包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体蛋白质复性纯化
IEX Q Sepharose FF
Belew, M. et al. (1994) J.Chromatogr. A, 679: 67-83
GF Superdex 75 Prep Grade
E.g2:
大肠杆菌包涵体表达 (His)6 融
合蛋白的扩增，纯化和复性过程细胞培养 收获细胞 细胞破碎
32
离心 5 - 10 000g
2.去垢剂：如强的阴离子去垢剂SDS，可以 破坏蛋白内的疏水键，避免蛋白形成疏水核 心，可以增溶几乎所有的蛋白。但由于SDS 无法彻底的去除而不允许在制药过程中使用 （研究）。
3.极端pH：可以破坏蛋白的次级键从而增溶蛋 白。如在pH>9.0溶解牛生长激素和牛凝乳蛋白 酶包涵体。有些蛋白可以溶解在60mMHCl中。 这些方法只适合于少部分蛋白的增溶。
Market Proportion by Host Cells
(biopharmaceutical proteins or ”Pharmateins”)
Yeast: 28%
E. coli: 54%
Animal cell: 21% E. coli inclusion body route
occupies about a half
1.采用高浓度的变性剂，使其形成伸展的 肽链。常用的变性剂有尿素（8M）、盐酸胍 （GdnHCl 6-8M），通过离子间的相互作用， 破坏包涵体蛋白间的氢键而增溶蛋白。尿素的 增溶效果稍差，异氰硫酸胍（GdnSCN）最强。
变性剂的使用浓度和作用时间：一般在偏碱性的环 境中如pH8.0-9.0，尿素在碱性环境中不稳定。有些蛋 白只能用盐酸胍。增溶时一般室温过夜，但盐酸胍在 37度1小时便可以使多数蛋白完全变性溶解。
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
包涵体蛋白的纯化和复性
包涵体蛋白的纯化和复性包涵体蛋白的纯化和复性1．菌体的收集和破碎用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。
沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。
【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。
破碎后的匀浆，4℃、 12000 rpm离心15 min。
分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。
2．包涵体的处理洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
重复一次。
再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。
溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。
12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。
【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）3．目的蛋白的纯化亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。
谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
如何对包涵体蛋白进行表达与复性
如何对包涵体蛋白进行表达与复性包涵体即在某些生长条件下，在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈，包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。
一、包涵体蛋白的表达在平板上挑取单菌落，接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培养基中，37 ℃过夜培养，然后转接到100 ml LB 培养基中，37 ℃培养至A600 为0.4~0.6时，加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L 诱导3.5 h。
8000 r/min 离心5 min 收集菌体，加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl，冰浴下超声波破碎后12000 r/min离心30 min收集沉淀。
二、包涵体的洗涤在包涵体中加入包涵体洗涤液：50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl，w=0．5％TritonX-100，pH 8．0；，37℃振荡洗涤1～2 h，然后8 000 r/min 离心15 min，收集沉淀。
三、包涵体的溶解洗涤后的包涵体加入适量的(包涵体溶解液)：6 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，10 mmol/L β-ME，pH 8．0(注：β-ME用时现加)，于磁力搅拌器上搅拌过夜，1000 r/min离心30 min，取上清即得包涵体溶解液。
四、包涵体的复性包涵体的复性目前常用的主要有两种方式：1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释；2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂。
1.包涵体的稀释复性设定不同的复性条件：蛋白质量浓度、尿素浓度、温度、氧化还原条件、加入Ttiton X-100与环糊精的量、复性时间等，使变性溶解的包涵体稀释复性，复性一定时间后取样测酶活性。
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体旳纯化和复性总结ﻫ二、包涵体旳洗涤ﻫ1、包涵体旳洗涤问题ﻫ一般旳洗涤措施一般是洗不干净旳,我此前是这样做旳，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充足,过滤除去未溶解旳物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以始终稀释到合适旳浓度，你可以找到一种合适清除杂质旳措施，其实这就是梯度沉淀旳措施，我觉得比一般旳直接洗脱效果好。
ﻫﻫ包涵体一般难溶解,因此你要注意未溶解旳部分,你可以跑电泳对比，由于有时候难溶解旳就是你旳目旳蛋白，因此每次解决都要把上清和沉淀跑电泳对比,免得把目旳蛋白弄丢了。
ﻫ此外刚解决完旳包涵体好溶解。
冷冻后难溶解,溶解也需要长点时间,也需要大量旳溶剂。
如果说是不少不溶解旳不是你要旳，那就不用管了。
２、如何得到比较纯旳包涵体对于包涵体旳纯化,包涵体旳前解决是很重要旳。
ﻫ包涵体中重要具有重组蛋白,但也具有某些细菌成分,如某些外膜蛋白、质粒ＤＮA和其他杂质。
洗涤常用1%如下旳中性去垢剂，如Ｔwｅen、Trｉton、Ｌuｂｅｌ和ＮP40等加ＥDＴA和还原剂２-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加5０ mM ＮaCL。
这样提取旳包涵体纯度至少可达50％以上，并且可保持元构造。
也可用低浓度旳盐酸胍或尿素/中性去垢剂/ＥDTＡ/还原剂等洗去包涵体表面吸附旳大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液ｐH以与工程菌生理条件相近为宜，使用旳还原剂为0.1-5ｍM。
EDTA为0.1-0.3 mＭ。
去垢剂如Tｒiton X-1０0、脱氧胆酸盐和低浓度旳变性剂如尿素充足洗涤清除杂质，这一步很重要,由于大肠杆菌外膜蛋白Oｍp T(37 KDa)在4-8mｏｌ/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体旳溶解和复性过程中可导致重组蛋白质旳降解。
对于尿素和盐酸胍旳选择:尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强旳可逆性变性作用,所需浓度尿素8－10Ｍ，盐酸胍6-8M。
梯度透析法及稀释法蛋白的复性
蛋白的复性重组基因在表达宿主中表达量过高或合成速度过快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，导致蛋白以包涵体的形式存在。
导致包涵体形成的主要原因有以下几点：⑴重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。
⑵重组蛋白所处的环境：诱导温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
⑶重组蛋白是大肠杆菌(Escherichia coli)的异源蛋白，由于缺少真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
⑷有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。
包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。
包涵体复性在世界范围内都是个难题，最好的复性方法也不会超过20%。
目前大家在这方面研究也比较多，有研究证明一些分子伴侣有助于蛋白的复性；同时稀释、透析、渗透是最经典的蛋白复性的方法；另外氨基酸如精氨酸、糖类、醇类、表面活性剂对蛋白的复性都有辅助作用，还有很多的表达系统可以助复性。
本公司主要通过梯度透析和稀释的方法对变性蛋白进行复性。
梯度透析法梯度透析缓冲液配方：PBS（1L）：8.0NaCl、28.65gNa2HPO4·12H2O、0.234gNaH2PO4·2H2O缓冲液A：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100 缓冲液B：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton X-100、2M脲素缓冲液C：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、1%Triton-X-100、2M盐酸胍溶解缓冲液D：50mM Tris-HCl (pH8.5)、1mM EDTA、100mM NaCl、10mM β-巯基/乙醇/DTT、2mM脱氧胆酸钠、8M脲素复性缓冲液Ⅰ：50mM Tris-HCl (pH8.5)、100mM NaCl、6M/4M/2M脲素、1%甘氨酸、5%甘油、0.2%PEG、1mM氧化型谷胱甘肽、1mM还原型谷胱甘肽包涵体纯化及复性操作步骤：若蛋白以包涵体的形式纯在，则需要从包涵体中纯化出目的蛋白：1、大量诱导表达菌液，5000g离心10min，弃上清，用缓冲液A重悬，超声波破碎，功率45%，工作2s，暂停2s，破碎10min，，10,000g离心10min。
包涵体蛋白纯化步骤
包涵体蛋白纯化步骤生物日记部落，这次将会擦掉黑板上曾经书写的知识笔记，转角进入“包涵体蛋白”。
包涵体蛋白纯化的步骤主要包括裂解、洗涤、溶解、复性、纯化。
在实验前线着手于瓶瓶罐罐的大家，实验所纠结的问题或许总会缠绕身前身后，闯入梦中。
在情理之中时，又是怎么看待“处理实验问题”的态度？两天一个周期的实验结束，没有结果，暂且随之不作为，接着重复做一次。
小伙伴们，这是一种正确的态度么？“如果你的工具只有一柄铁锤，你就可能认为所有的问题都是铁钉”。
回想，变通，将路延伸在嘴巴上请教，预测时间进程，交叉重复，这是在过去灰色的记忆里想起的一位老师给我讲的一种态度。
将态度按照个人的素养去演绎变幻，就会有多条路，意外到问题本身。
——看的见的问题是态度本身包涵体蛋白纯化步骤包涵体洗涤包涵体溶解包涵体复性包涵体纯化1、包涵体裂解细胞内重组蛋白的提取要依照蛋白的来源和性质选择合适的方法，蛋白一般来源于细菌、植物、哺乳动物细胞等。
细胞裂解常用的方法有：酶解法、研磨、匀浆、超声破碎法、冻融等。
（1） 细胞酶解：在稀释菌液中加入0.2-0.4 mg/ml 溶菌酶、1 mM MgCl 2、20 μg/mlDNase 、1mM PMSF ，混均匀，冰上或者室温放置30 min 。
根据目的蛋白对温度的敏感性选择合适的温度。
向着太阳是向日葵不变的态度（2）机械裂解：加入1% Triton X-100,充分混匀，冰上放置15 min，在冰上用超声波破碎细胞10 min，至细胞变澄清，或在-20℃下冰冻，室温溶解，反复冻融5次以上；4 ℃，5000 r/min离心15 min，弃上清，用0.45 μm或0.22 μm的滤膜过滤除去细胞碎片；在细胞裂解时应该注意：a 尽量选择比较温和的处理方法，避免太剧烈地操作导致目的蛋白变性，或者蛋白酶释放。
b 为了保持蛋白质的稳定性，在蛋白的提取时应迅速，低温，添加蛋白酶抑制剂，例如，加入DFP（二异丙基氟磷酸）抑制或者减慢自容，加入碘乙酸抑制巯基作用的蛋白水解酶活性，加入PMSF（苯甲磺酰基氟化物）抑制蛋白水解酶的活性，另外，选择合适的缓冲溶液稳定蛋白溶液的PH值及离子强度，添加DNA酶降低核酸的粘稠度。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回:包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化与复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点:较高的活性蛋白质回收率;复性产物易于与错误折叠蛋白质分离;折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白;折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤:包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤,包涵体中主要含有重组蛋白,但也有一些杂质,如一些外膜蛋白、质粒DNA等,这些杂质会与包涵体粘连在一起,可以通过洗涤去除大多数杂质,但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂,如2M尿素在50mM Tris,pH7、0-8、5,1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温与去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片与膜蛋白。
同时,因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强,所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl,使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍,主要就是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白分子间的各种化学键,使多肽延伸。
盐酸胍就是较尿素强的变性剂,它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键,溶解一些包涵体蛋白质。
另外,从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体,通常含有一些链间形成的二硫键与链内的非活性二硫键,这就还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体,也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成与断裂就是可逆的,直到最有利的蛋白二硫键形成,这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素较盐酸胍慢而弱,溶解度为用尿素溶解具有不电离,呈中性,成(8-10M)70-90%本低,蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍(6-8M)溶解能力达95%以上,且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性就是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构,同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴！zbbnet wrote:最近实验遇到了大麻烦，说出来大伙帮忙想想法。
实验所用菌株为BL21，载体pMAL-p2X，与MBP融合表达，目的蛋白有三对二硫键。
最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达，但实验发现主要是包涵体表达。
菌体超声破碎后12000rpm离心，所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底，而是处于部分溶解状态，对沉淀再作如下处理：1、2M尿素洗涤，pH8.5，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀能够牢固的贴在管底。
2、4M尿素洗涤，pH9.0，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀为半溶状态的冻状物。
3、8M尿素溶解上述2中的沉淀，几乎不见不溶的颗粒，但溶液还是略显混浊。
上述三溶液取样电泳，均见较多的目的蛋白。
对3中的溶液取样调pH至12溶液依然混浊。
0.22um过滤，无法去除混浊物。
考虑到混浊物是多聚体，样品中加入1％SDS和0.2％β-Me，都无法改善。
做上述处理，主要考虑到混浊物是目的蛋白，因为目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。
主要想请教这样几个问题：1、有没有那位战友也碰上我上述的问题，这种问题是如何解决的？2、我所描述的包涵体的状态说明了什么问题？3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法？暂不讨论分泌表达的问题。
回答：1. 你的情况很正常，根据三次沉淀处理情况，应该可以肯定你的蛋白在8MUrea中是完全可以裂解的。
并且该蛋白如若作复性应该可溶性较佳。
但根据我个人的经验。
如果MBP融合蛋白还是以包含体表达的话是很没有意思的，建议作单独表达，除非单独表达不行。
否则即使完全复性，目的蛋白活性也大打折扣。
另可优化表达条件，有可能可容表达的，不要放弃，你的破菌上清也可以跑胶看看有没有目的蛋白。
2. 说明蛋白蔬水性不强。
3。
有些蛋白裂解后有浑浊非常正常，尤其是MBP融合的，即使做到可容也会有白乎乎浑浊的现象，只要不影响使用就行，没必要在意。
6HIS 包涵体蛋白纯化方法
6HIS 包涵体蛋白纯化—复性方法
1．摇500ml菌至OD小于0.5时加IPTG在37℃诱导表达3小时。
2．离心，将沉淀置于-20℃冻融。
(可无)
3．用8M尿素重溶沉淀：先用0.5ml tris-cl buffer 将沉淀吹打成悬浮状，再加入20ml 8M尿素，摇匀，室温于脱色摇床上摇20分钟，充分溶解沉淀。
4．12000rpm,15℃以上离心15分钟。
5．挂柱：取上清与平衡好的镍柱柱料混合，室温于脱色摇床上摇20分钟。
6．WASH:ph8.0尿素（8M）十倍体积
7．洗脱：PH5.0
8．选浓度OD在1.0以上的来透析，透析之前加1mMDTT,两种buffer:
IB solubilization(10×):caps(3-[Cyclohexylamino]-1-propanesulfonic acid) 500mM PH11.0 N-lauroylsarcosine(30%)10×
Sometimes: 3M NDSB(10×)
9．先加到4M 尿素in Tris 50mM，并加DTT到1mM按PH8.5
10. 降至2M, 成分同上，并加150mMNaCl
11. 降到1M 同10
12. 最后透析液：Tris 50mM
NaCl 150mM
DTT 1mM
PH8.2
13.再透析去掉DTT。
包涵体变性亲和层析复性方法
包涵体变性亲和层析复性方法包涵体变性及亲和层析复性方法实验材料裂解液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0洗涤液：20 mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 3M 尿素，pH 8.0变性液：20 mM Tris-HCl, 8M 尿素，0.5M NaCl，20mM 咪唑，pH 8.5洗脱液：20 mM Tris-HCl, 8M 尿素，500mM 咪唑，pH 8.5复性液：20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 M L-Arg, 0.5 mM GSH, 0.05 mM GSSG, 5% 甘油，1% PEG实验方法：1.包涵体的变性：收集菌体，加入裂解液，高压破碎，12000rpm 离心30min，沉淀中加入包涵体洗涤液，充分溶解，12000rpm离心30min取沉淀，加入变性液（1g包涵体加入15ml），碾压包涵体，置于室温充分溶解，12000rpm离心30min取上清。
2.包涵体的纯化：上述变性液上样至5 ml Ni柱，用变性液平衡，用pH 4.5的20 mM NaAc缓冲液洗涤三个柱体积，然后用含有55mM, 100mM及500mM咪唑的含8M尿素的洗脱液阶段梯度洗脱，每个梯度至少洗五个柱体积。
3.包涵体的复性：上述洗脱液进行SDS-PAGE鉴定，然后用变性液调节其浓度至0.5 mg/ml左右。
再透析至含有4M尿素的复性液中，10℃透析6 h，然后透析至含有2 M尿素的复性液中，透析8 h；再透析至含有1M尿素的复性液中，透析12h; 最后透析至储存缓冲液(20 mM Tris-HCl. 50 mM NaCl ,20 % 甘油, pH 8.0)中。
5000 rpm 离心10 min, 取上清进行还原胶及非还原胶鉴定，并进行酶学性质检测。
包涵体蛋白溶解和纯化复性
IFN-α重组蛋白包涵体溶解和蛋白纯化复性一、表达产物处理1、表达菌液8000rpm 4℃离心10min2、菌体沉淀按10:1（菌重5g，加50ml）裂解缓冲液，冰上超声至清亮（250W，超声5s，间歇5s，功率35%）3、取样取100ul 超声菌液并离心，标记超声上清，超声沉淀4、12000g 4℃离心15min，上清备用，标记超声上清5、超声沉淀用含2M 尿素的裂解缓冲液，以20:1 比例重悬，继续超声5min6、12000g 4℃离心20min7、超声沉淀用含1% Triton X-100 的裂解缓冲液重悬，4℃放置10min8、12000g 4℃离心15min，获得包涵体9、获得包涵体用Binding Bufer 重悬，4℃放置过夜二、包涵体的纯化1、放置过夜包涵体4℃高速离心，收集上清备用2、取样取离心上清，标记柱前3、使用Ni-NTA 基质进行纯化，用Binding Buffer 平衡Ni 柱，柱子平衡后低流速上样，整个上样过程使样品处于冰上，上样后用3~5 个柱体积的Wash Buffer 进行漂洗，最后用Elution Buffer 洗脱4、取样取柱后，标记柱后三、包涵体复性1、透析袋处理方法：把透析袋剪成适当长度（10~20cm）小段，在大体积的2% （W/V）NaHCO 3 和1mM EDTA (PH8.0)中将透析袋煮沸10min。
用蒸馏水彻底清洗透析袋。
放在1mM EDTA(PH8.0)中将之煮沸10min。
冷却后存放于4℃，必须确保透析袋始终浸没在溶液内。
从此时起取用透析袋时必须戴手套保持清洁，用前在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净2、复性采用梯度透析法，纯化后包涵体用含4M 尿素的透析缓冲液稀释蛋白浓度至约100ug/ml，从4M、2M、2M、0.5M 依次降低透析液中尿素浓度，每个浓度均4℃透析，4~6h 换新鲜透析液一次，高速离心去除沉淀。
最后用PBS(PH7.2) 4℃透析过夜。
His标签蛋白包涵体的变复性及其纯化
His标签蛋白纯化步骤若目的蛋白在上清表达,则使用试剂盒buffer(Novagen His?BindPurification Kit, 70239);若为包涵体,则需自配buffer。
(1)试剂准备①12.5mL 1×charge buffer (1.6mL原液+10.9mLSW)②32.5mL 1×binding buffer (4mL原液+28.5mLSW)③15mL 1×wash buffer (1.9mL原液+13.1mLSW)④15mL 1×Elute bu ffer (3.8mL原液+11.2mLSW)(2)装柱①盖上下盖,轻轻混匀His-bind Resin(若柱子不是首次使用,只需把已再生的柱床小心重悬,同样过夜沉降即可)。
②转移4mLHis-bind Resin至柱中,沿管壁流下,一次性加足,否则胶面会形成断面,影响吸附效果。
③用封口膜封住上口,置4℃冰箱,沉降过夜。
(3)过柱前准备(大约1h)①使胶床上液依重力自动流下。
②待留至床顶时,依次加入以下溶液(用滴管沿管壁小心加入,且要一次性加足)a.7.5mL无菌SWb.12.5mL 1×charge bufferc.7.5mL 1×binding buffer注:各步骤间连接要流畅,勿使胶床干燥(4)上样过程上样时同前一样,要小心贴壁加入,可一次性加满柱子(会使样品流有较大压力),随时可补加样品,使柱子保持满的状态。
(5)洗脱依次加入:①25mL 1×binding buffer ②15mL 1×wash buffer ③15mL1×Elute buffer 收集前8管(首先塞上下面的塞子,室温放置20min,再收集)跑PAGE胶,进行蛋白浓度测定。
(6)柱再生①1×strip buffer配制7.5mL 1×strip buffer:1.9mL原液+5.6mLSW②柱子纯化完后,加入7.5mL 1×strip buffer,洗涤至液面稍高于床顶,用塞子封住下口,直立放置4℃过夜③次日依次加入:5mL 6M盐酸胍0.2N乙酸(57.3g盐酸胍+1.2mL冰乙酸+SW→100mL)5mL SW2.5mL 2%SDS2.5mL 25%无水乙醇2.5mL 50%无水乙醇2.5mL 75%无水乙醇12.5mL 100%无水乙醇2.5mL 75%无水乙醇2.5mL 50%无水乙醇2.5mL 25%无水乙醇2.5mL SW12.5mL 100mM EDTA pH8.0 (1.861gEDTA+50mL SW调pH8.0) 7.5 mL SW7.5 mL20%无水乙醇(加满细柱部分)4℃保存柱子若His标签蛋白为包涵体,则需先进行变复性,步骤如下:①收集菌体(离心,8800rpm,15min),弃上清②PBS洗3遍③40mL(若为400mL菌液)1×binding buffer(非变性)重悬菌体,超声波裂解至菌液变澄清(中途可离心收集沉淀,再次重悬,裂解,以释放更多的杂蛋白)。
包涵体纯化复性指南
关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化.一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？2、表达重组蛋白时，细菌裂解方法都有哪些？3、酵母的破碎4、超声破碎的条件选择5、如何鉴定细菌超声破碎的程度6、细菌裂解的DNaseI7、超声裂解细菌是否完全？二、包涵体的洗涤1、包涵体的洗涤问题2、如何得到比较纯的包涵体三、关于包涵体的溶解：1、请教GST包涵体溶解2、包涵体的溶解3、有关包涵体的溶解问题4、8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?5、8M尿素溶解的包涵体溶液在室温下可以放多久而不出现问题?6、GST融合蛋白形成包含体不溶，咋办？四、包涵体的复性1、包涵体如何复性2、包涵体的复性23、包涵体复性34、SOS!!各位包涵体复性高手5、大家来谈谈包涵体复性问题6、包涵体复性形成聚集物7、复性中蛋白析出！8、包涵体复性液配方9、什么叫复性成功10、怎样鉴定融合蛋白复性是否成功五、包涵体的纯化复性以后的蛋白质的纯化策略与可溶性蛋白质相似，这里不再赘述。
（注：当然也可以先纯化然后再复性———一般多采用凝胶柱，或者纯化与复性同步进行———比如柱上复性。
）六、综述以及其他1、蛋白复性和纯化在线资料2、综述细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
包涵体复性方法-李
1、上清中亲和层析纯化蛋白（整个纯化过程在低温下操作）：
全菌采用50 mM Tris(pH8.0)，150 mM NaCl，20 mM Imidazole，2 mM DTT 含1% TritonX-100，1 μg/mL Pepstatin A，1 μg/mL Leupeptin 超声裂解，同时以50 mM Tris(pH8.0)，150 mMNaCl，20 mM Imidazole，2 mM DTT 缓冲液平衡Ni-IDA 亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE 分析检测；
2、包涵体通过亲和层析纯化蛋白
包涵体采用50 mM Tris (pH8.0)，150 mM NaCl 含1% Triton X-100，2 mM EDTA，2 mM DTT洗涤后，以50 mM Tris(pH8.0)，150 mM NaCl，8 M Urea，20 mM Imidazole，2 mM DTT 缓冲液溶解包涵体同时平衡Ni-IDA 柱，最后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE 分析检测。
3、经Ni-IDA 亲和层析纯化分析，收集纯度较高的梯度，将其加入到处理后的透析袋中，4 ℃环境下，透析到缓冲液［1×PBS(pH 7.4)，4 mM GSH，0.4 mM GSSG，2 mM EDTA，0.4 M L-Arginine，1 M Urea，2 mM DTT］中复性（搅拌，换一次液，不加搅拌一晚上换2次，），复性后最终透析于储存液1×PBS(pH7.4)，20% Glycerol，2 mM DTT 溶液约6-8 h。
透析复性结束后，上清用0.22μm 滤器过滤后分装，并将其冻存至-80℃。
包涵体制备,变复性,纯化
制备包涵体1、超声破碎细胞2、4 ℃，12000rpm，离心10 m in, 弃上清收集包涵体.3、所得的包涵体加入1\10 体积的体积分数为1% TritonX-100液洗涤2 次4、4 ℃、12 000 rpm、离心2 m in, 沉淀即为包涵体,包涵体蛋白的变性复性方法一1、在上述包涵体中加入19、7 mL 缓冲液A (50 mmol\L Tris-HCl, 0.5 mmol\LEDTA , 0.5mmol\L DTT , 50mmol\L NaCl, 5 % 甘油) 和0.3mL 20% N-十二烷基肌氨酸钠贮存液2、剧烈搅动重悬，25OC下磁力搅拌2-3h使沉淀缓慢溶解3、4 ℃，12 000 rpm、离心10 m in, 弃沉淀4、加入PEG-6000 (终体积分数为0、2% )、氧化型谷胱甘肽(终体积分数为1mmol\L )、还原型谷胱甘肽(终浓度为2 mmol\L ),静置2h5、以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL.方法二1、在上述包涵体中加入5mL 浓度为8mol\L 的尿素剧烈搅动, 25 ℃下用磁力搅拌器不断搅拌2～ 3 h 使沉淀缓慢溶解.2、4 ℃,12 000 rpm、离心10m in, 弃沉淀3、所得上清加入15mL pH8、0 的PBS 溶液(使尿素的浓度降低以利于复性) 以pH8、0 的PBS 缓冲液透析约20 h (期间换5～ 6 次透析液) , 然后用PEG-20000 浓缩到约1 mL.检测1、取出30 uL 备用2、向30 uL样品中加入7、5 uL 的5 倍LSB上样缓冲液, 100℃沸水处理5～10 min, 离心后取5 uL 上清上样, SDS-PAGE 检测相关试剂Triton X-100是一种比较温和的去垢剂（表面活性剂或称界面活性剂），常作为添加剂使蛋白保持稳定，尤其是膜蛋白。
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程
包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。
盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
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包涵体纯化蛋白复性得方法操作流程
返回:包涵体复性常见问题分析与解决
包涵体得纯化与复性总结
包涵体折叠复性得方法应具备以下几个特点:较高得活性蛋白质回收率;复性产物易于与错误折叠蛋白质分离;折叠复性后能够得到较高浓度得蛋白;折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性得过程通常分为以下几个步骤:
包涵体得洗涤
包涵体在溶解之前需要进行洗涤,包涵体中主要含有重组蛋白,但也有一些杂质,如一些外膜蛋白、质粒DNA等,这些杂质会与包涵体粘连在一起,可以通过洗涤去除大多数杂质,但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体得洗涤通常选用浓度较低得变性剂,如2Ｍ尿素在５0mM Trｉｓ,ｐH７。
0－8。
5,1mＭEDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温与去垢剂ＴritonX-100洗涤去除膜碎片与膜蛋白。
同时,因为去垢剂得洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强,所以在洗涤包涵体时可加入低浓度得尿素或高浓度得NaCｌ,使包涵体得纯度达到50%以上。
包涵体得溶解
变性剂如尿素、盐酸胍,主要就是通过离子间得相互作用,打断包涵体蛋白分子间得各种化学键,使多肽延伸。
盐酸胍就是较尿素强得变性剂,它能溶解尿素不溶得包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Saｒkosｙl等也可以破坏蛋白内得疏水键,溶解一些包涵体蛋白质。
另外,从某些含有半胱氨酸得蛋白质中分离出得包涵体,通常含有一些链间形成得二硫键与链内得非活性二硫键,这就还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DＴT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体,也会被复性用得二硫化物置换试剂所取代。
二硫键得形成与断裂就是可逆得,直到最有利得蛋白二硫键形成,这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比
尿素(8－１较盐酸胍慢而弱,溶解度为7用尿素溶解具有不电离,呈中性,成
0Ｍ)０－90%本低,蛋白质复性后除去不会造成大
量蛋白质沉淀
溶解得包涵体可选用多种色谱法纯
化
盐酸胍(６-8M)溶解能力达9５%以上,且溶解
作用快而不造成重组蛋白质得
共价修饰
成本高、在酸性条件下易产生沉淀、
复性后除去可能造成大量蛋白质沉
淀ﻫ对蛋白质离子交换色谱有干扰
包涵体得复性
复性就是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展得变性状态恢复到正常得折叠结构,同时去除还原剂确保二硫键正常形成、一般在尿素浓度4Ｍ左右时复性过程开始,到2M左右时结束;盐酸胍可以从4M开始,到1、5M时结束。
复性方法主要采用稀释复性,透析复性与柱上复性,具体对比如下:
复性
技术
简介优点缺点
稀释复性用折叠缓冲液快速稀释溶解得包涵体蛋
白质溶液,达到降低变性剂浓度得目得,
使去折叠得蛋白质进行再折叠
简单
慢
蛋白会被稀释到
很低浓度
体积增加较大,变
性剂稀释速度太
快,不易控制
透析复性通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂
去除速度
简单
不增加体积
慢
使用大量缓冲液ﻫ
不适合大规模操
作,无法应用到生
产规模
分子筛层析分子筛效应可将蛋白质与小分子变性剂
分离,实现溶液交换与蛋白质得折叠
在一步操作中
直接进行自动
化复性并纯化
样品体积受限
离子交换减少导致蛋白质聚集得分子间相互作
用,可将蛋白质结合在分离介质上,达到
溶液中变性剂浓度得稀释与蛋白质得折
快速并简单ﻫ
直接进行自动
应避免使用与离
子交换自相反电
层析叠化荷得添加
复性得检测
根据具体得蛋白性质与需要,可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质得复性效率进行检测。
1.凝胶电泳:一般可以用非变性得聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性与天然状态得蛋
白质,或用非还原得聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键得蛋白复性后二硫键得配对情况。
2.光谱学方法:可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱(CD)等,利用两种状态下得
光谱学特征进行复性情况得检测,但一般只用于复性研究中得过程检测。
3.色谱方法:如IEX、ＲP－HPLＣ、ＣＥ等,由于两种状态得蛋白色谱行为不同。
4.生物学活性及比活测定:一般用细胞方法或生化方法进行测定,较好得反映了复性蛋
白得活性,值得注意得就是,不同得测活方法测得得结果不同,而且常常不能完全反映体内活性。
5.黏度与浊度测定:复性后得蛋白溶解度增加,变性状态时由于疏水残基暴露,一般水溶
性很差,大多形成可见得沉淀析出。
6.免疫学方法:如ELIＳA、WESTERN等,特别就是对结构决定簇得抗体检验,比较真实得
反映了蛋白质得折叠状态。
蛋白复性过程得添加剂
1.共溶剂:如PＥG6０00—20０0０,据说可以可逆得修饰折叠中间体得疏水集团,此外由
于阻止了蛋白质分子间得相互接触得机会,也可能对复性效率得提高起作用。
一般得使用浓度在０、1％左右,具体条件可根据实验条件确定。
2.二硫键异构酶(PDI)与脯氨酸异构酶(PPＩ):ＰDI可以使错配得二硫键打开并重新组合,
从而有利于恢复到正常得结构,此外在复性过程中蛋白质得脯氨酸两种构象间得转变需要较高能量,常常就是复性过程中得限速步骤,而PPI得作用就是促进两种构象间得转变,从而促进复性得进行。
3.分子伴侣,即热休克蛋白(ＨＳＰ),就是一种没有蛋白质特异性得促进折叠得蛋白因子,
研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确得折叠、有人构建了与伴侣分子共同表达得菌株,据说效果不错、不过在生产中还没有瞧到2与３得应用得例子。
4.0.４－０、6ML－Ａｒｇ:成功得应用于很多蛋白如t—PＡ得复性中,可以抑制二聚体
得形成。
5.甘油:增加黏度,减少分子碰撞机会,一般使用浓度在5％－3０％。
6.辅助因子:添加蛋白质活性状态必须得辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时
候对蛋白质正确得折叠就是有利得。
色谱法:通过将目标蛋白结合到层析柱上,减少
蛋白分子间得相互影响,该方法得到越来越多得应用,常用得色谱有SEC、ＨＩＣ、ＩＥC、IＭＡC等。
案例介绍
包涵体沉淀得溶解、重折叠与离子交换层析
材料与设备
Tｉｓｓ－Teaｒor？匀浆器
透析袋(Spectrａ／Por?6)
阳离子交换柱ﻫＳDS-PAGE电泳装置
试剂
缓冲液Ａ(1000ｍL)
1moｌ/ＬＴｒis—HCl(ＰH7、9)50mＬ,50mmol/Lﻫ0、５moｌ/ＬEDＴA
1mL,0、５ｍmol/L
５mol／LNaCｌ10mｌ,5０mmol／L
甘油50mL,５％ﻫ缓冲液A+50％甘油ﻫ脱氧胆酸钠(ＤOC)ﻫＮ-十二烷基胺酸钠(SKL)
操作程序
用N－十二烷基胺酸钠溶解包涵体沉淀
1.加18mL缓冲液Ａ与2mL 20％ＤＯC储存于包涵体沉淀中、用组织破碎器充分重悬
沉淀,室温下静置至少10min。
2.悬液于4℃、13000r／min离心１0min。
弃去上清(注意留样,样品C),为确保沉淀得到
充分洗涤,再次按步骤一得操作重悬沉淀。
将悬液分成俩个相等得部分,编号＃1与#2,于４℃、１3０00r/mｉn离心10mｉn。
3.对#1管中得沉淀,加19.7ｍＬ得缓冲液A与0.３mL得20％SKＬ储液、剧烈搅动使沉
淀慢慢溶解。
然后静置30mｉn、
4.＃1管中溶解得蛋白悬液,置于４℃、13000ｒ／ｍiｎ离心10mｉn、收集上清液,弃去
沉淀。
透析除去去污剂使可溶性蛋白重折叠
1.对溶解得物料进行蛋白定量测定(制作标准曲线时,必需用含有0.３％SKＬ得牛血清
蛋白)。
用缓冲液A+0.3% SＫL稀释,将溶解得蛋白浓度调至１mg/ｍL、
2.用缓冲液Ａ将溶解蛋白制备液稀释10倍,使蛋白终浓度约为0。
1mg／mL,SKL终浓度
约为0。
03％、
3.４℃下,溶解蛋白制备物(约2０0mL),用2000mL缓冲液Ａ透析8h(每4h,取15０uL样
品,用ＨPLC测定去垢剂含量),同时充分搅拌、然后换新鲜缓冲液并重复、
离子交换层析
1.从透析袋中移出经透析得蛋白质溶液,4℃、8０00r/ｍｉｎ离心２0min,除去所有聚集
物、
2.留上清(样品J),加载于POＲOＳ５０S阳离子交换柱,作为后一级得分级分离、
3.用缓冲液A洗涤层析用得介质,然后将其倾入带适配器接头得玻璃柱中,装成一总体
积为5ｍＬ得层析柱、用缓冲液Ａ+1moｌ/ＬＮaＣl洗柱。
并用缓冲液A平衡柱子。
4.如透析就是在低盐环境下进行,则可在室温下以4ｍL/min得流速直接将蛋白样品加
载于层析柱上。
5.用缓冲液A洗柱15min,然后在60ｍin内,以4mL／min得流速,进行梯度洗脱(0—1mol/
ＬNaＣl/缓冲液A)。
检测2６0nm与２８０nm处得吸收,分部收集4mL组分。
6.ＳDS—PAGE电泳分析各组分,并合并峰组分进行进一步分析。
合并得组分可通过对缓
冲液A+5０％透析,制备后储存。