细菌的形态学检查
微生物检验基础知识汇总!
你需要的微生物检验基础知识汇总！一、分类细菌属于原核细胞型微生物。
最精确的方法为遗传学分类方法。
最常用的是经典传统分类法：根据细菌的亲缘关系，界门纲目科属种型株分类。
科：由共同关系的属组成，如肠杆菌科；属：是种的高一级分类单位，通常包含有共同特征或关系亲密的种，用以描述微生物的主要特征，如埃希氏菌属；种：是分类等级的基本单位，同一种微生物形态、生理学特征和组成成分基本相同，用以描述微生物的次要特征，如大肠埃希氏菌；菌株或品系：同一种微生物中不同来源的纯培育物，如大肠埃希氏菌CGMCC 1.3373。
二、细菌形态学及形态学检查法细菌形态结构主要指细菌的大小、外形、排列及超微结构。
细菌结构与其生理功能、致病性、免疫性有关。
2.1形态结构2.1.1基本形态3类：球菌、杆菌、螺旋菌，杆菌是最常见的形态。
2.1.2大小测量细菌大小的单位为微米m。
球菌以直径表示大小，杆菌以长与宽表示大小，同一种细菌在不怜悯况下大小形态也有差别：涂片干燥、固定、染色时细菌收缩；快速生长的球菌往往呈短杆状。
菌龄与细菌大小的关系受很多因素影响，主要与代谢废物的积累及培育基中渗透压上升等因素有关。
2.1.3结构基本结构：细胞壁、细胞膜、细胞质、核质；特别结构：鞭毛、菌毛、荚膜、芽孢等。
菌毛是什么？菌毛（Pilus）很多革兰氏阴性菌菌体表面遍布的比鞭毛更为细、短、直、硬、多的丝状蛋白附属器，也叫做纤毛（Fimbriae)。
其化学组成是菌毛蛋白（Pilin），菌毛与运动无关。
菌毛可分为一般菌毛(Commonpilus)和性菌毛(Sexpilus)两种。
一般菌毛长0.3～1.0um,直径7nm。
具有粘着细胞（红细胞、上皮细胞）和定居各种细胞表面的力量，它与某些细菌的致病性有关。
无菌毛的细菌则易被粘膜细胞的纤毛运动、肠蠕动或尿液冲洗而被排解，失去菌毛，致病力亦随之丢失。
性菌毛有的细菌还有1～4根较长的性菌毛，比一般菌毛而粗，中空呈管状。
性菌毛由质粒携带的一种致育因子（Ferility factor）的基因编码，故性菌毛又称F菌毛。
细菌形态学检查
每天质控与标本同步进行
染色方法 质控菌株
结果
革兰染色 抗酸染色
ATCC25923（金黄色葡萄球菌） 紫色
ATCC25922（大肠埃希菌）
红色
ATCC14468（耻垢分枝杆菌） ATCC25922（大肠埃希菌）
红色 蓝色
一年一次人员比对，以当次比对职称最高人员结果为参考 标准
阅片
如何阅片
✓ 标本合格与否的判定 ✓ 感染的确认（炎症细胞） ✓ 炎症性质的鉴别（单个核、分叶核或嗜酸细胞） ✓ 感染性质鉴别（细菌、真菌、螺旋体、寄生虫等） ✓ 微生态失衡与否及程度（菌群失调） ✓ 可疑致病菌的确认（根据微生物与炎性细胞的关系）
莫拉菌铜绿假单胞菌、不动杆菌等）需结合镜下涂片及病人临床信息 判断是否为致病菌。 直接涂片镜下观察
白细胞内吞噬细菌与感染相关度高 粘液丝缠绕或包裹的细菌可能为目的菌 未发现吞噬现象可结合标本类型、质量，细菌是否有荚膜，菌群 改变或异位大量定植等分析
谢谢
脓液：同痰涂片 大便：取粘液便或血便少量均匀涂布玻片，不可过厚 无菌体液：标本足量，>1ml，离心或甩片集菌后涂片(3000r/min 15min）
标本量少，直接涂片 病灶组织或干酪块：先用组织研磨器磨碎后再涂片，大小厚度同痰涂片，
注意丝状真菌
质量控制
✓ 涂片的厚薄以镜下见到单层细胞为宜
✓ 染色结果 细胞核、浆清晰，胞内吞噬物清 楚可见
合格的片子肉眼观察痰膜呈亮蓝色，无红色斑块
镜检
抗酸菌呈红色，背景及其他菌呈蓝色
抗酸染色注意事项
染色时避免玻片上的染液干燥 直接涂抹的痰膜厚薄适宜，以透过痰膜看报纸上的5号字迹较模糊为
适宜的厚度 香柏油能溶解复红染料，使萋-尼氏染色褪色，并且容易干燥凝结，
微生物试验-细菌的人工培养及形态学检查
实验一 细菌的人工培养
一、细菌在自然界的分布
1.空气中细菌的检查：每班两个血平板，标记 方法：在室内选择一处放一个平皿，揭开皿盖，
暴露放置10min，即盖上皿盖，放入37℃温箱 培养24小时，观察结果。
2.人体表面细菌的检查---手 指（每组1个平皿）
方法：取一普通平皿培养 基，一部分标记“前”， 另一部分标记“后”，然 后将手指在标记“前”的 部分沾一下，洗手后在标 记“后”的部分沾一下。 放入37℃温箱培养24h后 观察细菌的生长情况。
呼吸道咽部常驻菌群种类较多，正常人咽部需氧菌 中，甲型链球菌检出率最高，其次是奈瑟球菌属和表 皮葡萄球菌。
二、 理化因素对细菌的影响
1.物理因素对细菌的影响---紫外线
原理：紫外线主要作用于 DNA，使一条DNA链上相邻 的两个胸腺嘧啶以共价键结合成二聚体，从而干扰 DNA 的复制与转录导致细菌变异或死亡。
3.人体内部细菌的检查--咽喉部
方法：用“咳碟法”进行检查，取一个血琼脂平 皿培养基，打开平皿盖，置于口腔前约 10cm， 对着平皿咳嗽几次，标记时间，姓名，然后放 入37℃温箱培养24h后观察菌落特征。
二、外界因素对细菌的影响：
1.物理因素对细菌的影响 ：
紫外线：全班两份普通平板：一组大肠杆菌， 一组葡萄球菌，比较紫外线对G+，G-的抑制作 用。
满足a充足的营无菌
（三）分类：1、按物理性状
分类：
+0.3~0.5%琼脂
+1.5~2.5%琼脂
半固体培养基 液体培养基
固体培养基
观察细菌动力 大量繁殖细菌 细菌的分离和纯化
短期保存菌种
固体平板培养基
液体培养基
固体斜面培养基 半固体培养基
细菌形态学检查染色方法
细菌形态学检查染色方法
细菌形态学检查是微生物学中非常重要的一部分，它可以帮助
我们了解细菌的形态特征，有助于诊断和治疗疾病。
在细菌形态学
检查中，染色方法是一项关键的技术，它可以使细菌在显微镜下更
容易观察和分辨。
以下是几种常用的细菌染色方法：
1. 革兰氏染色法，革兰氏染色法是最常用的细菌染色方法之一。
它可以将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性两类。
在这种染色方法中，先用紫普鲁士蓝染色，然后用碘液固定，再用酒精脱色，最后
用洋红染色。
革兰氏阳性细菌会呈紫色或蓝色，而革兰氏阴性细菌
则会呈粉红色。
2. 厌氧染色法，厌氧染色法是专门用于观察厌氧菌的染色方法。
它与革兰氏染色法类似，但在脱色步骤中使用氢氟酸而不是酒精，
这样可以更好地保留厌氧菌的形态特征。
3. 阳性染色法，阳性染色法用于观察细菌的细胞壁结构和形态
特征。
在这种染色方法中，通常使用甲基蓝或结晶紫等染料，可以
使细菌呈现出蓝色或紫色。
4. 阴性染色法，阴性染色法也是用于观察细菌细胞壁结构和形态特征的一种方法。
与阳性染色法不同的是，阴性染色法使用印度墨染料，可以使细菌呈现出浅红色或粉红色。
除了上述列举的染色方法外，还有许多其他特殊的染色方法，如荧光染色、折射染色等，它们都可以根据需要来选择使用。
细菌形态学检查染色方法的选择取决于所研究的细菌种类、研究的目的以及实验室的设备和条件等因素。
希望这些信息可以帮助你更好地了解细菌形态学检查染色方法。
细菌的形态学检查常用的方法
细菌的形态学检查常用的方法
细菌的形态学检查是指通过观察细菌的形态、结构和大小来进
行分类和鉴定的方法。
常用的方法包括：
1. 显微镜观察，使用光学显微镜或电子显微镜观察细菌的形态
和结构。
通过放大细菌的形态特征，如形状、大小、细胞壁结构等
来进行分类和鉴定。
2. 染色法，常用的染色方法包括革兰氏染色、折射率染色、吉
姆萨染色等，这些染色方法可以使细菌在显微镜下更清晰地显示出
形态特征，有助于鉴定。
3. 形态培养特性，利用不同的培养基和培养条件，观察细菌在
不同环境下的生长特性和形态变化，如菌落形态、生长速度等。
4. 生化反应，通过观察细菌对不同生化试剂的反应，如碘试验、氧化酶试验等，来鉴定细菌的形态学特征。
5. 分子生物学方法，包括PCR、序列分析等技术，通过对细菌
的基因组进行分析，可以更准确地鉴定细菌的形态学特征。
综上所述，细菌的形态学检查常用的方法包括显微镜观察、染色法、形态培养特性、生化反应和分子生物学方法，这些方法可以从不同角度全面地观察和鉴定细菌的形态学特征。
细菌形态学检查法(一)
---------------------------------------------------------------最新资料推荐------------------------------------------------------细菌形态学检查法(一)细菌形态学检查法(一) 细菌形态学检查法（一）细菌形态学检查是细菌检验的重要方法之一，不仅可以为后续的进一步检验提供参考依据，更重要的是可以通过细菌形态学检查迅速了解标本中有无细菌及菌量的大致情况；对少数具有典型形态特征的细菌可以作出初步诊断，为临床选用抗菌药物治疗起到重要的提示作用。
临床标本的细菌形态学检查方法主要包括染色标本和不染色标本的检查。
一、显微镜细菌体积微小，必须借助显微镜放大后才能观察。
细菌的一般形态结构可用光学显微镜观察，而细菌内部的超微结构则需用电子显微镜观察。
1．普通光学显微镜普通光学显微镜以可见光作为光源，波长 0.4～0.7m，最大分辨率 0．2m，约为波长的一半。
人肉眼能分辨的最小距离是 0．2mm，因此用油镜放大 1000 倍，0．2m 的微粒即被放大到肉眼可见的 0．2mm。
一般细菌都大于 0．m，故可用普通光学显微镜进行观察。
2．暗视野显微镜暗视野显微镜是在普通光学显微镜上装暗视野聚光器，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，背景视野变暗，菌体发亮。
观察时黑暗的背景中可见到发亮的菌体，明暗反差提高了观察效1 / 3果，常用于不染色标本的动力及运动状况检查。
3．荧光显微镜荧光显微镜以高压汞灯作为光源，能发出280～600nm波长的光线，主要在 365～435nm 之间。
根据使用荧光素的不同选择不同波长的光线作为激发光。
因其波长比可见光短，故分辨率高于普通光学显微镜。
细菌预先经相应的荧光素处理，然后置荧光显微镜下激发荧光，在暗色背景中可见到发荧光的菌体。
用于观察细菌的结构及鉴别细菌。
细菌的形态检查实验报告
细菌的形态检查实验报告
《细菌的形态检查实验报告》
在生物学实验室中，细菌的形态检查是一项重要的实验，它可以帮助科学家们
更好地了解细菌的结构和特征，从而为疾病的预防和治疗提供重要的参考依据。
在这个实验中，我们对不同类型的细菌进行了形态检查，并取得了一些有趣的
发现。
首先，我们从不同的环境样本中分离出了一些细菌，并在琼脂平板上进行了培养。
经过一段时间的培养，我们观察到了不同形态的细菌，有的呈现出球状，
有的呈现出杆状，还有的呈现出螺旋状。
这些不同形态的细菌为我们提供了很
多有价值的信息。
接下来，我们对这些细菌进行了染色处理，使用了革兰氏染色和折射染色两种
方法。
通过这些染色方法，我们可以更清晰地观察到细菌的细胞壁结构和形态
特征。
我们发现，一些细菌在革兰氏染色后呈现出紫色或蓝色，而在折射染色
后呈现出粉红色或红色。
这些染色结果为我们提供了更多的信息，帮助我们进
一步了解细菌的特性。
最后，我们利用显微镜对这些细菌进行了观察。
通过放大镜头，我们可以清晰
地看到细菌的形态特征，包括细胞壁、细胞质和细胞核等。
我们发现，不同形
态的细菌在显微镜下呈现出不同的特征，这些特征有助于我们对细菌进行分类
和鉴定。
通过这次形态检查实验，我们对细菌的形态特征有了更深入的了解。
这些了解
为我们进一步研究细菌的生物学特性和病原机制提供了重要的基础，也为我们
今后的科研工作提供了宝贵的参考。
希望通过我们的努力，能够为人类健康和
医学科研做出更大的贡献。
细菌形态学检查法
•未脱色细菌呈红色为抗酸性细菌 •脱色经复染呈蓝色为非抗酸性细菌
3.其他染色方法（1）源自毛染色 （2）荚膜染色细菌形态学检查法
重点提示
• 不染色标本的形态学检查 • 染色标本的形态学检查
– 革兰染色 – 抗酸染色
一、显微镜
1.普通光学显微镜（light microscope）
– 光源：可见光
2. 暗视野显微镜（ dark field microscope ）
– 暗背景，菌体发光 –用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运
1.革兰染色（Gram staining） （1）原理
– 细胞壁学说：两种细菌细胞壁结构不同-G+菌肽 聚糖层厚、致密，脂质含量少；G-菌薄而疏松， 脂质含量多。
– 等电点学说： G+菌pI 2～3； G-菌pI 4～5 – 化学学说： G+菌含有核糖核酸镁盐多， G-菌
含量少。
三、细菌染色标本的检查-革兰染色
（2）结果
– 细菌分为革兰阳性（G+）菌和革兰阴性（G-）菌
紫色为革兰阳性菌，红色为革兰阴性菌
革 兰 染 色 方 法
三、细菌染色标本的检查
2.抗酸染色
（1）原理：分枝杆菌细胞壁含脂质较多，其中主要 成分为分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色时与石 炭酸复红结合牢固，能抵抗酸性乙醇的脱色作用， 因此抗酸菌能保持复红的颜色，达到初步鉴别细 菌的目的。
复红、刚果红等。
3.中性染料：碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞
氏染料、姬姆萨染料等。
三、细菌染色标本的检查
(二)常用染色方法 • 单染色法
– 只用一种染料，如吕氏美蓝。用于观察细菌的 形态、大小、排列。
细菌的形态学检查
目 录 末页
革兰染色法
结晶紫、碳酸钠初染，30秒 碘液媒染30秒
丙酮酒精数滴，脱色约5秒
碱性复红液2~3滴，5秒钟
待干，镜检。
注：每一步均需 细流水冲洗。
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• 油镜观察结果1000倍
放大倍数：10×100
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• 白色念珠菌革兰染色1000倍
放大倍数：10×100
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革兰氏染色意义：
注明 菌名：大肠杆菌 染色法： 放大倍数：10×100
目 录 末页
细菌形态示意图绘图要求
绘细菌的
形态 排列 染色性 特殊结构
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目 录 末页
1.涂片
① 接种环置于酒精灯的外焰中烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
② 取1~2环生理盐水（NS)置于载玻片上，接种 环用火焰烧灼灭菌。
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（二）细菌涂片标本的制备
1.涂片
③ 小指和手掌小鱼肌侧拔掉棉塞，并烧灼试管口灭菌。 用已灭菌冷却的接种环伸入试管中取适量菌，注意勿使沾 有菌液的接种环触及试管壁及试管口。
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（二）细菌涂片标本的制备
3.固定
目的：使细菌蛋白变性，菌 体牢固黏附于玻片上，还可杀 死细菌。
玻片有菌膜一面向上，在火焰的外焰钟摆 样速度通过三次，时间约3秒钟。
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革兰染色法操作步骤：
• 初染 媒染 脱色 复染
初染（结晶紫.碳酸钠） 媒染（碘液）
脱色（95%乙醇） 复染（复红）
• 玻璃折射率： n=1.52
• 香柏油折射率： n=1.515
目 录 末页
二、细菌标本染色检查法
大肠杆菌病的实验室诊断之病料中细菌的形态学检查.ppt
病料中细菌的形态学检查方法
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 镊子、剪刀在酒精灯火焰上烧灼灭菌，用镊子夹持、剪刀剪取小块 病料组织，以其新鲜切面在玻片上轻触3~5个压迹。
病料中细菌的形态学检查方法
1 触片
2 干燥
3 固定
4 美兰染色
• 室温下自然干燥或将标本片 的涂面向上，置酒精灯火焰 高处微烤加热干燥，至涂面 上无水为止。
形态学检查结果及诊断结论
镜检结果显示，或成对 排列
病料中细菌的形态学检查方法
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 火焰固定方法：将干燥好的标本片涂面向上，在酒精灯火焰上通过 3~4次，以手背触及玻片微烫手为宜。
病料中细菌的形态学检查方法
1 触片 2 干燥 3 固定 4 美兰染色
• 滴加美蓝染色液覆盖涂面， 静置染色 2~3min，水洗， 用吸水纸吸干镜检。
大肠杆菌病的实验室诊断
病料中细菌的形态学检查 主讲教师 郭洪梅
实验目标
• 通过观察病料中是否有菌，从而初步判断病料 是否取自细菌感染病例。
• 若病料中有菌，根据细菌形态初步鉴定其种类
实验器材
酒精灯
病料
标本片 镊子 剪刀
• 酒精灯、接种环、载玻片、吸水纸、生理盐水、美蓝染色液、革 兰氏染色液、瑞氏染色液、染色缸、染色架、洗瓶、显微镜、香 柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、细菌培养物(大肠杆菌、葡萄球菌等)、 细菌病料、镊子、剪刀、标记笔等
技能点13病料中细菌的形态学检查.
国家高等职业教育畜牧兽医专业教学资源库《动物微生物与免疫技术》技能点13 病料中细菌的形态学检查
实训目标
1．病料中细菌的形态学检查实验目标：
通过观察病料中是否有菌，从而初步判断病料是否取自细菌感染病例。
若病料中有菌，根据细菌形态初步鉴定其种类
2．病料中细菌的分离培养实验目标：
用鉴别培养基分离培养后，看是否得到菌落。
若有菌落生长，则根据菌落特征进一步鉴定细菌种类。
仪器及材料疑似大肠杆菌病料、镊子、剪刀、玻片、酒精灯、染色缸及染色架、美兰染液、吸水纸、擦镜纸、香柏油、乙醇乙醚、洗瓶、烙刀、接种环、麦康凯平板、记号笔、温箱、酒精灯等
方法与步骤
1．触片以无菌剪刀、镊子剪取被检组织一小块，以其新鲜切面在玻片上做数个压印或涂抹成适当大小的一薄层。
2．干燥涂片应在室温下自然干燥，必要时将涂面向上，置火焰高处微烤加热干燥。
3．固定火焰固定是最常用的方法，将干燥好的抹片涂面向上，在火焰上来回通过数次（一般4～6次），以手背触及玻片微烫手为宜。
4．美蓝染色在已固定好的抹片上，滴加适量美蓝染色液覆盖涂面，染色2～3min，水洗，晾干或吸水纸轻压吸干和镜检，结果菌体呈蓝色。
细菌生理生化鉴定
细菌生理生化鉴定
细菌生理生化鉴定是通过对细菌在特定生理和生化条件下的反应进行观察和分析，以确定其种类和特性的过程。
这通常包括一系列实验，涉及对细菌代谢途径、酶活性、生长条件等方面的研究。
以下是细菌生理生化鉴定的一些常见方法和实验：
1.形态学观察：
形状：观察细菌的形状，可以是球形（球菌）、杆状（杆菌）、螺旋形等。
结构：使用显微镜检查是否有胞壁、胞膜、纤毛、鞭毛等结构。
2.生理特性：
生长条件：观察细菌在不同温度、pH值和氧气条件下的生长情况。
营养需求：测试细菌对不同营养物质（碳源、氮源、矿物质等）的利用能力。
3.生化反应：
大肠杆菌的IMViC测试：Indole（吲哚）测试、Methyl Red（甲基红）测试、V oges-Proskauer（V-P）测试、Citrate（柠檬酸）测试、
4．氧化还原反应：观察细菌对不同氧化还原指示剂（如甲基红、溴亚甲蓝）的反应，推断其对氧化还原条件的适应性。
5.酶活性测试：
氧化酶：使用氧敏感指示剂观察酶的活性。
淀粉酶：利用淀粉琼脂板，观察菌落周围是否发生淀粉分解带。
蛋白酶：使用明胶板检测细菌对蛋白质的分解能力。
6.抗生素敏感性测试：确定细菌对不同抗生素的敏感性，通过纸片扩散法或肉汤稀释法进行。
7.分子生物学方法：16S rRNA测序：通过测序菌株的16S rRNA基因，进行分子水平的种类鉴定。
8.培养基选择：利用特定培养基，如MacConkey琼脂培养大肠杆菌等，根据细菌在培养基上的生长情况进行初步鉴定。
实验二++细菌的形态学检查(1)
实验二细菌的形态学检查【目的和要求】1．熟悉细菌染色的常用染料和一般程序。
2．掌握革兰染色的方法、原理、结果观察及意义。
3．熟悉不染色标本检查法（压滴法和悬滴法）的方法与结果观察。
4．熟悉细菌的特殊染色法。
【试剂与器材】1．菌种：葡萄球菌、大肠埃希菌。
2．试剂：革兰染色液、细胞壁染色液、芽胞染色液、鞭毛染色液、生理盐水等。
3．其他：载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂等。
【实验内容】一、细菌染色的一般程序细菌染色法分单染法和复染法。
单染法是用一种染料去染，所有细菌都染成一种颜色；复染法是用多种染料对细菌进行染色，不同细菌可染成不同的颜色。
大部分细菌染色的基本程序相同，即：涂片→干燥→固定→染色，根据实验目的选择不同的染色方法，在实际工作中，应用最广泛的是革兰染色法。
二、革兰染色1．染色原理（1）等电点学说：革兰阳性菌的等电点（pI2～3）比革兰阴性菌（pI4～5）低，在同一pH条件下革兰阳性菌带负电荷比革兰阴性菌要多，与带正电荷的碱性染料（结晶紫）结合性牢固，不易脱色。
（2）化学学说：革兰阳性菌含有大量的核糖核酸镁盐，与进入胞浆内的结晶紫和碘牢固结合成大分子复合物，不易被95%酒精脱色；而革兰阴性菌含此种物质少，故易被乙醇脱色。
（3）通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层较厚，含脂质少，脱色时，乙醇不易进入，而且95％乙醇可使细胞壁脱水，细胞壁间隙缩小，通透性降低，阻碍结晶紫和碘复合物渗出。
而革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层较薄，含脂质多，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内的结晶紫与碘复合物易被溶出而脱色。
2．方法（1）涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格。
用接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1.5cm的菌膜。
（2）干燥：让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。
微生物学基本实验方法和诊断
五、鲎试验(Limulus test, LT)
鲎试验是利用鲎试剂能与微量内毒素反应形成固态 凝胶来检测内毒素的试验。 鲎试剂是鲎血液中的变形细胞溶解物（Limulus amebocytes lysate，LAT），为白色粉末，易溶于 水和生理盐水中。鲎试剂中含C因子、B因子、凝固 酶原和凝固蛋白原等几种参与级联酶反应的成分。 在一定条件下，微量的内毒素即能激活鲎试剂溶液 中的C因子，活化C因子激活B因子，活化B因子使凝 固酶原转变为凝固酶，凝固酶使凝固蛋白原转变成 凝固蛋白，最终导致凝胶的形成。
培养基的种类—按用途分类
（3）鉴别培养基：在培养基中加入特定的底物 和指示剂，即为鉴别培养基。鉴别培养基用来 作细菌的生化试验，以便鉴定细菌，因此这类 培养基是临床细菌检验常的培养基。如糖发酵 培养基、克氏双糖铁培养基（KIA）、动力－吲 哚－尿素（MIU）培养基等。
培养基的种类—按用途分类
（4）选择培养基：在培养基中加入某种化学物质 或抗生素，以抑制某些细菌种类生长，有助于需要 的细菌种类生长。此类培养基主要用于从含菌种类 （主要是正常菌群）较多的标本（如粪便）中分离 培养专性病原菌。如胆盐培养基、SS琼脂、麦康凯 琼脂、中国兰琼脂、伊红－美兰琼脂用于从粪便中 分离培养志贺菌和沙门菌；庆大霉素琼脂、碱性琼 脂用于从粪便中分离培养霍乱弧菌。 （5）特殊培养基：包括培养细菌L型的培养基，培 养厌氧菌的厌氧培养基。这类培养基用于培养营养 要求和生长条件较特殊的细菌。
细菌L型检查
（一）培养基：培养细菌L型的培养基需 具有丰富的营养和高渗生长条件。培养基 常以心脑浸液及牛肉浸液为基础，加入 1~2％蛋白胨、5％NaCl（使致高渗）， pH7.6~7.8、1％琼脂，高压蒸汽灭菌后制 备成固体培养基，必要时高压蒸汽灭菌后 待至60℃左右加入20％无菌马、羊或人血 浆，制备成固体培养基。
微生物学理论指导：细菌形态和结构的检查法
一、显微镜
细菌形体微小，肉眼不能直接看到，必须借助显微镜放大后才能看到。
显微镜包括普通光学显微镜、电子显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和共聚焦显微镜等，适用于观察不同情况下的细菌形态或结构。
二、染色法
细菌体小半透明，经染色后才能观察较清楚。
染色法有多种，最常用的分类鉴别染色法是革兰染色法。
革兰染色法：
1.方法是固定的细菌标本先用碱性染料结晶紫初染，再加碘液媒染，使之生成结晶紫-碘复合物；此时不同细菌均被染成深紫色。
然后用95%乙醇处理，最后用稀释复红或沙黄复染。
2.结果判断可将细菌分为两大类：不被乙醇脱色仍保留紫色者为革兰阳性菌，被乙醇脱色后复染成红色者为革兰阴性菌。
3.医学意义：①鉴别细菌：通过革兰染色将所有细菌分为G+菌和G-菌两大类，可初步识别细菌，缩小范围，有助于进一步鉴定。
②选择药物参考：G+菌与G-菌对一些抗生素表现出不同的敏感性。
③与致病性有关：大多G+菌的致病物质是外毒素，而G-菌大多能产生内毒素，两种致病作用不同。
临床微生物学检验技术
二、染色标本
· 细菌标本经染色后，除能清楚看到细菌的形态、大小、 排列方式外，还可根据染色反应将细菌进行分类，因 此染色标本的检查在细菌的初步鉴定中应用最广，起 着非常重要的作用。
· （一）常用染料：酸性染料、碱性染料、复合染料。 · （二）常用的染色方法：革兰染色、抗酸染色、
荧光染色。
革兰染色
三、生化反应
（一）碳水化合物的代谢试验 1.糖（醇、苷）类发酵试验
原理：不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶， 因而对各种糖（醇、苷）类的代谢能力也有所不同，即使能分 解某种糖（醇、苷）类，其代谢产物可因菌种而异。检查细菌 对培养基中所含糖（醇、苷）降解后产酸或产酸产气的能力， 可用以鉴定细菌种类。
方法：将待试菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水中， 35℃孵育48~96h后，于5ml培养基中滴加5~6滴甲基红指示 剂，立即观察结果。
结果判定：呈现红色者为阳性，桔黄色为阴性，桔 红色为弱阳性。
应用：常用于肠杆菌科内某些种属的鉴别，如大肠 埃希菌和产气肠杆菌，前者为阳性，后者为阴性。肠 杆菌属和哈夫尼亚菌属为阴性，而沙门菌属、志贺菌 属、枸橼酸杆菌属和变形杆菌属等为阳性。
3
革兰阳性菌细胞内含有大量核糖核酸镁盐，可与结
晶紫和碘牢固的结合成大分子复合物，不易被乙醇脱色；而革
兰阴性菌细胞内含极少量的核糖核酸镁盐，吸附染料量少，形
成的复合物分子也较小，故易被乙醇脱色。
2. 染色方法
1 标本涂片、干燥和固定。 2 染色：在已固定细菌涂片上滴加结晶紫染液数滴， 室温作用1min，用细流水轻轻冲洗，甩去积水。再滴 加碘液数滴，室温作用1min，冲洗。滴加95%酒精数滴， 轻轻摇动玻片几秒钟，使均匀脱色，然后斜持玻片， 使脱掉的染料随酒精流去，再滴加酒精，直到流下的 酒精无色为止（约需30s），立即用细流水将酒精冲掉。 再滴加稀释石炭酸复红液复染约30s后用细流水冲洗。 3 标本染色后，晾干或用吸水纸吸干，滴香柏油后 用油镜观察。
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怀化医专《微生物学检验》教案编号:３
第八章细菌形态学检查
形态学检查的目的:
①从形态上识别细菌,为细菌分类与鉴别的基础;
②了解被检标本中有无细菌;
③直接从标本中观察到某些细菌,可对少数疾病初步诊断(如结核,脑膜炎等)。
第一节显微镜(mｉcroscopｅ)
一、普通光学显微镜
原理自然光的波长为0、4um;显微镜的最大分辨率为0.2um(前者的一半);肉眼的分辨率为0.2ｍm,故放大100０倍,使0.2um放大到０.2mm。
二、暗视野显微镜
用暗视野聚光器,使反光镜反射过来的光线不能进入镜筒,视野变暗,
线从暗视野聚光器周围斜射到菌体上,由于散射作用使菌体发光。
常用于活的微生物的动力检测。
三、相差显微镜
在检查不染色标本时,由于细菌的折光性与周围环境的折光性相近,对比不明显,瞧不清细菌及其内部结构,相差显微镜利用相差板的光栅作用,使光波穿过标本中密度不同的部位时,引起位相差,显出光的强度的明暗对比。
应用于活菌的形态及某些内部结构的观察。
四、荧光显微镜
以紫外光或蓝紫光作光源,因其波长比自然光短,故分辨率比普通显微镜要高。
细菌经过荧光素染色后,在荧光显微镜下,由于菌体各种结构对荧光素的溶解、吸附情况不同,因此发出不同色调与亮度的荧光。
五、电子显微镜
以强大的电子流代替光源,因电子流的波长仅为０、００5nm,(仅为可见光源的几万分之一),故其放大倍数可达1０万-100万倍,可瞧清1nm的物体。
电镜种类
透射电镜:因电子的透射作用,可观察细菌,virus内部结构,通过荧屏显示。
扫描电镜:因电子流对物体的表面进行扫描,可清楚的显露出物体的三维空间的立体结构,可用于对细菌,virus的表面结构观察。
第二节不染色细菌标本检查法
仅用于细菌动力的观察。
不能观察细菌的形态与结构特征。
1.压滴法明视野法、暗视野法。
2、悬滴法
3、毛细管法:孔径0、5-1.0mm,长约6０－70ｍm毛细管,以此管轻取细菌培养物,待液体进入后,两端火焰封融。
用于厌氧菌的动力观察。
注意:区别细菌的运动与布朗运动。
第三节细菌染色标本的检查
适于观察细菌的形态与某些结构。
一、染料:
大多就是人工合成的含苯环或苯的有机物。
色基:即连接在苯环上带双键的有色化学基团,它使染料带颜色,其色基越多,颜色越深。
如-NＯ2(硝基)＼-N＝N－(偶氮基)
助色基:不显色,它决定了染料与被染物之间的亲与性,且有酸、碱之分,决定了染料的酸碱性:-NH2(碱性) -OH(酸性)
常用染料种类:
1、碱性染料:美兰,结晶紫,碱性复红等,常以氯化物形式存在,色基带正电,易与带负电的被染物结合着色。
由于细菌PI低(2～５),因此常带负电荷,易与该类染料结合。
2、酸性染料:伊红,酸性复红,刚果红,色基带负电。
细菌带负电荷不易着色,常用于细胞浆染色,很少用于细菌染色。
３、复合染料(中性染料):就是碱性染料与酸性染料的复合物,可与cell浆结合,如:伊红美兰、伊红天青。
4、单纯染料:多为偶氮化合物,亲与力低,不溶于水,而溶于脂溶剂。
常用于脂肪
组织染色,如:苏丹染料。
二、染色程序:
基本步骤:涂片(干燥)→固定→染色(初染、煤染、脱色、复染)
１、涂片制备:
液体标本(细菌培养液)直接涂于玻片上;
固体培养基上的培养物,取生理盐水涂片,涂成蚕豆大小的菌膜。
2、固定:
目的:①杀死细菌,使蛋白质凝固,易于着色;
②改变其通透性,利于染料进入;
③使菌体附着在玻片上;
④保持细菌原有的形态、结构。
方法:常用的火焰加热固定法,其它有:冷冻干燥法,化学干燥法。
3、染色:
(1)初染
(2)媒染
目的:加固初染——增加染料与被染物的亲与力、使染料固定于被染物、使细胞膜通透性改变。
媒染剂:石炭酸,碘液,明矾,酚等,也可用加热法。
(3)脱色
目的:使不该染上颜色的部分脱下颜色。
脱色剂:凡能使已经着色的被染物脱去颜色的化学试剂。
酸(为碱的脱色剂),碱(为酸的脱色剂),还有甲醇,乙醇等,无机酸脱色能力强于有机酸,醇类中分子量小的强于分子量大的。
脱色机制:有的起溶媒作用(如醇类),有的影响蛋白质的电离程度,改变其
电荷的性质或数量,从而影响细菌与染料结合的程度(如酸碱)。
(4)复染(对比染色)
常用染料:稀释复红、沙黄(与紫色对比)、美兰、苦味液(与红色对比)
三、常用的染色法
(一)单染法:
用一种染料染,细菌及周围部分都染成同一种颜色主要用于观察细菌的形态、大小、排列及简单的结构,如美兰染色,复红染色。
(二)复染法:
用两种以上的染料,将不同的细菌或同一细菌的不同结构染成不同的颜色。
可用于细菌的鉴别。
常用的有——
1、革兰染色法(Grａm ｓtain):
由丹麦细菌学家Chrisｔaｉn Gram首创,已有１０0多年的历史。
染料: 结晶紫、卢戈氏碘液、9５%酒精、稀释石炭酸复红。
原理:
(１)等电点学说:革兰阳性菌ｐh2－３,低于革兰阴性菌ｐh4－5。
与带正电荷的染料结合牢固。
(2)化学学说:革兰阳性菌含大量核糖核酸镁盐,与结晶紫与碘结合成大分子复合物而不易被脱色。
(3)通透性学说:革兰阳性菌cell walｌ因肽聚糖厚,脂类少, 通透性低,酒精不易进入脱色,相反革兰阴性菌肽聚糖少,含脂多,易被酒精溶解,使ceｌl wall通透性升高。
方法:略(实验课介绍)
结果:G+菌:紫色;G-菌:红色
意义:(1)鉴别细菌;(2)选择药物参考;(3)与致病性有关。
2、抗酸染色(acid-fａst ｓtａｉｎ)
原理:分枝杆菌一般不易着色,若用5%石炭酸复红加温并延长染色时间,可染
上红色,又因其菌体中含有分枝菌酸,可抵抗3％盐酸酒精的脱色,仍保持红色,故称为抗酸菌。
方法:涂片、干燥、固定→石炭酸复红(初染)加热至冒蒸汽5miｎ→
盐酸酒精脱色→ 碱性美兰(复染)１ｍin
结果、意义:
3、特殊染色法
(1)细胞壁染色:
染液:１０%鞣酸溶液、0.５％结晶紫溶液
方法:涂片自然干燥→鞣酸染15mｉn,水洗→结晶紫染３~5min,水洗→
待干,镜检。
结果:细胞壁(细菌的周边)染成紫色,内部无色;
无细胞壁的细菌(L型菌)整个菌体染成紫色。
(２)其它: 鞭毛染色法、芽胞染色法、荚膜染色法、异染颗粒染色法
4、负染色法
将标本的背景染色而细菌不着色。
如:墨汁、酸性染料(如刚果红、水溶性苯胺黑等),也可用墨汁染色结合单染色法(如美蓝)检查细菌的荚膜,黑色背景中,蓝色菌体外为无色的荚膜。