发酵工程课程设计正文

1概述

1.1苹果酸简介

苹果酸（Malic acid），由于分子中有一个不对称碳原子，有两种立体异构体。大自然中，以三种形式存在，即D－苹果酸、L－苹果酸和其混合物DL－苹果酸。苹果酸是一种较强的有机酸，又名羟基丁二酸，是一种白色或荧白色粉状、粒状或结晶状固体。晶体中不含结晶水，DL-型熔点129℃，L-型熔点100℃，加热到180℃可以失水分解成富马酸或马来酸。在通常条件下，苹果酸是稳定的，但其纯晶体稍有吸湿性，在高湿度条件下可能液化。在相对湿度98％，25℃下放置6天，约增重50.4％. 苹果酸在催化剂存在下与醇可发生酯化反应。以三氟化硼为催化剂与醇回流可形成单酯。与多元醇、芳香多元羧酸作用，可形成树脂类产品，如醇酸聚酯树脂。在氧化银存在下，苹果酸酯与卤代烷反应可以产生醚类，如乙氧基琥珀酸。在醇溶液中，苹果酸酯与氨作用，可以生成苹果酸酰胺。

苹果酸在日常生活中有着重要的作用。在食品应用行业，被生物界和营养界誉为“最理想的食品酸味剂”，目前在老年及儿童食品中正取代柠檬酸。除此之外，苹果酸可作为保鲜剂、除腥脱臭剂、面试强化剂等。在医药行业，L－苹果可以用于治疗肝病、贫血、免疫力低下、尿毒症、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用。苹果酸主要用于食品和医药行业。

1.2苹果酸发酵机理

L-苹果酸在生物体中普遍存在，它作为三羧酸循环的一员而参与细胞代谢。在一般生物中它只参与循环而不会大量积累，否则会造成代谢流的阻塞。要想积累苹果酸，必须要有补充4碳酸的途径。理论上讲，补充4碳酸的途径有两条：乙醛酸循环和丙酮酸羧化支路。

三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle acid cycle ，TCA cycle,TCA循环）是一个由一系列酶促反应构成的循环反应系统，在该反应过程中，首先由乙酰辅酶A与草酰乙酸缩合生成含有3个羧基的柠檬酸，经过4次脱氢，2次脱羧，生成四分子还原当量和2，重新生成草酰乙酸的这一循环反应过程成为三羧酸循环。

分子CO

2

乙醛酸循环（glyoxylate cycle）是在异柠檬酸裂解酶的催化下，异柠檬酸被直接分解为乙醛酸，乙醛酸又在乙酰辅酶A参与下，由苹果酸合成酶催化生成苹果酸，苹果酸再氧化脱氢生成草酰乙酸的过程。［1］

三羧酸循环图 乙醛酸循环图

1.3苹果酸发酵工艺

L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。一步发酵又称为直接发酵，它用糖类为原料，用霉菌直接发酵产生苹果酸。两步发酵法也是用糖类为原料，先由根霉发酵成富马酸（或富马酸-苹果酸混合物），再由酵母或细菌转化成苹果酸。酶法转化是用富马酸（盐）或马来酸为原料，用微生物酶（包括全细胞）转化成苹果酸。发酵方法利用了微生物酶的立体异构专一性，生产的都是L-苹果酸，是生物体内所存在和可以利用的构型。

2发酵工艺

发酵工程是指利用微生物的生长繁殖和代谢活动来大量生产人们所需产品的过程的理论和工程技术体系。发酵工程也称作微生物工程，该工程技术体系主要包括：微生物菌种选育和保藏；培养基和发酵设备的灭菌技术；空气净化除菌技术；菌种的扩大培养；微生物代谢产物的发酵生产和产品分离纯化技术；发酵过程中的补料技术；发酵过程的参数检测、分析与控制技术。［2］

发酵工艺（需氧）流程图［3］

2.1菌种选育

菌种选育包括自然育种和诱变育种。自然育种（natural screening ）是利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理，通过分离、筛选排除衰退型菌株，从中选出维持或高于原有生产菌种的过程，已达到稳定和提高生产能力的目的。诱变育种（

mutation screening ）是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群体，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便高效的筛选方法，从中选出少数具有优良性状的菌种。［2］

一般菌种分离纯化和筛选的步骤如下：

优良菌种的选择是发酵法生产苹果酸的技术关键，产品收率及分离纯化都与菌种密切相关。能产生苹果酸的微生物的种类很多，有黄曲霉、米曲霉、寄生曲霉、华根霉、无根根霉、温特曲霉、膜瞨毕赤酵母、短乳杆菌、产氨短杆菌等。

2.1.1苹果酸菌种选育

L-苹果酸的发酵工艺大体可以分为三类：一步发酵法、两步发酵法和酶法转化。以糖蜜为原料的一步发酵法关键在于筛选到高效菌种，而两步法由于涉及到两种微生物，培养条件要求比较严格，发酵周期较长，产酸率相对较低，副产物较多。近年来，一种

以苹果酸为底物利用微生物菌体的富马酸合成L-苹果酸的技术，以其产酸水平高、发酵周期短、能耗少、操作程序简单等优势引起国内外研发人员的青睐。［4-7］试验证明, 用富马酸为原料经微生物发酵生产L-苹果酸的转化率已高达98%以上，因此用富马酸为原料生产L-苹果酸的技术得到广泛采用。国内近期研究以及工业化生产多以富马酸法为主。经研究发现温特曲霉所需培养温度为20-30摄氏度，PH<7.8,培养方便，操作简单等优点。因此选用温特曲霉为生产基本菌种。经过诱变处理可得到优良菌种温特曲霉F-891，该菌种能有效抑制杂菌的生长，提高产率。

2.1.1.1出发菌种选择

以上海志研生物科技有限公司提供的温特曲霉为诱变出发菌株。

2.1.1.2诱变育种

（1）单孢子悬液的制备

取新鲜的斜面试管，用生理盐水制成孢子悬浮液，将孢子液移至无菌三角瓶中，并加灭菌玻璃珠振荡l2～16min后用滤纸除去成团菌丝，配成浓度为2×106个／ml的孢子液。

（2） 60Co照射诱变处理

用无菌吸管吸取孢子悬液，放到直径9cm的无菌培养皿中，同时放人无菌搅拌铁芯，悬液层厚度约为2mm。将培养皿放在电磁搅拌器台面上，启动电磁搅拌器，打开培养皿盖，让孢子悬液在60Co下均匀照射，当照射达到要求时间后，立即盖上皿盖，取出并用黑布罩好。吸取孢子悬液15mL置入一支无菌试管中，于恒温水浴中处理，处理完毕后，立即取出，冷却后，将诱变后的孢子悬液涂布于选择培养基上。30℃恒温培养，挑取单菌落，然后进行单菌落摇瓶筛选。

（3）摇瓶初筛

将孢子涂布于初筛培养基上，倒置在30℃的培养箱中，培养22-26h，挑选生长状况良好的单菌落，进行斜面培养。

（4）摇瓶复筛

在250mL三角瓶中装人种子培养基25mL，在斜面培养基上取二环孢子，接入灭菌后的液体培养基中，置于30℃的旋转式摇床机上280r/min振荡培养5～6d，挑选产率高的菌株。

（5）高产菌株

高产突变菌株温特曲霉F-891能有效抑制发酵过程中琥铂酸等杂酸的生成，缩短种子培养时间。但温特曲霉耐酸碱性能及耐高温性能并未因经60Co诱变而得到提高，因此发