细胞组织培养技术PPT幻灯片
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植物细胞组织培养(PPT)
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06.10.2020
主要有:
➢ 原生质体（Protoplast）培养 ➢ 悬浮细胞培养 ➢ 组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）培
养 ➢ 器官（胚，花药，子房，根和茎）培养
其中最常见的是愈伤组织培养。
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植物细胞组织培养范畴：
（广义）又叫离体培养：指从植物体分离出 符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等， 通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养 以获得再生的完整植株或生产具有经济价值 的其他产品的技术。
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三、植物组织培养的生理依据
植物生长调节物质对于植物细胞组织的分化和决定具 有关键性作用。它包括：生长素类、细胞分裂素类、 赤霉素、脱落酸、乙烯等
生长素类主要用于愈伤组织的形成，体细胞胚的产生及试管 苗的生根。常用的有2,4-D、NAA、IBA、IAA等。其作用强 弱为2,4-D>NAA>IBA>IAA。
细胞分裂素类则有促进细胞的分裂与分化，延迟组织的衰老， 促进芽的产生等作用。常用的有Zip(异戊烯腺嘌呤)、KT、6BA、ZT等作用强弱顺序为。Zip>KT>6-BA>ZT。
赤霉素则有促进已分化的芽伸长生长，打破种子休眠的作用。 常用的为GA3。
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四、植物组织培养的原理
★植物细胞全能性（Cellular totipotency）： 任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成
种子培养
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3. 组织或愈伤组织培养(tissue， callus culture) ：是对植物体的各部分
组织进行培养，如茎尖分生组织、形成层、 木质部、韧皮部、表皮组织、胚乳组织和薄 壁组织等等；或对由植物器官培养产生的愈 伤组织进行培养，二者均通过再分化诱导形 成植株.
《组织细胞培养技术》PPT课件
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5．胚乳培养 (endosperm culture)是研究 胚乳的功能、胚乳与胚的关系以及获得 无籽结实的三倍体植株的手段。
6．花粉和花药培养 (pollen / anther culture)：利用花粉具有整套染色体的特 点，诱导产生单倍体植株进行育种，可 以缩短育种周期，获得纯系。
养，使其产生完整植株的过程，也称为离体 培养（In Vitro Culture）。
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二、分类
根据接种外植体不同，分为：
茎尖培养 (shoot tip culture) 胚胎培养 (embryo/ovule/ovary culture) 花药/花粉培养（anther/pollen/microspore culture） 器官培养 (organ culture) 组织或愈伤组织培养 (tissue or callus culture) 细胞/原生质体培养 (cell/protoplast culture)来自编辑课件ppt33
• Organogenesis: The process of initiation and development of a structure that shows natural organ form and/or function.
• Embryogenesis: The process of initiation and development of embryos or embryo-like structures from somatic cells (Somatic embryogenesis).
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细胞是生物有机体的基本结构单位，特 别是植物细胞又是在生理上发育上具有 潜在全能性的单位。
组织培养技术PPT教学课件_1
2．生理说
从前面体细胞胚胎发生中的甜橙的驯化
组织的形成的实例中，不难分析，随着 不断的培养继代的进行，培养组织或细 胞中的内源激素平衡关系可能会发生改 变，而导致不能形态发生。在这种情况 下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化， 但并不一定就丧失了这种分化能力。因 而，在这种情况下，如果改变外部处理 条件，应该有可能使细胞的这种内在潜 力得到恢复。
Reinert及基合作者在栽培胡萝卜愈伤组织培养中( 培 养基均为White培养基)得到以下结果：
[NH4+—氮]（M） [NO3——氮] （M） 体胚发生数（个/2ml）
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40
1131±219
0
55
19±0.3
0
95
11.3±4.1
从上表可以分析得出，尽管高浓度的氧化态氮同样
可以诱导体细胞胚胎发生，但是其诱导率远远低于还 原态氮和氧化态氮配合使用时的诱导率。
③胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不 定芽的维管组织无此现象。
胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而 重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：如胚状 体产生伪数量比不定芽多；胚状体可制成人工种子， 便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母 体植株。这些对组织培养应用于育种是十分有利而重 要的。
组织或茎尖培养时的成功率常比侧芽或基部的芽要高，这可能和 它们生长较旺盛有产。（4）多年生的木本植物随着年龄的增加， 分生组织、茎尖和芽的培养越困难，特别是成年树较幼态树的培
养要困难得多，此时，常使用部分返幼阶段或年龄较低的根蘖苗
或不定芽做材料，或采取某些措施如将芽接在实生苗上，修剪、
保持高水平的水肥进行营养繁殖，或用细胞分裂素喷洒植株的方 法等。
（2）细胞分裂素类：
组织培养技术二PPT课件.ppt
母液的配制方法：
• 单配法：将培养基配方中的各种成分分别配成一定浓度的 母液。一般用a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶质。
• 混配法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称 量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混 合母液，浓度可用a mg/L表示，即配制一升培养基吸取该 母液a ml.
第二节 培养基的制备
• 一、母液(stock solution)的配制和保存 • 在植物组织培养工作中，配制培养基是日常必备的工作。为简便
起见，通常先配制一系列母液，即贮备液。所谓母液是欲配制液 的浓缩液，这样不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快 速移取，而且还便于低温保藏。一般母液配成比所需浓度高10100倍。母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机 物和激素类等。配制时注意一些离子之间易发生沉淀，如Ca2+ • 和S042+，Ca2+、Mg2+和PO43- 一起溶解后，会产生沉淀，一定 要充分溶解再放入母液中。配制母液时要用蒸馏水或重蒸馏水。 药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。药品的称量及定容都要 准确。各种药品先以少量水让其充分溶解，然后依次混合。一般 配成大量元素、微量元素、铁盐、维生素等母液，其中维生素、 氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。母液配好后放人冰箱 内低温保存，用时再按比例稀释。
湿度 (humidity)
• 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内主要受 培养基水分含量和封口材料的影响。前者又受琼脂含量的影响。 在冬季应适当减少琼脂用量，否则，将使培养基干硬，以致不利 于外植体接触或插进培养基，导致生长发育受阻。封口材料直接 影响容器内湿度情况，但封闭性较高的封口材料易引起透气性受 阻，也会导致植物生长发育受影响。
21植物组织与细胞培养技术PPT课件
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• （1）洗涤室
• 洗涤培养容器、小用具等，要求有工作台面、 上水和下水，水池、培养容器摆放支架、电源、 电热干燥箱等。洗涤室墙壁要有耐湿、防潮功 能。
• 新购进的玻璃器皿首先要用1%左右浓度的稀 盐酸将可溶性无机物除去，再用中性洗涤剂洗 涤，一般器皿的洗涤可用洗衣粉洗涤，或用洗 衣粉加热洗涤，用自来水冲洗干净。
• ②三角瓶 又叫三角烧瓶和锥形瓶，具有瓶口小，瓶底
大，培养面积大，受光好，易放置，培养效果好，在
❖2、奠基阶段（20世纪30年代中至50年代未）
两个重要发现：1、认识了B族维生素对植物生长的重要意义； 2、发现了生长素是一种天然的生长调节物质。
1933年我国的李继侗和沈同研究银杏的胚培养，将银杏胚乳提取物加入培养基， 获得成功。 1934年Went 发现了生长素。随后相继发现了吲哚丁酸、萘乙酸和2，4-D等。B 簇维生素。 1934年，美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的培养首 次获得了真正的成功。（培养基：无机盐、酵母提取物和蔗糖，后来用3种B族 维生素：吡哆醇、硫胺素和烟酸取代酵母浸提物获得成功） 1934年Gautheret在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现培养基中加了B族 维生素和IAA后，形成层的生长明显增加，揭示了B族维生素和IAA在植物组织 培养中的作用，直接导致了1939连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。 1939年Nobecourt的胡萝卜也建立了连续生长的培养物。 故三人被誉为植物组 织培养的奠基人。
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3、迅速发展阶段（20世纪60年代至现在）
1960年，Cocking用真菌纤维素酶在番茄幼根分离得到大量活性原生质体，开创了植 物原生质体和体细胞杂交研究工作。Kanta在植物试管受精研究中首次获得成功。 1960年，Morel用兰花茎尖培养实现了脱去病毒和快速繁殖方面已获成功，导致欧洲、 美洲和东南亚等许多国家兰花工业的兴起。（茎尖-原球茎-小植株） 1962年Murashige和Skoog发表了促进烟草组织快速生长的培养基组成，这就是目前我 们常用的MS培养基。 1964--1966年，印度的Guha和Maheshwari成功地在毛叶曼佗罗花药培养中由花粉诱 导得到了单倍体植株。
• （1）洗涤室
• 洗涤培养容器、小用具等，要求有工作台面、 上水和下水，水池、培养容器摆放支架、电源、 电热干燥箱等。洗涤室墙壁要有耐湿、防潮功 能。
• 新购进的玻璃器皿首先要用1%左右浓度的稀 盐酸将可溶性无机物除去，再用中性洗涤剂洗 涤，一般器皿的洗涤可用洗衣粉洗涤，或用洗 衣粉加热洗涤，用自来水冲洗干净。
• ②三角瓶 又叫三角烧瓶和锥形瓶，具有瓶口小，瓶底
大，培养面积大，受光好，易放置，培养效果好，在
❖2、奠基阶段（20世纪30年代中至50年代未）
两个重要发现：1、认识了B族维生素对植物生长的重要意义； 2、发现了生长素是一种天然的生长调节物质。
1933年我国的李继侗和沈同研究银杏的胚培养，将银杏胚乳提取物加入培养基， 获得成功。 1934年Went 发现了生长素。随后相继发现了吲哚丁酸、萘乙酸和2，4-D等。B 簇维生素。 1934年，美国的White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的培养首 次获得了真正的成功。（培养基：无机盐、酵母提取物和蔗糖，后来用3种B族 维生素：吡哆醇、硫胺素和烟酸取代酵母浸提物获得成功） 1934年Gautheret在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现培养基中加了B族 维生素和IAA后，形成层的生长明显增加，揭示了B族维生素和IAA在植物组织 培养中的作用，直接导致了1939连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。 1939年Nobecourt的胡萝卜也建立了连续生长的培养物。 故三人被誉为植物组 织培养的奠基人。
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3、迅速发展阶段（20世纪60年代至现在）
1960年，Cocking用真菌纤维素酶在番茄幼根分离得到大量活性原生质体，开创了植 物原生质体和体细胞杂交研究工作。Kanta在植物试管受精研究中首次获得成功。 1960年，Morel用兰花茎尖培养实现了脱去病毒和快速繁殖方面已获成功，导致欧洲、 美洲和东南亚等许多国家兰花工业的兴起。（茎尖-原球茎-小植株） 1962年Murashige和Skoog发表了促进烟草组织快速生长的培养基组成，这就是目前我 们常用的MS培养基。 1964--1966年，印度的Guha和Maheshwari成功地在毛叶曼佗罗花药培养中由花粉诱 导得到了单倍体植株。
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过程
动物细胞培养应用
❖ 大规模培养生产生物制品（病毒疫苗、干 扰素、单克隆抗体）
❖ 作为基因工程中的受体细胞 ❖ 培养的动物细胞可以用于检测有毒物质，
判断某种物质的毒性 ❖ 为治疗和预防癌症及其他疾病提供理论依
据
植物胞具有全能性 这个理论，近几十年来发展起来的一项无性 繁殖的新技术。植物的组织培养广义又叫离 体培养，指从植物体分离出符合需要的组织。 器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作， 在人工控制条件下进行培养以获得再生的完 整植株或生产具有经济价值的其他产品的技 术。
应用
❖ 在农业领域中的应用 自六十年代后期起，植物组织培养技术得到 了迅猛的发展，在农业上的应用主要包括以 下几个方面： 植物种质资源的保存、植物种质资源的创新、 植物优良品种的快繁、 应用植物培养细胞生 产次生代谢物
细胞培养的主要优点
➢ 可提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象， 比较经济，方便
➢ 可消除其他外界因素的影响，对疫苗生产来说其 抗原性更接近于自然流行株
➢ 可减少宿主蛋白成分，减少变态反应
细胞培养的基本条件
❖ 接种细胞量 ❖ 培养液 ❖ 氢离子浓度及气体条件 ❖ 温度 ❖ 无菌条件和培养器皿的清洁
另外，在培养液中加入氢离子缓冲剂，如 HEPES可使培养液有较强的缓冲能力。
温度
细胞培养的最适温度与细胞来源的动物 体温一致，温度增加2—3℃对细胞产生不 良影响，低温对细胞影响较小
无菌条件
细胞培养技术的关键之一是防止 污染，在细胞培养中，可能发生 污染的来源有： ➢组织培养液 ➢器皿 ➢组织本身 ➢工作者本身 ➢空气
度
酸碱度
细胞生长最宜的PH范围是7.0—7.4。细胞可忍 受较大的范围PH变化（PH6.6—7.8）培养环境偏酸 较偏碱更宜于细胞贴壁。培养液中的缓冲体系主要 是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。其中碳酸氢盐/CO2 为主要的缓冲体系，如使用CO2孵箱，能提供稳定 的5%CO2，可自动调节细胞代谢引起的PH改变。
培养器皿的处理
常用的主要器皿：玻璃、塑料
玻璃器皿一般须用清洁液浸泡，清水洗10 次后再用蒸馏水洗2次，烤干备用
单细胞的制备
贴壁生长的传代细胞使之分散成单细胞的方 法有 酶消化法 螯和剂分散法
酶消化法
胰蛋白酶能消化细胞间的蛋白质成分， 组织块受它作用后细胞变为圆形，再用吸管 机械吹打或电动搅拌细胞可分散
概况
从机体中取出组织或细胞，模拟机体内的生理条件在体 外进行培养，使之生存和生长，称之为组织培养。组织培养 技术在流感病毒研究及监测等方面的应用已越来越引起人们 的重视。因近来发现，用组织培养细胞所分离到的流感病毒， 其抗原性和基因特性要比用鸡胚分离到的更接近原始采集的 标本，故世界卫生组织号召大家寻找合适的细胞来制备流感 病毒疫苗，来替代鸡胚制备疫苗。最近我国发现，“O”相流 感病毒株在人群中消失30余年后，又重新出现，同时还发现 用组织培养细胞来分离“O”相毒株要比鸡胚系统敏感的多。
培养条件
(1)、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素、定期更换培养液 ）
(2)、培养基 葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血 清等
动物细胞生长特性
细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，
称为细胞贴壁。 要求：
培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就 会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
胰蛋白酶用的浓度过大或时间过长对细 胞均有损伤，影响细胞的生长。因此，不同 组织来源、不同年龄的动物组织所用酶的浓 度和时间可以不同。 通常用0.25%-0.5%的酶。
组织培养的材料
1．生长成片的MDCK细胞 2．T-75细胞培养瓶, 颈口有倾角。 3．D-MEM培养液 4．青、链霉素母液(10,000 U/ml 青霉素 G；10,000 µg/ml
❖ （4）继代培养 ❖ 分化形成的芽、原球茎数量有限，采用适当的继代
培养基经多次切割转接。当芽苗繁殖到一定数量后， 再将一部分用于壮苗生根，另一部分保存或继续扩 繁。进行脱毒苗培养的需提前进行病毒检测。 ❖ （5）生根培养 ❖ 刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降 低细胞分裂素浓度或不加，提高生长素浓度，促进 小苗生根，提高其健壮度。 ❖ （6）炼苗移栽 ❖ 选择生长健壮的生根苗进行室外炼苗，待苗适应外 部环境后，再移栽到疏松透气的基质中，注意保温、 保湿、遮荫，防止病虫危害。当组培苗完全成活并 生长一定大小后，即可移向大田用于生产。
过程
1）准备阶段 查阅相关文献，根据已成功培养的相近植物资料，结合实际制 订出切实可行的培养方案。然后根据实验方案配制适当的化学 消毒剂以及不同培养阶段所需的培养基，并经高压灭菌或过滤 除菌后备用。 （2）外植体选择与消毒 选择合适的部位作为外植体，采回后经过适当的预处理，然后 进行消毒处理。将消毒后的外植体在无菌条件下切割成一定大 小的小块，或剥离出茎尖，挑出花药，接种到初代培养基上。 （3）初代培养 接种后的材料置于培养室或光照培养箱中培养，促使外植体中 已分化的细胞脱分化形成愈伤组织，或顶芽、腋芽直接萌发形 成芽。然后将愈伤组织转移到分化培养基分化成不同的器官原 基或形成胚状体，最后发育形成再生植株。
组织培养的步骤
❖ 准备细胞生长液 ❖ 清洗细胞 ❖ 消化细胞 ❖ 加入生长液，混匀，分装细胞瓶
分类
❖ 动物细胞组织培养 ❖ 植物细胞组织培养
动物细胞组织培养
动物细胞培养就是从动物机体内取出相关 的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适 宜的培养基中让这些细胞生长和增殖。
选材：动物胚胎或幼龄动物的组织、器官 ❖ 它们细胞增殖能力强，分裂旺盛， ❖ 分化程度低，容易培养。
硫酸链霉素) ，分装后保存于-20 ℃。 5．HEPES 缓冲液, 1 M 母液。 6．胎牛血清，40 nm滤过。 7．EDTA-胰酶 (0.05% 胰酶；0.53 mM EDTA . 4Na)，分
装后保存于-20 ℃ 8．牛血清白蛋白组分V, 7.5%溶液。 9．1ml 、10ml无菌移液管 10．70％～75％的酒精