实验六微生物的简单染色及革兰氏染色
细菌的简单染色和革兰染色实验报告
实验二：细菌的简单染色和革兰染色一、实验目的1.掌握细菌涂片的制备方法。
2.掌握细菌简单染色和革兰染色法的原理及操作步骤，识别细菌的革兰染色结果。
3.巩固显微镜油镜的使用方法。
4.学习无菌操作技术。
二、实验原理1、染色原理：细菌生长于酸性、中性和碱性溶液时常带负电荷，所以通常采用带正电荷的碱性染料（如美蓝、甲紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。
当细菌分解糖类产酸时，细菌所带正电荷增加易被带负电的酸性染料（如伊红、酸性复红或刚果红）着色。
2、革兰染色法原理：革兰染色法可根据细菌细胞壁结构和成分的不同，将其分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色；而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
另外，革兰染色的差异并不能完全认为是化学的差别，也有物理结构不同的结果。
如酵母菌细胞壁的成份完全与细菌不同，但具有革兰染色阳性反应。
三、实验仪器，材料和用具1、仪器及用具：显微镜、酒精灯、火柴、接种环、载玻片、盖玻片、镊子、擦镜纸、镜油、无菌牙签2、菌种：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、葡萄球菌、牙垢、未知菌S1和S33、试剂：结晶紫染液、革氏碘液、洗脱液（95%乙醇溶液）、番红染液四、实验步骤（1）简单染色1、载玻片的处理：用纱布将取出的载玻片擦干，把要涂菌的部位在火焰上烤一下，冷却待用。
2、涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上烧灼灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂一直径约2mm的均匀薄膜。
3、干燥：涂片后待其自然干燥。
4、固定：将以干燥好的涂片标本朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次，要求载玻片温度不能超过60度，以手背触载片不烫为宜。
5、染色：滴加一滴结晶紫染液，染色1min。
微生物学实验细菌的简单染色和革兰氏染色(共7张PPT)
二、实验原理
1、细菌的简染色原理
①细菌菌体微小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须通过染色来增加菌体的显示力， 从而更清楚地观察到其形态和结构。 ②在碱性、中性或弱酸性溶液中，细菌菌体通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染 色局部带正电荷〔酸性染料的染色局部带负电荷〕，因此，碱性染料很容易与菌体结合而是菌 体着色。
2、细菌革兰氏染色的原理
G+菌和G-菌的细胞壁结构和组成有较大的区别。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小， 通透性降低，结晶紫-碘复合物被滞留在细胞内，因此细菌仍保存初染时的颜色，经番红复染后呈蓝紫 色。 G-菌细胞壁的外膜层富含类脂，而且其肽聚糖层次薄、交联度低；乙醇脱色时，细胞壁因类脂被 溶解而出现较大缝隙，使得菌体内的结晶紫-碘复合物较易渗出，而使菌体变成无色，再经番红 复染就成为红色。
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细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告实验三细菌的简单染色和革兰氏染色实验三细菌的简单染色和革兰氏染色一、目的与要求1、掌握细菌涂片标本的制备2、掌握革兰氏染色法的步骤和关键点3、识别细菌革兰氏染色结果二、实验原理：细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。
为什么要对细菌染色？细菌的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更清楚地观察到其形态和结构。
用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。
简单染色法可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。
革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G?)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法。
其原理是利用细菌的细胞壁组成成分和结构的不同。
革兰氏阳性菌的细胞壁肽聚糖层厚，交联而成的肽聚糖网状结构致密，经乙醇处理发生脱水作用，使孔径缩小，通透性降低，结晶紫与碘形成的大分子复合物保留在细胞壁内使细胞呈蓝紫色，而革兰氏阴性菌肽聚糖层薄，网状结构交联少，且类脂含量较高，经乙醇处理后，类脂被溶解，细胞壁孔径变大，通透性增加，结晶紫与碘的复合物被溶出细胞壁，再经番红复染后细胞呈红色。
三、实验器材1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌(Escherichia coli)斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌(Bacillus subtilis)斜面菌种；2、仪器显微镜；3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等。
4、染料草酸铵结晶紫染色液，路哥氏(Lugol)碘液，95%乙醇，0.5%番红染色液；细菌的简单染色步骤：细菌的革兰氏染色步骤：涂片,干燥,固定,结晶紫染色,水洗,碘液媒染,水洗,乙醇脱色,水洗,番红复染,水洗,干燥,镜检.五、实验关键步骤和注意点：1、玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告
细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌的简单染色和革兰氏染色实验报告细菌是微生物中最常见的一类生物，它们广泛存在于自然界的各个角落，包括土壤、水体、空气等。
为了更好地了解细菌的形态和结构，科学家们开展了许多实验，其中包括细菌的简单染色和革兰氏染色。
一、细菌的简单染色实验细菌的简单染色是一种常用的染色方法，通过给细菌染色，可以使其在显微镜下更加清晰可见。
这种染色方法主要使用了一种叫做甲基蓝的染料。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片。
将一根无菌的钢丝棒蘸取一小滴细菌悬液，然后将其均匀地涂抹在玻璃片上。
待涂片干燥后，将其固定在火焰上加热的玻璃柱上，以使细菌附着在玻璃片上。
接下来，将制备好的涂片放入染色盒中，加入适量的甲基蓝染料，浸泡片刻。
然后，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
最后，用纸巾轻轻吸干涂片上的水分，将其放入显微镜下观察。
在显微镜下观察，我们可以清楚地看到细菌的形态和结构。
不同种类的细菌可能会呈现出不同的形状，例如球状、杆状、螺旋状等。
通过简单染色，我们可以更好地观察和研究细菌的特征。
二、革兰氏染色实验革兰氏染色是一种常用的细菌染色方法，它可以将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两类。
这种染色方法主要使用了紫晶染料和碘酒。
在实验中，首先需要制备好细菌的涂片，方法与简单染色相同。
然后，将涂片放入染色盒中，加入适量的紫晶染料，浸泡片刻。
接着，用蒸馏水轻轻冲洗涂片，直至水洗液不再有颜色流出。
接下来，将碘酒滴在涂片上，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
随后，滴入乙醇或酒精醛溶液，使其浸润全片，然后用蒸馏水轻轻冲洗涂片。
最后，滴入蓝色染料，浸泡片刻后用蒸馏水冲洗涂片。
在显微镜下观察，我们可以看到细菌的染色效果。
革兰氏阳性菌会呈现紫色或蓝色，而革兰氏阴性菌则呈现红色或粉色。
这是因为革兰氏阳性菌的细胞壁含有较多的胆固醇，可以吸附紫晶染料和碘酒，而革兰氏阴性菌的细胞壁则较薄，无法吸附这些染料。
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色
细菌制片及简单染色 涂片：将玻片分成两个区域，各滴上一小滴蒸馏水，再
用无菌操 作的方法挑菌少许枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球
菌于玻 片的水中，并充分混匀涂成薄膜
枯燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然枯燥 固定：涂面朝上，通过微火2-3次 染色：玻片泠却后加结晶紫滴于涂片上，覆盖涂面染色1
双层瓶
香柏油 二甲苯
分钟 水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至洗出水
变无色为止 〔注：勿冲去菌体〕
枯燥：自然枯燥，或用吸水纸吸干 镜检：显微镜下观察并记录
四、实验步骤
1、菌落形态观察：
2、➢细注滴菌加意少简：量单水菌染落颜色色：、湿度、形状、大小、透明度 3、、➢➢细染涂颜菌色片色革过→、兰程枯边氏：燥缘→染是固色否定规。→那染么色等〔特1征m。in〕→水洗→枯
二、根本原理〔革兰氏染色〕
革兰氏染色法是1884年由丹麦病理 ChristainGram氏创立的，可将细菌区分为革 兰氏阳性菌〔G+〕和革兰氏阴性菌〔G-〕 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和
革兰氏阴性，是由这两类细菌细 胞壁的构造和组成不同决定的
三、实验器材与试剂
一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上 二是增加其对染料的亲和力
常用的有加热和化学固定两种方法 固定时尽量维持细胞原有的形
常用碱性染料进展简单染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及 弱酸性溶液中常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色 局部带正电荷，因此碱性染料的染色局部很容易与微生物细胞结 合使其着色。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红 等。
当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带
正电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红
微生物染色实验报告
一、实验题目：微生物的革兰氏染色二、实验目的：1. 学习并初步掌握革兰氏染色法；2. 了解革兰氏染色的原理；3. 巩固显微镜的使用；4. 培养实验操作技能，提高观察和分析能力。
三、实验原理：革兰氏染色是细菌学中最重要的鉴别染色法，根据细菌细胞壁的结构差异，将细菌分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）。
革兰氏阳性菌细胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易渗入；革兰氏阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，脂质含量多，乙醇易渗入。
在革兰氏染色过程中，G+菌被染成紫色且不被酒精脱色，而G-菌则被染成红色。
四、实验材料：1. 实验器材：已接种大肠杆菌的培养皿、接种环、酒精灯、玻璃铅笔、显微镜、香柏油、擦镜纸、二甲苯；2. 实验试剂：革兰染色液（结晶紫、卢戈碘液、95%乙醇、稀释复红染液）。
五、实验步骤：1. 涂片制备：取干净载玻片1块，用玻璃铅笔划分加样区域，做好标记，并在各分区分别用接种环取生理盐水2环，置于玻片上，接种环灭菌后，取细菌培养物少许与盐水混匀，并涂成均匀薄膜涂片。
如用液体材料，如痰、尿液、脓汁等可直接涂片，不必加生理盐水。
干燥：涂片最好在室温下自然干燥，必要时可将标本面向上，小心间断地在弱火高处烘干，但切勿紧靠火焰将涂膜烤枯。
固定：涂片干燥后，将标本片在酒精灯上快速的来回通过三次，共约2s～3s，注意温度不可太高，以涂片涂膜的反面触及皮肤觉轻微烫觉即可。
固定目的：杀死细菌；使菌体与玻片粘附较牢，在染色时不致被染液和水冲掉；菌体蛋白变性易着色。
2. 结晶紫初染：将涂片放入含有结晶紫的染液中，染色1分钟；3. 卢戈碘液媒染：将涂片取出，放入卢戈碘液中，媒染1分钟；4. 95%乙醇脱色：将涂片取出，放入95%乙醇中，脱色30秒～1分钟；5. 稀释复红染液复染：将涂片取出，放入稀释复红染液中，复染1分钟；6. 油镜观察：将涂片放入显微镜油镜下观察。
六、实验结果：1. 革兰氏阳性菌：细胞呈紫色，细胞壁较厚，边缘清晰；2. 革兰氏阴性菌：细胞呈红色，细胞壁较薄，边缘模糊。
微生物学实验-简单染色与革兰氏染色
（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3 次固定（以不烫手为宜）。
1 简单染色：
实验方法
2 革兰氏染色： （7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色30 s
左右至流出液无色，立即水洗。
（9）复染：滴加蕃红复染2 min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水
纸吸干。
（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油 镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
实验器材
菌种： 苏云金芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌 液体培养12-16h的枯草芽胞杆菌和培养24h的大肠 杆菌
染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、蕃红、 美蓝、醇醚、香柏油
器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、 擦镜纸（脱脂棉）、显微镜
实验方法
1 简单染色： （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片上滴2滴蒸馏
实验完毕后的处理
将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净： （1）先用脱脂棉将油镜头上的油擦去。 （2）用脱脂棉沾少许醇醚将镜头擦2—3次。 （3）再用干净的脱脂棉将镜头擦2—3次。 （4）注意擦镜头时向一个方向擦拭。
注意事项
1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度， 革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色 时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性 菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多 少等因素的影响，难以严格规定。
2 革兰氏染色： （1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 （2）晾干：与简单染色法相同。 （3）固定，与简单染色法相同 （4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，
微生物的革兰氏染色实验报告doc
微生物的革兰氏染色实验报告.doc 微生物的革兰氏染色实验报告一、实验目的和要求本次实验的目的是学习并掌握革兰氏染色的基本原理和操作方法，了解革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁结构和染色特性的差异，以及革兰氏染色在微生物学研究和临床诊断中的应用价值。
实验要求学生掌握革兰氏染色的步骤和注意事项，能独立进行革兰氏染色操作，并能对染色结果进行正确分析和解释。
二、实验原理和方法革兰氏染色是一种常用的细菌分类和鉴定方法，其基本原理是通过不同的染色步骤和处理条件，使细菌细胞壁上的化学成分产生不同的反应，从而导致细菌细胞呈现出不同的颜色。
革兰氏阳性菌的细胞壁较厚，主要由肽聚糖和磷壁酸组成，能够抵抗革兰氏染色的脱色剂乙醇的处理，因此能够保留结晶紫的颜色，呈现出紫色。
而革兰氏阴性菌的细胞壁较薄，主要由脂蛋白、磷脂和脂多糖组成，容易被乙醇脱色，再用复染剂番红染色后呈现出红色。
革兰氏染色的具体步骤如下：1.涂片：在干净的载玻片上滴一滴无菌水，用接种环取少量细菌与水滴充分混合，制成薄而均匀的涂片。
2.固定：将涂片在空气中自然干燥或用火焰固定。
3.初染：用结晶紫染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
4.媒染：用碘液媒染1分钟，用水冲洗。
5.脱色：用95%乙醇脱色30秒-1分钟，用水冲洗。
6.复染：用番红染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
7.镜检：用油镜观察并记录细菌的颜色和形态。
三、实验步骤和结果本次实验选用大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的代表，按照上述步骤进行革兰氏染色操作。
具体步骤如下：1.在干净的载玻片上滴一滴无菌水，用接种环取少量大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别与水滴充分混合，制成薄而均匀的涂片。
2.将涂片在空气中自然干燥或用火焰固定。
3.用结晶紫染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
4.用碘液媒染1分钟，用水冲洗。
5.用95%乙醇脱色30秒-1分钟，用水冲洗。
6.用番红染色液染色1-2分钟，用水冲洗。
实验细菌的简单染色与革兰氏染色
掌握简单染色和革兰氏染色的操作方法
简单染色
将细菌涂片或培养物直接与染料混合 ，然后进行观察。操作简单，适用于 初步观察细菌形态。
革兰氏染色
一种特殊的染色方法，通过结晶紫初 染、碘液媒染、酒精脱色和沙黄复染 等步骤，将细菌分为革兰氏阳性菌和 革兰氏阴性菌两类。
出版年份：XXXX年
THANK YOU
简单染色方法简便，操作相对容易，但只能显示细菌的形态 和结构，不能提供细菌的种类信息。
革兰氏染色原理
01
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03
04
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革兰氏染色是一种常用 的细菌鉴别染色法，通 过使用结晶紫、碘液和 酒精等染料对细菌进行 染色，能够将细菌分为 革兰氏阳性菌和革兰氏 阴性菌两大类。
革兰氏染色的原理主要 是基于细菌细胞壁的成 分和结构不同，导致对 染料的吸附和着色能力 。
复染
将涂片浸入稀释后的伊 红或沙黄染色液中，染
色一定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除 染色液。
观察
在显微镜下观察染色结 果，判断细菌是革兰氏
阳性还是阴性。
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实验结果与分析
简单染色结果与分析
染色结果
通过简单染色法，细菌被 染上了不同的颜色，如红 色或紫色。
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涂片制备
将细菌均匀涂在载玻片上，晾 干。
染色
将涂片浸入染色液中，染色一 定时间后取出。
冲洗
用清水冲洗涂片，去除染色液 。
观察
在显微镜下观察染色结果，判 断细菌类型。
革兰氏染色步骤
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涂片制备
微生物实验思考题参考答案及知识要点
微生物实验思考题参考答案及知识要点二. 细菌的简单染色和革兰氏染色1. 革兰氏染色中那一步是关键?为什么？你是如何操作的？革兰氏染色的关键步骤是：乙醇脱色（是脱色时间）。
如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阳性菌。
脱色时间的长短还受涂片的厚薄，脱色是玻片晃动的快慢及乙醇用量的多少等因素的影响，难以严格规定（脱色是应当控制速度，脱色时间一般为20—30s）。
2.固定的目的之一是杀死菌体，这与自然死亡的菌体有何不同？自然死亡的菌体本身已经部分自溶，结构已经改变。
固定杀死细菌时细菌结构是保持死亡时的状态的。
3. 不经复染这一步能否区分革兰氏阳性菌和阴性菌？能。
在酒精脱色后，不被酒精脱色而保留紫色者为革兰氏阳性菌（G＋），被酒精脱色为革兰氏阴性菌。
最后一步用番红染液复染，是为了让结果更清楚。
4.涂片为什么要固定，固定适应注意什么问题？a 杀死细菌并使菌体黏附与玻片上；b 增加其对染料的亲和力。
固定时应注意：手持玻片，菌膜朝上，在微火过3次（手指触摸玻片反面，不烫手为宜），固定时应尽可能维持细胞原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
三. 霉菌、放线菌的形态观察1. 镜检时，如何区分基内菌丝与气生菌丝？一般气生菌丝颜色较深，直生或分枝丝状，比基内菌丝粗；而基内菌丝色浅、发亮，可看到横隔膜，继而断裂成球状或杆状小体。
2. 显微镜下细菌放线菌酵母菌和霉菌的主要区别是什么？放线菌与细菌需要在油镜下才能观察清楚，而霉菌和酵母菌在低倍镜下即可看到。
细菌：为细而短的单细胞微生物（个体微小），主要形态有：球、杆、螺旋状等。
（部分杆菌还可形成芽孢）放线菌：存在分枝丝状体和菌丝体，革兰氏阳性菌，有孢子丝和孢子（球形、椭圆形、杆状、柱状）。
酵母菌：单细胞，菌体呈圆球、卵形或椭圆形，少数呈柠檬形、尖形等。
菌体比细菌大几倍到几十倍，部分处于出芽繁殖过程中菌体还可观察到芽体，大多数菌体上还有芽痕。
细菌的简单染色和革兰染色
细菌的简单染色和革兰染色实验三细菌的简单染色和革兰染色一．实验目的1．学习并熟练局部无菌操作2. 学习细菌涂片的制法，掌握细菌简单染色和革兰氏染色的方法3. 进一步熟悉显微镜的使用。
二．实验原理细菌生长时常带负电，所以常用带正电的碱性染料染色。
简单染色就是用一种染料染色的方法。
革兰氏染色可把细菌根据细胞壁成分和结构分为阳性和阴性，阳性菌细胞壁中脂类物质多，染色为紫色；阴性菌细胞壁中脂类物质少，染色为红色。
三．实验材料、仪器与试剂1.菌种：金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，大肠杆菌、未知菌，酵母。
2.仪器用品：显微镜、载玻片，盖玻片，擦镜纸，接种环，酒精灯，火柴，镊子，擦镜液，吸水纸，牙签3.试剂：简单染液：草酸铵甲紫染液，蕃红染液革兰氏染液：1) 草酸铵甲紫染液；2) 革氏碘液；3) 脱色液；4) 蕃红染液实验前准备（助教完成）将菌种培育24h。
四．实验步骤（一）简单染色1.取载玻片用纱布擦干，在涂菌面反面画直径2mm左右的小圈，把涂菌部位在火焰上烤一下，除去油脂。
2.涂片：左手持菌液试管，右手持接种环在火焰中烧灼灭菌，等冷却后从EP管中沾取菌液一滴，在洁净无脂的载玻片上涂涂膜。
取菌过程要在酒精灯附近的无菌环境中进行。
3.晾干：让涂片自然晾干。
4.固定：让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）。
5.染色：将固定过的涂片放吸水纸上，滴加草酸铵结晶紫液，染1min。
6.水洗：用水缓慢冲洗涂片上的染色液7.镜检。
（二）革兰染色。
1.制片：取菌液制成涂片：干燥，固定。
2.初染：滴加1滴结晶紫色染液，1min，水洗。
3.媒染：滴加1滴碘液，染1min，水洗。
4.脱色：吸去残留水，滴加脱色液至流出液无紫色，立即水洗。
5.复染：滴加蕃红复染3min，水洗。
6.镜检：用吸水纸吸干，盖上盖玻片，从低倍镜到油镜依次观察。
注意细菌形态、大小、排列、颜色。
7.拍照。
（三）选做实验往干净的载波片上滴加半滴水，用无菌牙签取一点牙垢，涂抹在水滴上，制成涂片，革兰染色。
细菌的简单染色与革兰氏染色实验报告（共4篇）
细菌的简单染色与革兰氏染色实验报告(共4篇)细菌的简单染色和革兰氏染色实验细菌的简单染色和革兰氏染色实验实验目的1. 学习微生物涂片，染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。
、2. 巩固显微镜的使用方法。
基本原理1. 简单染色法:用单一染料对细菌进行染色的方法。
此法操作简单，适用于一般形态的观察。
在中性，碱性或酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以用碱性染料进行染色。
碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易于带负电荷的细菌结合而是细菌着色。
带正电的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。
通常的碱性染料除了美蓝外，还有结晶紫，碱性复红，番红等。
细菌体积较小，较透明，如未经染色常不易识别，而经染色后与背景形成鲜明的对比，是易于在显微镜下观察。
2. 革兰氏染色法:将所有的细菌分成革兰氏阳性菌G+)和革兰氏阴性菌(G-)两大类，是细菌上最常用的鉴别染色法。
该染色法所以将细菌分为G+和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同决定的。
G-菌的细胞壁中含有较多易被乙酸溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄，交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使染色的结晶紫和碘的复合物易于渗透，结果细菌被脱色，在经复红染色后就成了红色。
G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时颜色。
革兰氏染色需要四种不同的溶液，碱性染料初染液，煤染剂，脱色剂和复染液。
碱性染料初染液的作用像在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。
媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或付着力，即已某种方式帮助染料固定在细胞上，是不易脱落，碘是常用的媒染剂。
脱色剂是被染色的细胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95%的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染剂，复染的目的是使被脱落的细胞染上不同于初染液的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的染色液是复红。
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色
实验六微生物的简单染色及革兰氏染色利用显微镜对微生物细胞形态、结构、大小和排列进行观察前，首先要将微生物样品置于载玻片上、染色，为观察到真实、完整的生物形态结构，根据不同微生物的特点采取不同的制片及染色方法。
微生物细胞个体微小且较透明，在光学显微镜下难以将其与背景区分开而看清。
所以，在利用光学显微镜对微生物进行观察前，需要利用染料对微生物进行染色，使着色细胞或结构与背景形成鲜明对比，以便更清晰地观察微生物细胞形态及结构特征。
微生物的另一个特点是种类繁多，不同微生物细胞结构各异，对各类细胞染料的结合能力不同，研究者必须根据所要观察的微生物特点及观察目标，选用适宜的染色技术。
（一）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的制片和简单染色一、目的要求1.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。
2.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别。
3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
二、基本原理对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。
利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。
用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够形成盐。
不含有助色基团而仅具有发色基团的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱性成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。
常用的微生物细胞颜料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝（亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括碱性复红、伊红及刚果红等。
通常采用碱性染料进行染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而染料电力红染色部分带正电荷，很容与细胞结合使其着色；当细胞处于弱酸条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。
实训五细菌的简单染色和革兰氏染色试验目的1掌握染色的原理
实训五细菌的简单染色和革兰氏染色一、实验目的1. 掌握染色的原理和操作过程2. 掌握简单染色和革兰氏染色方法与规范操作3. 规范正确使用普通光学显微镜二、实验原理由于细菌菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。
革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。
通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。
其过程是：草酸铵结晶紫初染→路哥氏氏碘液媒染→95%乙醇脱色→蕃红花红复染。
若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌，若被乙醇脱色而被蕃红复染成红色，则称革兰氏阴性菌。
革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁的结构和组成不同决定的。
实际上，当用结晶紫初染后，象简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。
碘作为媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增强了染料与细菌的结合力。
当用脱色剂处理时，两类细菌的脱色效果是不同的。
革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成、壁厚、类脂质含量低，用乙醇（或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。
革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽聚糖层较薄，类脂含量高，所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。
三、实验器材显微镜、载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、吸水纸、接种环、镊子、草酸铵结晶紫色液、路哥氏碘液、95%乙醇、蕃红花红染色液、菌落培养物（培养18～24小时）、二甲苯、香柏油四、操作步骤（一）简单染色法1．涂片取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。
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实验六微生物的简单染色及革兰氏染色
利用显微镜对微生物细胞形态、结构、大小和排列进行观察前，首先要将微生物样品置于载玻片上、染色，为观察到真实、完整的生物形态结构，根据不同微生物的特点采取不同的制片及染色方法。
微生物细胞个体微小且较透明，在光学显微镜下难以将其与背景区分开而看清。
所以，在利用光学显微镜对微生物进行观察前，需要利用染料对微生物进行染色，使着色细胞或结构与背景形成鲜明对比，以便更清晰地观察微生物细胞形态及结构特征。
微生物的另一个特点是种类繁多，不同微生物细胞结构各异，对各类细胞染料的结合能力不同，研究者必须根据所要观察的微生物特点及观察目标，选用适宜的染色技术。
（一）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的制片和简单染色
一、目的要求
1.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。
2.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别。
3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
二、基本原理
对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。
利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。
用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。
发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够形成盐。
不含有助色基团而仅具有发色基团的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱性成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。
常用的微生物细胞颜料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝（亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括碱性复红、伊红及刚果红等。
通常采用碱性染料进行染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而染料电力红染色部分带正电荷，很容与细胞结合使其着色；当细胞处于弱酸条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。
三、实验器材与试剂
1.菌种：枯草芽胞杆菌12-18小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌24小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。
2.溶液和试剂：草酸铵结晶紫染液、齐氏石炭酸复红染液、吕氏碱性美蓝染液、革兰氏染色用碘液、乳酸石炭酸棉蓝染液。
3.仪器和其他用品：酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸和接种环、接种铲、接种针、镊子、载玻片夹子、载玻片支架、玻璃纸、平皿、U型玻璃棒、滴管、解剖针、解剖刀、生理盐水50%乙醇、20%甘油、高氏一号培养基平板、马铃薯琼脂薄层平板等。
四、操作步骤
安全警示
1.加热固定时要使用载玻片夹子，以免烫伤。
不要将载玻片在火焰上烧烤时间过长，以免载玻片破裂。
2.使用燃料时避免占到衣服上。
3.进行放线菌和霉菌制片时减少空气流动，避免吸入孢子。
4.实验完毕后洗手，金黄色铺头球菌为条件致病菌，二甲苯为有毒物质。
（一）细菌制片及简单染色
1.涂片
取一块载玻片，用记号笔平均分为两个区域标记；各滴一小滴生理盐水与两个区域中央；用接种环无菌操作分别有枯草芽胞杆菌营养琼脂斜面和金环色葡萄球菌营养琼脂细面挑取适量菌苔，将占有菌苔的接种环置于载玻片上的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。
若用液体培养物涂片，可用接种环蘸取1-2环菌液直接涂于载玻片上。
2.干燥
自然干燥或用电吹风干燥。
3.固定
涂菌面朝上，通过火焰2-3次。
4.染色
将载玻片平放于载玻片支架上，滴加染液覆盖图菌部位即可，吕氏碱性美蓝染液1.5分钟，结晶紫染液或齐氏石碳酸复红染液1分钟。
5.水洗
倾去染液，自来水冲洗，水流不宜过急、过大，不要直接冲涂片处，至洗出水无色为止。
6.干燥
用吸水纸洗去过多水分，自然干燥或电吹风吹干。
7.镜检
将制备好的样片置于显微镜下进行观察、记录。
获得本实验成功关键
1.涂片时取菌量要适宜且要涂抹均匀，避免贪多造成菌体堆积而难以看清细胞具体形态。
同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞。
2.无菌操作取菌时一定要等接种环冷却后再取菌，以免高温时菌体变形。
3.必须等涂片干燥后加热固定，避免加热时间过长，否则细胞会破裂或变形。
(二)革兰氏染色法
一、目的要求
1、学习并掌握革兰氏染色法
2、了解革兰氏染色原理。
3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。
二、基本原理
革兰氏染色法可以将细菌分成革兰氏阳性和革兰氏阴性两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。
首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。
然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。
之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。
阳性细菌细胞壁上肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网口收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。
而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红色）
三、实验器材与试剂
1.菌种：大肠杆菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。
2.溶液和试剂：革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液95%乙醇、番红复染液等。
3.仪器和其它用品：酒精灯、载玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、接种环、试管架、镊子、载玻片夹子、载玻片支架、滤纸、滴管和无菌生理盐水等。
本实验为什么采用上述生物？
大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰式阳性球状细菌，经过革兰氏染色，两者着不同染色，同时，由于两者具有不同的个体形态，在它们的混合图片上进行革兰氏染色后，根据菌体颜色和形态差异，可以判断染色是否成功。
四、操作步骤
1、制片
取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不宜过厚）、干燥和固定。
2、初染
低价草酸铵结晶紫染液覆盖图菌部位，染色1-2min红倾去染液，水洗至流出水无色。
3、媒染
先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，在用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。
4、脱色
将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色（一般20-30s）当流出液体无色时立即用水洗去乙醇。
5、复染
将玻片上残留水用吸水纸吸取，用番红复染液染色2min，吸去残水晾干。
6、镜检
油镜观察。
7、混合涂片染色
在载玻片同一区域用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片，其他步骤如上。
获得本实验成功的关键
选用活跃期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。
涂片不宜过厚，脱色不完全造成假阳性。
脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。
五、实验结果与讨论
1.结果（1）绘出油镜下观察的混合区菌体图像。
（2）填写表
菌名
菌体颜色
细菌形态
结果
大肠杆菌
金黄色葡头球菌
2思考题
(1)革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？
(2)现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性，如何确定你的染色结果的正确性？
(3)为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阳性？
(4)你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在何种情况下可以省略？
(5)Gram在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时，经过染色，某些细菌（如肺炎球菌）保持蓝紫色，肺部组织背景为浅黄色，为什么肺部组织细胞未被染上蓝紫色？
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