基因组学与应用生物学
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利用工程细菌生产胰岛素的成功促成了基因工 并广泛应用于生命科学研究的各个领域，极大推动 程的诞生和飞速发展，其研究方法与技术迅速渗透 并深刻影响着生命科学研究的进展和深度，同时也
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.028.000793 基金项目：本研究由陕西省科技厅 2009 年度自然科学基础研究计划项目、西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室开 放基金、陕西省教育厅 2009 年度重点实验室重点科研计划项目(09JS079)和陕西省教育厅 2009 年度科学研究计划项目自然科 学专项(09JK754)共同资助
Heterologous Expression Systems for the Production of Recombinant Therapeutic Protein
Dong Wenbo Chen Hongdong Hao Jianguo Li Hongmin *
Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology, Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Northwest University, Xi'an, 710069 * Corresponding author, lihm2006@nwu.edu.cn DOI: 10.3969/gab.028.000793
摘 要 利用外源蛋白表达系统生产具有重要价值的药用蛋白是现代生物技术产业的核心内容和研究热 点，也是各国政府和制药企业竞相巨额资助的研究领域之一。本文综合分析了目前用于重组药用蛋白生产的 原核表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物表达系统在表达产量、翻译后加工能 力、生产周期、生产成本、适用范围等方面的优劣以及研究现状和最新研究进展，揭示出植物表达系统将在未 来重组蛋白大规模生产中占据重要地位。但是现有的各种表达系统都无法单独实现各种重组蛋白高活性、低 成本、安全系数高的大规模生产。在相当长时间里，各种表达系统在重组蛋白生产上将长期共存。而通过遗传 改造、基因组学、蛋白质组学等研究方法不断改进各种外源蛋白表达系统的性能，不断建立更加优越的外源 蛋白表达系统则是大家共同努力的目标。 关键词 外源蛋白表达系统, 大肠杆菌, 酵母, 哺乳动物
高点之一。而我国也把以生产重组蛋白为主的生物 膜周间腔一侧信号肽被信号肽酶切除，产生成熟的
技术药物作为医药领域的重点发展方向和新的生长 点列入面向 2050 年科技发展路线图(http://www.gov. cn/jrzg/2009-06/10/content_1336915.htm)，大力推进
蛋白质(Maria and Michael, 1996)。目前已有多种信号 肽序列如周间腔蛋白 pelB、外膜蛋白 ompA 和 ompF、 枯草芽胞杆菌木聚糖酶、麦芽糖结合蛋白等天然分
1 原核表达系统
伴侣同时表达。 最近，科学家借助蛋白质组学方法，对大肠杆菌
在已经建立的外源蛋白表达系统中，大肠杆菌 菌株 K-12 (W3110) 和 B [BL21 (DE3)]的胞外蛋白质
表达系统是技术最成熟的原核表达系统。其表达周 组进行研究，寻找这些蛋白序列中高频出现的同源性
期短、表达量大(可达宿主总可溶性蛋白的 13%~30%, 甚至高达 50%以上)、操作简单、Baidu Nhomakorabea易培养和进行基因 组改造，大规模培养成本较低，在基础研究、工业用
较高的多肽基序，并在大肠杆菌细胞中分别表达其 开放读码框(ORFs)，通过检测表达产物在细胞培养 液中的含量，选择出相应多肽作为重组蛋白的载体，
酶和医用蛋白生产中应用最为广泛，已经发展并建 将重组蛋白与该载体多肽融合在一起，使大肠杆菌
立了各类菌株和载体系列(表 1)。但是大肠杆菌细胞 表达的重组蛋白直接分泌到细胞外，不仅解决了包 不能进行糖基化、不能形成正确的二硫键和空间结构， 涵体问题，而且培养基中重组蛋白的含量可以高达
现代生物技术药物的研发和产业。因此，不断改善和 泌蛋白的信号肽已广泛用于外源基因特别是真核基
建立高活性、低成本、安全性高的大规模生产药用蛋 白的外源表达系统成为各国政府及生物制药企业争 相投入大量人力、物力进行研究的重中之重。本文仅 就目前用于药用蛋白生产的原核表达系统、酵母表
因在大肠杆菌中的分泌性表达，如将 茁 - 内啡肽和 OmpF 融合后转化大肠杆菌，目的蛋白直接分泌到培 养基中(Jeong and Lee, 2002)、利用木聚糖酶信号肽 实现人粒细胞集落刺激因子在周间腔的分泌表达
Abstract Recombinant therapeutic protein production via heterologous expression systems is the crucial content and research hotspot of the modern biotechnology industry. The recent developments of prokaryotic system, yeast expression system, insect baculovirus expression system, mammalian cell as well as plants expression system, was reviewed with focus on the expression efficiency, post-translational processing capacity, production cycle/costs and the scope of application. It was showed from our investigation and analysis that the plants expression system will play an important role in large scale production of recombinant protein in the future. However, the existing systems will coexist in the long run as each of them is unable to fulfill the high activity, low-cost, high safety large-scale production of variety of recombinant protein. So, it is the common goal to improve the performance of the existing expression systems and establish more superior heterologous protein expression systems through genetic transformation, genomics and proteomics methods. Keywords Heterologous expression systems of therapeutic protein, Escherichia coli, Yeast, Mammalian
表 1 大肠杆菌表达系统及常用载体与宿主菌 Table 1 Common vectors and hosts of Escherichia coli expression system
表达系统种类 启动子 常用载体
宿主菌
优点
缺点
Expression
Promoter Common
等治疗用重组蛋白的生物技术产业产值增速强劲， 白与分子伴侣一起表达、降低培养温度、改造宿主的
作为成长性产业在医药行业中的地位越来越突出。 遗传特性、筛选更适合于外源蛋白表达的菌株等是
2006 年，仅美国售出的重组红细胞生成刺激蛋白 近些年解决上述问题的常用策略(Terpe, 2006; Chou,
(E-SPs)、单克隆抗体、集落刺激因子(G-CSFs)、人胰 2007; Mergulhao et al., 2005)。其中将外源蛋白进行
基因组学与应用生物学，2009 年，第 28 卷，第 4 期，第 793-802 页 Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.4, 793-802
专题介绍 Review
用于药用蛋白生产的外源表达系统
董文博 陈洪栋 郝建国 李红民 *
西北大学, 陕西省生物技术重点实验室, 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室, 西安, 710069 * 通讯作者, lihm2006@nwu.edu.cn
尽管如此，大肠杆菌表达系统所具有的其它表
年来，人类生活水平不断提高，健康意识不断增强， 达系统不具备的突出优点，仍然吸引着研究者不断
对各种治疗或保健用重组蛋白类药物的需求逐年攀 对其改进。将外源蛋白定位在周质空间、改变培养工
升，使以生产疫苗、免疫球蛋白、抗体和蛋白质因子 艺条件以控制菌体生长速度和乙酸积累、将外源蛋
基因组学与应用生物学 794 Genomics and Applied Biology
www.genoapplbiol.org DOI: 10.3969/gab.028.000793
推动生物技术产业在过去几十年中迅速发展为影响 未完全克服(Mahmoud, 2007)。
人类社会生活的高新技术产业之一。尤其是近二十
分的去除，造成分离纯化成本的增加等缺陷迄今尚 达性能上看，芽胞杆菌生长能力极强、容易培养、具
用于药用蛋白生产的外源表达系统 Heterologous Expression Systems for the Production of Recombinant Therapeutic Protein 795
岛素及重组人生长激素(hGH)的市值就达到 95 亿美 分泌性表达是解决上述问题的关键。实际上，大肠杆
元，而全球同类产品的市场收入约为 450 亿美元，有 菌的分泌能力很低，只有少量蛋白质能够分泌到胞
望在 2011 年达到 982 亿美元(http://guba.eastmoney. 外。研究表明，大肠杆菌分泌蛋白主要是分泌至周间
致使其应用范围一直局限在小分子量(3 500~6 000 Da) 15~500 mg/L (Qian et al., 2008; Xia et al., 2008; Choi and
非糖基化多肽的表达生产上。即使在小分子量外源 Lee, 2004; Zhang et al., 2006)。该技术与基因改造相结
达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物表 (Jeong and Lee, 2000)。由于分泌水平低和折叠困难， 达系统的现状和近年来取得的一些新进展进行综述 分泌至周间腔的重组蛋白依然容易形成包涵体。所
与分析，并探讨外源蛋白表达系统的未来发展方向。 以，较高效率的分泌表达通常会将外源基因与分子
蛋白表达生产中，外源蛋白常因过量表达而以包涵 合，有望实现外源蛋白在大肠杆菌细胞的分泌性高
体形式存在，需要复性(部分蛋白很难复性)、高密度 表达，解决包涵体问题并降低下游生产成本。
培养过程中乙酸积累造成的细胞毒性、外源蛋白经
芽胞杆菌是原核表达系统中另外一种比较常用
常与内毒素相伴表达、内毒素和热源物质等杂质成 的外源蛋白表达菌，尤其是在工业用酶生产上。从表
com/look,002038,1005281283.html)，使集中体现生命 腔，这些蛋白的 N 端一般含有一段 15~30 个氨基酸
科学和生物技术领域前沿新成就与新突破的生物技 残基和富含疏水氨基酸残基的信号肽，其 N 端携带
术创新药物研发成为 21 世纪国际间竞争的战略制 正电荷以帮助蛋白穿越细胞膜进入周间腔，在细胞
www.genoapplbiol.org/doi/10.3969/gab.028.000793 基金项目：本研究由陕西省科技厅 2009 年度自然科学基础研究计划项目、西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室开 放基金、陕西省教育厅 2009 年度重点实验室重点科研计划项目(09JS079)和陕西省教育厅 2009 年度科学研究计划项目自然科 学专项(09JK754)共同资助
Heterologous Expression Systems for the Production of Recombinant Therapeutic Protein
Dong Wenbo Chen Hongdong Hao Jianguo Li Hongmin *
Shaanxi Provincial Key Laboratory of Biotechnology, Key Laboratory of Resource Biology and Biotechnology in Western China, Ministry of Education, Northwest University, Xi'an, 710069 * Corresponding author, lihm2006@nwu.edu.cn DOI: 10.3969/gab.028.000793
摘 要 利用外源蛋白表达系统生产具有重要价值的药用蛋白是现代生物技术产业的核心内容和研究热 点，也是各国政府和制药企业竞相巨额资助的研究领域之一。本文综合分析了目前用于重组药用蛋白生产的 原核表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物表达系统在表达产量、翻译后加工能 力、生产周期、生产成本、适用范围等方面的优劣以及研究现状和最新研究进展，揭示出植物表达系统将在未 来重组蛋白大规模生产中占据重要地位。但是现有的各种表达系统都无法单独实现各种重组蛋白高活性、低 成本、安全系数高的大规模生产。在相当长时间里，各种表达系统在重组蛋白生产上将长期共存。而通过遗传 改造、基因组学、蛋白质组学等研究方法不断改进各种外源蛋白表达系统的性能，不断建立更加优越的外源 蛋白表达系统则是大家共同努力的目标。 关键词 外源蛋白表达系统, 大肠杆菌, 酵母, 哺乳动物
高点之一。而我国也把以生产重组蛋白为主的生物 膜周间腔一侧信号肽被信号肽酶切除，产生成熟的
技术药物作为医药领域的重点发展方向和新的生长 点列入面向 2050 年科技发展路线图(http://www.gov. cn/jrzg/2009-06/10/content_1336915.htm)，大力推进
蛋白质(Maria and Michael, 1996)。目前已有多种信号 肽序列如周间腔蛋白 pelB、外膜蛋白 ompA 和 ompF、 枯草芽胞杆菌木聚糖酶、麦芽糖结合蛋白等天然分
1 原核表达系统
伴侣同时表达。 最近，科学家借助蛋白质组学方法，对大肠杆菌
在已经建立的外源蛋白表达系统中，大肠杆菌 菌株 K-12 (W3110) 和 B [BL21 (DE3)]的胞外蛋白质
表达系统是技术最成熟的原核表达系统。其表达周 组进行研究，寻找这些蛋白序列中高频出现的同源性
期短、表达量大(可达宿主总可溶性蛋白的 13%~30%, 甚至高达 50%以上)、操作简单、Baidu Nhomakorabea易培养和进行基因 组改造，大规模培养成本较低，在基础研究、工业用
较高的多肽基序，并在大肠杆菌细胞中分别表达其 开放读码框(ORFs)，通过检测表达产物在细胞培养 液中的含量，选择出相应多肽作为重组蛋白的载体，
酶和医用蛋白生产中应用最为广泛，已经发展并建 将重组蛋白与该载体多肽融合在一起，使大肠杆菌
立了各类菌株和载体系列(表 1)。但是大肠杆菌细胞 表达的重组蛋白直接分泌到细胞外，不仅解决了包 不能进行糖基化、不能形成正确的二硫键和空间结构， 涵体问题，而且培养基中重组蛋白的含量可以高达
现代生物技术药物的研发和产业。因此，不断改善和 泌蛋白的信号肽已广泛用于外源基因特别是真核基
建立高活性、低成本、安全性高的大规模生产药用蛋 白的外源表达系统成为各国政府及生物制药企业争 相投入大量人力、物力进行研究的重中之重。本文仅 就目前用于药用蛋白生产的原核表达系统、酵母表
因在大肠杆菌中的分泌性表达，如将 茁 - 内啡肽和 OmpF 融合后转化大肠杆菌，目的蛋白直接分泌到培 养基中(Jeong and Lee, 2002)、利用木聚糖酶信号肽 实现人粒细胞集落刺激因子在周间腔的分泌表达
Abstract Recombinant therapeutic protein production via heterologous expression systems is the crucial content and research hotspot of the modern biotechnology industry. The recent developments of prokaryotic system, yeast expression system, insect baculovirus expression system, mammalian cell as well as plants expression system, was reviewed with focus on the expression efficiency, post-translational processing capacity, production cycle/costs and the scope of application. It was showed from our investigation and analysis that the plants expression system will play an important role in large scale production of recombinant protein in the future. However, the existing systems will coexist in the long run as each of them is unable to fulfill the high activity, low-cost, high safety large-scale production of variety of recombinant protein. So, it is the common goal to improve the performance of the existing expression systems and establish more superior heterologous protein expression systems through genetic transformation, genomics and proteomics methods. Keywords Heterologous expression systems of therapeutic protein, Escherichia coli, Yeast, Mammalian
表 1 大肠杆菌表达系统及常用载体与宿主菌 Table 1 Common vectors and hosts of Escherichia coli expression system
表达系统种类 启动子 常用载体
宿主菌
优点
缺点
Expression
Promoter Common
等治疗用重组蛋白的生物技术产业产值增速强劲， 白与分子伴侣一起表达、降低培养温度、改造宿主的
作为成长性产业在医药行业中的地位越来越突出。 遗传特性、筛选更适合于外源蛋白表达的菌株等是
2006 年，仅美国售出的重组红细胞生成刺激蛋白 近些年解决上述问题的常用策略(Terpe, 2006; Chou,
(E-SPs)、单克隆抗体、集落刺激因子(G-CSFs)、人胰 2007; Mergulhao et al., 2005)。其中将外源蛋白进行
基因组学与应用生物学，2009 年，第 28 卷，第 4 期，第 793-802 页 Genomics and Applied Biology, 2009, Vol.28, No.4, 793-802
专题介绍 Review
用于药用蛋白生产的外源表达系统
董文博 陈洪栋 郝建国 李红民 *
西北大学, 陕西省生物技术重点实验室, 西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室, 西安, 710069 * 通讯作者, lihm2006@nwu.edu.cn
尽管如此，大肠杆菌表达系统所具有的其它表
年来，人类生活水平不断提高，健康意识不断增强， 达系统不具备的突出优点，仍然吸引着研究者不断
对各种治疗或保健用重组蛋白类药物的需求逐年攀 对其改进。将外源蛋白定位在周质空间、改变培养工
升，使以生产疫苗、免疫球蛋白、抗体和蛋白质因子 艺条件以控制菌体生长速度和乙酸积累、将外源蛋
基因组学与应用生物学 794 Genomics and Applied Biology
www.genoapplbiol.org DOI: 10.3969/gab.028.000793
推动生物技术产业在过去几十年中迅速发展为影响 未完全克服(Mahmoud, 2007)。
人类社会生活的高新技术产业之一。尤其是近二十
分的去除，造成分离纯化成本的增加等缺陷迄今尚 达性能上看，芽胞杆菌生长能力极强、容易培养、具
用于药用蛋白生产的外源表达系统 Heterologous Expression Systems for the Production of Recombinant Therapeutic Protein 795
岛素及重组人生长激素(hGH)的市值就达到 95 亿美 分泌性表达是解决上述问题的关键。实际上，大肠杆
元，而全球同类产品的市场收入约为 450 亿美元，有 菌的分泌能力很低，只有少量蛋白质能够分泌到胞
望在 2011 年达到 982 亿美元(http://guba.eastmoney. 外。研究表明，大肠杆菌分泌蛋白主要是分泌至周间
致使其应用范围一直局限在小分子量(3 500~6 000 Da) 15~500 mg/L (Qian et al., 2008; Xia et al., 2008; Choi and
非糖基化多肽的表达生产上。即使在小分子量外源 Lee, 2004; Zhang et al., 2006)。该技术与基因改造相结
达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物表 (Jeong and Lee, 2000)。由于分泌水平低和折叠困难， 达系统的现状和近年来取得的一些新进展进行综述 分泌至周间腔的重组蛋白依然容易形成包涵体。所
与分析，并探讨外源蛋白表达系统的未来发展方向。 以，较高效率的分泌表达通常会将外源基因与分子
蛋白表达生产中，外源蛋白常因过量表达而以包涵 合，有望实现外源蛋白在大肠杆菌细胞的分泌性高
体形式存在，需要复性(部分蛋白很难复性)、高密度 表达，解决包涵体问题并降低下游生产成本。
培养过程中乙酸积累造成的细胞毒性、外源蛋白经
芽胞杆菌是原核表达系统中另外一种比较常用
常与内毒素相伴表达、内毒素和热源物质等杂质成 的外源蛋白表达菌，尤其是在工业用酶生产上。从表
com/look,002038,1005281283.html)，使集中体现生命 腔，这些蛋白的 N 端一般含有一段 15~30 个氨基酸
科学和生物技术领域前沿新成就与新突破的生物技 残基和富含疏水氨基酸残基的信号肽，其 N 端携带
术创新药物研发成为 21 世纪国际间竞争的战略制 正电荷以帮助蛋白穿越细胞膜进入周间腔，在细胞