--基因工程第七章酵母基因表达体系55P
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Ubc4-ubc5双突变型：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。
酵母菌的载体系统
载体的一般结构
选择标记
复制子
表达盒
启动子
先导序列
终止子
有用的蛋白结构域
1酵母菌中的野生型质粒 2酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌种的野生型质粒
酿酒酵母中的2μ环状质粒
几乎所有的酿酒酵母 都含有2μ双链环状质粒， 拷贝数维持50-100个。
多数酵母菌可以取得较高的转化率； 4. 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6. 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。
缺陷在于：
1. 表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工
修正。
酵母菌的基因工程
酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
• 第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异 源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速 被转移到分泌器中，即可有效避免降解作用;
• 第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的 启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表 达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白 因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失;
酵母菌的宿主系统 1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
酵母属
如酿酒酵母
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母
毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母
裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母
汉逊酵母属 如多态汉逊酵母
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究
最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因 最理想
提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌
使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变
突变 产生的异源蛋白
增加产量（倍数）
作用位点
SSC1
SSC2
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操
作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全
基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe
酵母基因表达体系
发展历程
1. 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿 酒酵母中存在质粒。
2. 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因 导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷， 标志着酵母表达系统的建立。
3. 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人 干扰素。
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖 基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心
和外侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有完 突变类型
整的糖基化系统，但野
生物效应
生型酿酒酵母对异源蛋
白的糖基化反应很难控 mnn 甘露糖生物合成缺陷型
制，呈超糖基化倾向， alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷
rgrl osel NDS
ss1l
rho
凝乳酶原
牛生长因子
3-10
凝乳酶原
牛生长因子
鼠α—淀粉酶
5-10
β—内啡肽
7-12
人血清蛋白
溶酶原活化剂抑制因子2型 10
α1 —抗胰蛋白酶P
人溶菌酶
10
人溶菌酶
10
人表皮因子
NDE
Ca2+-ATPase 转录后 转录后
转录后 转录后
转录
羧肽酶Y 转录
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
Irs反向重复序列600bp， 重组FLP编码产物驱动Irs 的同源重组REP编码产物 控制质粒的稳定性STB REP的结合位点
GRAS） 酵母菌是最简单的真核模式生物
酵母基因组特征
与真核生物的基因组相比，啤酒酵母的基 因组很小，仅有16条染色体，含1.4X107 bp, 编码约5000个蛋白质，是目前已知真核生 物中基因组最小的一个。酵母细胞既可以 作为单倍体存在，也可以作为二倍体存在。 这就克服了在其它真核生物中隐性基因控 制的形状难以检测的缺陷。
• 第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变 株作为外源基因表达的受体细胞;
• 在酿酒酵母中，泛蛋白因子的主要来源是多聚泛 蛋白基因UBI4的表达，UBI4突变株能正常生长， 但其细胞内游离的泛蛋白因子浓度比野生型菌株 低得多，因此这种缺陷株是一个理想的外源基因 表达受体。
• 编码泛蛋白激活酶E1的基因也可作为突变的靶基 因，含有该基因突变的哺乳动物细胞内几乎检测 不出泛蛋白-外源蛋白的共价结合物。酿酒酵母编 码E1蛋白的基因UBA1是一种看家基因，UBA1突 变株是致死性的，但编码UBA1蛋白等位突变株却 可减少泛蛋白因子依赖型异源蛋白的降解作用。 此外，上述6个UBC基因的突变也是构建重组异源 蛋白稳定表达宿主系统的选择方案，
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变 株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要 低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受 体。
UBA1缺陷型：
UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但 其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导 的蛋白降解。
4. 我国也在1983年ຫໍສະໝຸດ Baidu次用酵母菌表达了乙型肝炎 病毒表面抗原基因。
5. 1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了 第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。
酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于：
1. 安全无毒，不致病； 2. 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3. 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，
因此超糖基化缺陷菌株 och 外侧糖链添加缺陷型
非常重要。
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
LLyyss
靶蛋白
Lys
靶蛋白
Lys
Ubiquitin 76 aa Ubiquitin ligase E3
Ubiquitin ligase E3
蛋白酶体
• 如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依 赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种 降解作用减少到最低程度：
七个泛素连接酶基因的突变对衰减蛋白降解作用同样有效。
酵母菌的载体系统
载体的一般结构
选择标记
复制子
表达盒
启动子
先导序列
终止子
有用的蛋白结构域
1酵母菌中的野生型质粒 2酵母菌克隆表达质粒的构建
酵母菌种的野生型质粒
酿酒酵母中的2μ环状质粒
几乎所有的酿酒酵母 都含有2μ双链环状质粒， 拷贝数维持50-100个。
多数酵母菌可以取得较高的转化率； 4. 培养条件简单，容易进行高密度发酵； 5. 能将外源基因表达产物分泌到培养基中； 6. 有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰功能。
缺陷在于：
1. 表达效率相对低 2. 酵母常有密码子偏性，真核基因在其中表达时需要人工
修正。
酵母菌的基因工程
酵母菌作为基因工程受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
• 第一种方法是以分泌的形式表达重组异源蛋白，异 源蛋白在与泛蛋白因子形成共价结合物之前，迅速 被转移到分泌器中，即可有效避免降解作用;
• 第二种方法是将外源基因的表达置于一个可诱导的 启动子控制之下，由于异源蛋白质在短期内集中表 达，分子数占绝对优势的表达产物便能逃脱泛蛋白 因子的束缚，从而减少由降解效应带来的损失;
酵母菌的宿主系统 1. 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 2. 提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌 3. 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 4. 减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌
目前已广泛用于外源基因表达的研究的酵母菌包括：
酵母属
如酿酒酵母
克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母
毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母
裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母
汉逊酵母属 如多态汉逊酵母
其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究
最详尽，但巴斯德毕赤酵母表达外源基因 最理想
提高重组异源蛋白产率的诱变宿主菌
使啤酒酵母中异源蛋白产量提高和质量改善的突变
突变 产生的异源蛋白
增加产量（倍数）
作用位点
SSC1
SSC2
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操
作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉
能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全
基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe
酵母基因表达体系
发展历程
1. 1974年rlarck—walker和Miklos发现在大多数酿 酒酵母中存在质粒。
2. 1978年Hmnen将来自一株酿酒酵母的leu 2基因 导入另一株酿酒酵母，弥补了后者的Leu2缺陷， 标志着酵母表达系统的建立。
3. 1981年Hinnen等用酵母基因表达系统表达了人 干扰素。
许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖 基团，常常影响蛋白质的生物活性。整个糖单位由糖基核心
和外侧糖链两部分组成。
酵母菌普遍拥有完 突变类型
整的糖基化系统，但野
生物效应
生型酿酒酵母对异源蛋
白的糖基化反应很难控 mnn 甘露糖生物合成缺陷型
制，呈超糖基化倾向， alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷
rgrl osel NDS
ss1l
rho
凝乳酶原
牛生长因子
3-10
凝乳酶原
牛生长因子
鼠α—淀粉酶
5-10
β—内啡肽
7-12
人血清蛋白
溶酶原活化剂抑制因子2型 10
α1 —抗胰蛋白酶P
人溶菌酶
10
人溶菌酶
10
人表皮因子
NDE
Ca2+-ATPase 转录后 转录后
转录后 转录后
转录
羧肽酶Y 转录
抑制超糖基化作用的突变宿主菌
Irs反向重复序列600bp， 重组FLP编码产物驱动Irs 的同源重组REP编码产物 控制质粒的稳定性STB REP的结合位点
GRAS） 酵母菌是最简单的真核模式生物
酵母基因组特征
与真核生物的基因组相比，啤酒酵母的基 因组很小，仅有16条染色体，含1.4X107 bp, 编码约5000个蛋白质，是目前已知真核生 物中基因组最小的一个。酵母细胞既可以 作为单倍体存在，也可以作为二倍体存在。 这就克服了在其它真核生物中隐性基因控 制的形状难以检测的缺陷。
• 第三种方法是使用泛蛋白因子生物合成缺陷的突变 株作为外源基因表达的受体细胞;
• 在酿酒酵母中，泛蛋白因子的主要来源是多聚泛 蛋白基因UBI4的表达，UBI4突变株能正常生长， 但其细胞内游离的泛蛋白因子浓度比野生型菌株 低得多，因此这种缺陷株是一个理想的外源基因 表达受体。
• 编码泛蛋白激活酶E1的基因也可作为突变的靶基 因，含有该基因突变的哺乳动物细胞内几乎检测 不出泛蛋白-外源蛋白的共价结合物。酿酒酵母编 码E1蛋白的基因UBA1是一种看家基因，UBA1突 变株是致死性的，但编码UBA1蛋白等位突变株却 可减少泛蛋白因子依赖型异源蛋白的降解作用。 此外，上述6个UBC基因的突变也是构建重组异源 蛋白稳定表达宿主系统的选择方案，
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 泛素降解途径衰减的酿酒酵母
UBI4缺陷型：
在酿酒酵母菌中，泛素主要由UBI4基因表达，UBI4-突变 株正常生长，但细胞内游离泛素分子的浓度比野生株要 低的多，因此UBI4缺陷突变株是外源基因表达理想的受 体。
UBA1缺陷型：
UBA1编码泛素激活酶E1，UBA1突变株式致死性的，但 其等位基因缺陷是非致死性的，而且也能削弱泛素介导 的蛋白降解。
4. 我国也在1983年ຫໍສະໝຸດ Baidu次用酵母菌表达了乙型肝炎 病毒表面抗原基因。
5. 1996年在全世界科学家的通力合作下，完成了 第一个真核生物——酿酒酵母全基因组的测序。
酵母菌是外源基因最成功的真核生物表达系统 优势在于：
1. 安全无毒，不致病； 2. 有较清楚的遗传背景，容易进行遗传操作； 3. 容易进行载体DNA的导入。DNA转化技术的不断发展优化，
因此超糖基化缺陷菌株 och 外侧糖链添加缺陷型
非常重要。
减少泛蛋白因子依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌
泛素介导的蛋白质降解作用
靶蛋白
LLyyss
靶蛋白
Lys
靶蛋白
Lys
Ubiquitin 76 aa Ubiquitin ligase E3
Ubiquitin ligase E3
蛋白酶体
• 如果外源基因表达产物在酵母菌中具有对泛蛋白依 赖型降解作用的敏感性，则可通过下列方法使这种 降解作用减少到最低程度：