对物质的准确鉴定。
它的原理是，当光与样品中的某种物质接触时，光被激发，会发出从激发波长到荧光波长的荧光谱。
以亚甲基蓝为原料，可以制造出对恶唑啉、酞菁和脯氨酸等化合物有着特异的激发光谱的荧光染料。
亚甲基蓝荧光拍摄技术的典型应用之一就是临床化学鉴定。
通过利用不同波长范围的光激发亚甲基蓝染料，可以测出样品中激发波长的不同特性，从而进行更准确的物质鉴定。
例如，使用400nm至450nm 的入射光对血清标本进行测试，可以检测出血清的磷脂；使用450nm 至500nm的入射光对其进行测试，可以检测出其中的总蛋白。
另外，该技术也可以用来检测生物样品中的抗药性物质，从而快速、准确地判定出抗性菌株。
亚甲基蓝荧光拍摄技术可以检测出耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA），以及耐羟氯喹青霉素（MDR-Acinetobacter baumannii），从而做出更准确、及时的抗药性判断。
此外，亚甲基蓝荧光技术还可以用于生物技术实验，如，蛋白质的印迹实验中的抗原提取和介质调节，以及DNA片段定位和染料示性实验中的扩增和检测。
它还可以用于微生物培养和菌落紊乱分析，以及病毒检测等等。
亚甲基蓝荧光拍摄技术可以为各种生化实验提供有效的激发波长，从而提高实验效率，为临床化学鉴定提供准确的报告，为病毒检测提供结果。
而它最重要的优势就是，以最少的成本可以准确、及时的实现对生物样品中的某些物质的测定，为各项生物技术实验提供有效的激发波长，大大提高了检测的效率和准确性。
因此，亚甲基蓝荧光拍摄技术不仅可以用于日常的生物实验和临床实验，也可以用于精准医学、药物开发和抗药性监测等方面，有助于提高实验的准确性和效率。
总之，亚甲基蓝荧光拍摄技术是一把二刃剑，它可以提高所有生物技术实验的准确性和可靠性，并实现对物质的准确鉴定，这使它在临床实验、病菌检测和抗药性监测中具有重要的作用。
亚甲基蓝荧光拍摄激发波长
亚甲基蓝荧光拍摄激发波长亚甲基蓝荧光拍摄技术是一项重要的科研分析方法，可以用于识别激发波长。
它可以帮助科学家们进行生物物质平衡调查，研究蛋白质结构，研究生物体膜膜特性等研究工作。
研究人员可以利用这种技术测量不同物质吸收光子，从而获得有关激发波长的信息。
亚甲基蓝荧光拍摄是一种采用亚甲基蓝荧光染料探测激发波长的技术。
主要原理是将被激发的亚甲基蓝荧光染料和反射光结合起来，亚甲基蓝荧光染料对激发光的反应极其灵敏，可以检测激发光的最小变化。
例如，当发射光的波长和激发光的波长有所偏差时，激发光将不能被检测到，因此可以确定激发光的波长。
亚甲基蓝荧光拍摄技术的优势在于它能够准确测量微小的变化，通常可以测量毫米级的差异，甚至微微变化也可以被检测到。
它也具有良好的灵敏度，可以测量激发光的强度以及发射光波长的变化。
另外，亚甲基蓝荧光拍摄技术可以同时测量多种不同波长的荧光，从而获得不同层面的信息。
亚甲基蓝荧光拍摄技术通常用于生物医学和化学研究中。
在生物医学领域，研究人员可以利用这种技术来研究细胞的能量转移过程，用于检测药物的细胞内移动及其作用机制，以及用于研究细胞系统内蛋白质和其他分子之间的相互作用。
此外，它还可以用于分析细胞膜特性，以及研究细胞表观遗传学。
在化学领域，研究人员可以使用这种技术来研究不同物质的光谱特性，可以用于分析平衡状态，研究分子结构，以及分析物质的光子学性质。
亚甲基蓝荧光拍摄技术的缺点在于它需要一定的操作复杂度。
研究人员需要适当的设备来检测特定的波长，而且可能还需要使用复杂的算法来计算激发波长。
另外，这种技术也可能会耗费较多的时间，因此它可能不适用于在大规模研究中应用。
总之，亚甲基蓝荧光拍摄技术是一种重要的科学分析方法，可以用于识别激发波长，有助于研究人员更好地探索物质的结构和功能。
evans blue peroxynitrite 测定原理
Evans Blue是一种具有吸附性能的分子，它可以与蛋白质非共价结合而不影响其功能。
Peroxynitrite是一种反应性氮物质，它与多种生物大分子如蛋白质、核酸等发生反应，
从而引起细胞损伤和炎症反应，甚至导致细胞死亡。
测定Peroxynitrite的方法之一就是使用Evans Blue作为指示剂。
测定过程如下：
1. 首先，将待测样品与Evans Blue混合，在一定的条件下使其反应。
2. Peroxynitrite会导致Evans Blue与蛋白质结合，从而改变其光谱特性。
测量反应体系
的吸收光谱（通常为620nm和680nm），可以计算出相对于Evans Blue的蛋白质结合量。
3. 根据吸光度的变化量，可以推算出反应中Peroxynitrite的含量。
该方法具有快速、灵敏、专属性高等优点，被广泛应用于生物医学领域中对Peroxynitrite产生及相关疾病的研究。
亚甲基蓝染色原理
亚甲基蓝染色原理亚甲基蓝是一种常用的生物染色剂，广泛应用于生物学和医学领域。
它的染色原理主要是利用其分子结构的特殊性质，与生物样品中的特定成分发生化学反应，从而实现对样品的染色和显色。
下面将详细介绍亚甲基蓝染色的原理及其应用。
亚甲基蓝是一种亲电性染料，其分子中含有许多芳香环和氮原子，使得其分子具有较强的亲电性。
在生物样品中，许多生物大分子（如DNA、RNA等）都含有丰富的负电荷，而亚甲基蓝的亲电性使得它能够与这些负电荷部分发生静电作用，从而吸附在生物大分子表面。
在染色过程中，亚甲基蓝可以与DNA、RNA等生物大分子中的磷酸基团发生离子键或氢键，使得亚甲基蓝分子紧密地结合在这些分子上。
同时，亚甲基蓝分子本身也具有颜色，可以赋予生物样品明显的颜色，使得样品在显微镜下能够清晰可见。
除了静电作用外，亚甲基蓝还可以与生物大分子中的其他官能团发生化学反应。
例如，亚甲基蓝可以与蛋白质中的羟基发生氢键，与羧基发生酰胺键等，从而实现对蛋白质的染色。
这种化学反应使得亚甲基蓝在染色过程中具有较强的特异性，能够选择性地染色目标生物分子，而不影响其他成分。
亚甲基蓝染色不仅可以用于显微镜下的观察，还可以应用于凝胶电泳、蛋白质分离等实验中。
在凝胶电泳中，亚甲基蓝可以与DNA或蛋白质结合，使得其在凝胶上呈现出清晰的条带，有利于对生物分子的分离和分析。
在蛋白质分离实验中，亚甲基蓝可以与蛋白质结合并显色，帮助研究人员观察和分析蛋白质的分布和纯度。
总之，亚甲基蓝染色原理是基于其分子结构的特殊性质，与生物样品中的特定成分发生化学反应，从而实现对样品的染色和显色。
它在生物学和医学领域有着广泛的应用，为科研工作者提供了重要的实验手段，有助于对生物分子进行观察、分离和分析。
三维荧光光谱法研究桑色素与蛋白质的耦合反应
11 174 lg Cq ,相关系数 R = 01 9992 。依直线斜率和截
21 3 荧光猝灭机制的探讨 荧光猝灭作用因猝灭机制不同可分为动态猝灭和
静态 猝 灭 , 分 别 可 以 用 Stern2Volmer 方 程 和 Lin2 eweaver2Bur k 双倒数方程进行描述[4 ,5] , 由实验数据 做出了 Morin 对 BSA 荧光猝灭的 Stern2Volmer 曲线 (图 4a) 和 Lineweaver2Burk 双倒数曲线 (图 4b) ,表 1 列出了曲线的回归方程 、相关系数及猝灭常数 。
图 2 BSA( a) 及 Morin2BSA 体系( b →h) 三维荧光等高线光谱 Fig. 2 Contour spectra of BSA( a) and Morin2BSA system( from b to h)
略显红移 (285 nm →290 nm) ;从 Sto kes 位移看 :加入 Morin 后 ,荧光峰的 Sto kes 位移均略有减小 (65 nm → 531 5 nm) ;从峰的强度看 :加入 Morin 后 ,瑞利散射峰 和荧光峰的相对强度均有不同程度的降低 。在水介质 中 BSA 中的疏水基团和疏水侧链出于避开水的需要 会被迫折叠 ,这种折叠总是趋于把疏水残基包埋在分 子内部而形成疏水腔 ,BSA 与 Morin 耦合部位可能就 处于这种疏水腔中 ,因为能够发射荧光的色氨酸 、酪氨
41 320 ×104
各类荧光猝灭剂对生物大分子的动态荧光猝灭速 率常数最大为 21 0 ×1010 L ·mol - 1 ·s - 1 ,而作者由动 态猝灭常数求得 Kq = 11 121 ×1013 L ·mol - 1 ·s - 1 ;此 外紫外吸收光谱显示反应前后体系的吸收光谱明显不 同 (见图 5) ,说明 Morin 对 BSA 荧光的猝灭是因为二 者结合形成了复合物 ,应当是静态猝灭 。
光谱法研究亚甲基绿(MG)、亚甲基蓝(MB)与DNA的识别作用及纳米材料对识别作用的影响
光谱法研究亚甲基绿(MG)、亚甲基蓝(MB)与DNA的识别作用及纳米材料对识别作用的影响张仁云;王雪梅;平刚;李尧【期刊名称】《中国生物医学工程学报》【年(卷),期】2006(025)006【摘要】通过可见光谱法研究了亚甲基绿(MG)、亚甲基蓝(MB)与CT-DNA的相互作用,并且研究了纳米材料胶体金对该识别作用的影响.研究结果表明,MG、MB 与DNA相互作用方式是不相同的,尽管它们在化学结构上只存在很小的差异.MG 是以插入方式与DNA作用的,而MB与DNA作用存在沟槽和插入两种方式,并以沟槽方式为主.此外,通过在胶体金溶液中的研究表明,胶体金可以明显地提高小分子化合物与DNA作用检测的灵敏度.【总页数】4页(P776-779)【作者】张仁云;王雪梅;平刚;李尧【作者单位】东南大学生物科学与医学工程系,南京,210096;东南大学生物科学与医学工程系,南京,210096;东南大学生物科学与医学工程系,南京,210096;东南大学生物科学与医学工程系,南京,210096【正文语种】中文【中图分类】R318【相关文献】1.DNA修饰碳纳米管电极对DNA与亚甲基蓝相互作用的研究 [J], 张怀;张云怀;李静;肖鹏;乔雷;李泽全2.光谱法研究七、八元瓜环对亚甲基蓝的分子识别 [J], 冯艳;薛赛凤;牟兰;祝黔江;陶朱3.基于亚甲基蓝与DNA相互作用自铸成膜研究 [J], 甘绮婷;陈琳琳;朱耀婷;关海欣;李红4.DNA-纳米多孔羟基磷灰石修饰电极用于研究DNA与亚甲基蓝的相互作用 [J], 王桂香;潘芊秀;张京京;王怀生5.亚甲基蓝与鲱鱼精DNA相互作用的光谱法研究 [J], 费丹;王兴明;黎泓波;丁立生;胡亚敏;张欢;赵仕林因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
山梨酸钾与牛血清白蛋白相互作用的研究
山梨酸钾与牛血清白蛋白相互作用的研究周享春;金小芬;宁方秀;王映;王慧【期刊名称】《中国食品添加剂》【年(卷),期】2010(000)006【摘要】在模拟动物体生理条件下,用荧光光谱、三维荧光光谱、同步荧光光谱、紫外-可见吸收光谱法等研究了在不同温度下,山梨酸钾(PSS)与牛血清白蛋白(BSA)结合反应的光谱行为.试验发现,PSS对BSA有较强的荧光猝灭作用.用Stern-Volmer和Lineweaver-Burk方程及热力学方程分别处理试验数据,发现BSA与PSS发生反应生成了新的复合物,属于静态荧光猝灭,得到了它们相互作用的生成常数KLB(8.421×103L·mol-1)、热力学参数(ΔHθ＝-3.595kJ·mol-1,ΔSθ＝63.26J·K-1,ΔGθ＝-22.73kJ·mol-1)和结合位点数(0.970)等.位点竞争实验结果显示PSS与BSA的作用位置主要在BSA的Site I(sub-domain IIA)位.证明二者主要靠静电作用力结合,同时用三维荧光光谱及同步荧光光谱法探讨了PSS对BSA构象的影响,为研究PSS的毒性和生物学效应提供了重要信息.【总页数】7页(P107-113)【作者】周享春;金小芬;宁方秀;王映;王慧【作者单位】长江大学化学与环境工程学院,荆州,434023;长江大学化学与环境工程学院,荆州,434023;长江大学化学与环境工程学院,荆州,434023;长江大学化学与环境工程学院,荆州,434023;长江大学化学与环境工程学院,荆州,434023【正文语种】中文【中图分类】O472.3;O614.8;O657.3【相关文献】1.山梨酸钾与蛋白质相互作用的荧光和共振光散射光谱研究 [J], 胡勇;扶雄;陈旭东;杨连生;章明秋2.番泻苷A与牛血清白蛋白相互作用的研究 [J], 王健;陈圣典;王甜叶;陈俭娇;黄小权;韩茹霞;符玲3.亚甲基蓝及其代谢产物与牛血清白蛋白相互作用的研究 [J], 赵刚;杨丹;何茜;黄曦瑶;罗勇4.光谱法与计算机模拟法研究六溴环十二烷与牛血清白蛋白的相互作用 [J], 庹浔;宋继敏;付豪;吕小兰5.丹酚酸B与牛血清白蛋白相互作用的光谱学研究 [J], 张传英;彭鑫;饶恒军;齐崴;苏荣欣;何志敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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荧光光谱法在生物分析中的应用
---亚甲基蓝与蛋白质的结合反应
刘超-生物化工-2009010236
荧光光谱法是研究生物大分子与小分子、离子相互作用的重要手段。
荧光测试中的发射峰特征、荧光偏振、能量转移及荧光寿命等指标可以对蛋白质分子中荧光生色基团的结构及其所处的微环境提供有用的信息。
在生物体中，蛋白质是必不可少的生命物质，有关蛋白质的各类研究，是目前生命科学、化学和临床医学中共同关注和感兴趣的课题。
亚甲基蓝是一种具有平面结构（结构式见图1）的碱性生物染色剂，在医学临床诊断及化学分析中已有较长的应用历史，且可用于亚硝酸盐、磺氨类、氰化物及一氧化碳等中毒的解毒药。
近年来又发现MB对DNA具有插入作用，MB可被用于抗癌药物的体外筛选；此外MB的光化学性质及作用机理与血卟啉很相似，被认为可能成为一种新型光敏剂而用于癌症的光化学治疗。
新近的研究还表明MB在溶液中分子的聚集状态与溶剂及介质有关。
本文应用荧光光谱法研究了人体生理pH值条件下，亚甲基蓝与牛血清白蛋白间的相互作用，测定了结合常数、结合位点数及结合距离，从而由分子水平的角度认识蛋白质分子与小分子之间相互作用的机理，为生命科学研究提供有用的信息和数据。
实验方法：配制0.05mol/L的Tris-HCl并含0.10mol/LNaCl的缓冲溶液
(pH=7.0),恒定体系pH值和离子强度，以此缓冲溶液分别配制MB溶液和BSA贮备液。
测定方法：在10ml的容量瓶中，依此加入一定量的BSA,MB溶液，以缓冲溶液稀释至刻度，混匀后室温下测定荧光光谱、同步荧光光谱及与蛋白质分子比为1:1的MB吸收光谱，测定中固定BSA的浓度而改变MB浓度。
结果与讨论:MB对BSA荧光猝灭的机理外加分子与荧光体分子相互作用引起荧光强度降低的现象称为荧光猝灭，并有动态和静态猝灭之分。
通过观察MB对BSA 猝灭曲线（图2）可知，对于MB 从低到高整个浓度范围内曲线都呈现出好的线性，表明室温下MB 对BSA 的荧光猝灭为静态过程。
为进一步证实此猝灭特征，把此过程按动态猝灭处理，即式(1)
为双分子猝灭过程速率常数，为动态猝灭常称为Stern-Volmer猝灭方程，K
Q
数，为猝灭剂不存在时荧光体分子平均寿命，猝灭剂的浓度。
而
，由于生物大分子荧光平均寿命约为，故可由猝灭曲线的斜率求得猝灭常数。
由图2实验数据，按式（1）可以求得MB对BSA
猝灭的，而各类猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为，显然MB对BSA荧光的猝灭过程速率常数远大于扩散控制的，可见其猝灭过程确
为形成化合物所引起的静态猝灭，而不是由于动态碰撞引起的动态猝灭。
在静态猝灭作用中，静态猝灭荧光强度与猝灭剂的关系可由荧光体-猝灭剂分子间的结合常数表达式推导求出。
设生物大分子P与药物D成键时有n个等同且独立
的结合位置，则有下述反应：其中为生成物，相应的结合常数为
设生物大分子的总浓度为，药物的总浓度为，则由反应（2）的计量关系可得：。
当反应体系中仅有生物大分子P为荧光体时，则有，这里分别为加入和不加入药物D时浓度为的生物大分子溶液的荧光强度。
将这些浓度关系代入
式（3）可得固
定浓度而改变，按式（4）的线性关系可以确定与n。
根据图2 的MB对BSA荧光发射谱的猝灭关系，将343nm处的相对荧光强度实验数据按式（4）以对做一元线性回归，由回归系数可进一步求出MB 与BSA 反应时的结合常数，结合
位点数n=1.03，相应的线性相关系数为0.9988。
这一结果表明MB与BSA有较强的结合作用，且可形成一个结合位点，并服从独立等同的位点结合模型。
若小分子化合物与血清白蛋白的结合为顺序结合，则依据非辐射能量转移机制可以求出小分子的结合位置与蛋白质分子中产生荧光的残基间的距离。
按能量转移理论，转移效率E与授体-受体间距离r及临界能量距离
相关，这里是
时的临界距离式中，为偶极空间取向子，N为介质的折射指数，为授体的光量子效率，J为授体（蛋白质）荧光发射光谱与受体（药物）吸收光谱间的光谱重叠积分，可表示为
其中为授体在波长r处的荧光强度，则为受体在波长r处的摩尔消光系数，能量转移
效率E可按下式确定：图3为MB 与BSA分子比为1:1时的吸收光谱及BSA荧光光谱的重叠光谱图。
将图中谱重叠部分（300-500nm的波长范围）分割成极小的矩形面积求和，得重叠积分
J=1.27810-15cm.(mol/L)。
BSA有两个色氨酸残基，分别位第134 位和212位，而BSA 的荧光主要来自于第212位的色氨酸残基。
在
上述实验条件下，取色氨酸残基量子效率,N取水和有机物的平均值1.366，取向因子取授体’受体各向随机分布的平值2/3，将以上各量代入式（6），
求得临界距离，由式（8）及图2荧光强度（分子比1:1）得能量转
移效率E=0.54，进而按式（5）得BSA中第212位色氨酸残基与MB 分子间的距离.r=1.67nm.
固定激发波长与发射波长的间距，同步扫描激发和发射单色器即得同步荧光光谱。
这光谱已被用于蛋白质构象变化的分析，由=15nm所得的同步荧光只显示蛋白质酪氨酸残基的光谱特性，而=60nm同步荧光仅表现出色氨酸
残基的荧光。
因残基的最大发射波长与其所处环境之极性有关，故由发射波长的改变可判断蛋白质构象的变化。
固定BSA的浓度，逐渐增加MB的浓度，绘制BSA 的同步荧光光谱。
图4(a)和（b）分别为BSA中的色氨酸和酪氨酸残基的荧光谱图，可以看出在此实验条件下BSA的荧光主要源于色氨酸残基，且随MB浓度增大，色氨酸的最大荧光发射波长有一定的蓝移，而酪氨酸的最大发射波长产生红移，表明MB的加入引起了BSA的构象变化。