完整版细胞生物学第三章细胞生物学研究方法
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表一、几种介质的折射率
பைடு நூலகம்
介质
空气
水
折射率 1
1.33
香柏油 α 溴萘 1.515 1.66
? 显微镜的几个光学特点：
? 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的 折射率越接近玻璃 的越好。
? sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为 0.05~0.95；油镜 头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 ? 分辨极限(limit resolution)
第三章 细胞生物学研究方法
本章内容提要
? 第一节 显微技术 ? 一、光学显微镜 ? 二、电子显微镜 ? 三、显微操作技术 ? 第二节 生物化学与分子生物学技术 ? 第三节 细胞分离技术 ? 第四节 细胞培养与细胞杂交
第一节 显微技术
? 光学显微镜： - 以可见光（或紫 外线）为光源。 ? 电子显微镜： - 以电子束为光源。
laser confocal scanning microscope, LCSM
Confocal microscopy is primarily monochromatic, but by using two detection wavelengths we can image two fluorochromes in appropriate colours.
Indo-1 used to demonstrate calcium signalling in motile fish keratocytes
Eye of Drosophila 果蝇
red: Microtubules, Cy3 blue: DNA, DAPI
Courtesy of Dr. R. Hartig, MaxPlanckInstitute, Ladenburg, Germany
?
3. 分辨力：指分
辨物体最小间隔的能力。
? R=0.61λ/N．A．
- 其中λ为入射光线波 长；
- N．A．为镜口率(数 值孔径) ＝ｎsinα/2，
- n=介质折射率；α=镜 口角（样品对物镜镜口
的张角） 。
? 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ -角孔径越大，进入物镜的光越多；介质的折射率越大，则数值孔径越大，这 些都可以使分辨率提高
场曲：垂 于主轴的平面物体经光学系统所成的清晰 影像，若不在一垂直于主轴的像平面内，而在 以主 轴为对称的弯曲表面上，即最佳像面为一曲面，则 此光学系统的成像误差称为场曲。
畸变：被摄 物平面内的 主轴外直线， 经光学系统 成像后变为 曲线，则此 光学系统的 成像误差称 为畸变。
色差：由白色物点 向光学系统发出一 束白光，经该光学 系列折射后，组成 该束白光的红、橙、 黄、绿、青、蓝、 紫等各色光，不能 会聚于同一点，即 白色物点不能结成 白色像点，而结成 一彩色像斑的成像 误差，称为色差。
透射电镜
—、光学显微镜 （一）普通光学显微镜
?1. 构成： ? ①照明系统 ? ②光学放大系统 ? ③机械装置 ?2. 原理：经物镜形成倒 立实像，经目镜进一步 放大成像。
透镜的像差 ?球面像差 ?慧形像差 ?像散 ?像场弯曲 ?畸变 ?色差
球差：由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系 列折射后，若原光束不同孔径角的各光线，不能交于 主轴上的同一位置， 以至在主轴上的理想像平面处，形成一弥散 光斑（俗称模糊圈），则此光 学系统的成像误差称为球差。
? 放大率(magnification)
- 总放大率 = 物镜放大率×目镜放大率
- 普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm， 人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。
（二）荧光显微镜
? 工作原理：
-利用紫外线发生装置
(如汞)发出强烈的紫 外线光源，通过显微 固定的切片或活染的
1 紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与 UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6K460。
2 紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤长的荧光（绿到红 ），能与BG-12组合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
3 紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的荧光（蓝到 红），可与BG-3组合，常用OG-11K470AK 490，
K510。
用于观察能 激发出荧光 的结构。用 途：免疫荧 光观察、基 因定位、疾 病诊断。
（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM
? 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 ? 能显示细胞样品的立体结构。 ? 分辨力是普通光学显微镜的 3倍。 ? 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成 立体图像。
细胞。
-?
特点：
光源为紫外线，波长
较短，显微镜有两个
特殊的滤光片；照明
方式通常为落射式。
激发滤板
? 紫外光激发滤板：此滤板可使 400nm以下的紫外光 透过，阻挡 400nm以上的可见光通过。常用型号为 UG1或UG-5，外加一块 BG-38，以除去红色尾波。
? 紫外蓝光激发滤板：此滤板可使 300～450nm范围内 的光通过。常用型号为 ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
? 紫蓝光激发滤板：它可使 350～490nm的光通过。常 用型号为 QB24（BG12 ）。
? 最大吸收峰在 500nm以上者的荧光素（如罗达明色素 ）可用蓝绿滤板（如 B-7）激发。
压制滤板（阻断滤板）
? 压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范 围的荧光。与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板：
慧差：由位于主 轴外的某一轴外 物点，向光学系 统发出的单色圆 锥形光束，经该 光学系列折射后， 若在理想像平面 处不能结成清晰 点，而是结成拖 着明亮尾巴的慧 星形光斑，则此 光学系统的成像 误差称为慧差。
像散：由位于主 轴外的某一轴外 物点，向光学系 统发出的斜射单 色圆锥形光束， 经该光学系列折 射后，不能结成 一个清晰像点， 而只能结成一弥 散光斑，则此光 学系统的成像误 差称为像散。
表一、几种介质的折射率
பைடு நூலகம்
介质
空气
水
折射率 1
1.33
香柏油 α 溴萘 1.515 1.66
? 显微镜的几个光学特点：
? 制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的 折射率越接近玻璃 的越好。
? sin α /2的最大值必然小于1；介质为空气，镜口率一般为 0.05~0.95；油镜 头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。 ? 分辨极限(limit resolution)
第三章 细胞生物学研究方法
本章内容提要
? 第一节 显微技术 ? 一、光学显微镜 ? 二、电子显微镜 ? 三、显微操作技术 ? 第二节 生物化学与分子生物学技术 ? 第三节 细胞分离技术 ? 第四节 细胞培养与细胞杂交
第一节 显微技术
? 光学显微镜： - 以可见光（或紫 外线）为光源。 ? 电子显微镜： - 以电子束为光源。
laser confocal scanning microscope, LCSM
Confocal microscopy is primarily monochromatic, but by using two detection wavelengths we can image two fluorochromes in appropriate colours.
Indo-1 used to demonstrate calcium signalling in motile fish keratocytes
Eye of Drosophila 果蝇
red: Microtubules, Cy3 blue: DNA, DAPI
Courtesy of Dr. R. Hartig, MaxPlanckInstitute, Ladenburg, Germany
?
3. 分辨力：指分
辨物体最小间隔的能力。
? R=0.61λ/N．A．
- 其中λ为入射光线波 长；
- N．A．为镜口率(数 值孔径) ＝ｎsinα/2，
- n=介质折射率；α=镜 口角（样品对物镜镜口
的张角） 。
? 思考：如何提高显微镜的分辨能力？ -角孔径越大，进入物镜的光越多；介质的折射率越大，则数值孔径越大，这 些都可以使分辨率提高
场曲：垂 于主轴的平面物体经光学系统所成的清晰 影像，若不在一垂直于主轴的像平面内，而在 以主 轴为对称的弯曲表面上，即最佳像面为一曲面，则 此光学系统的成像误差称为场曲。
畸变：被摄 物平面内的 主轴外直线， 经光学系统 成像后变为 曲线，则此 光学系统的 成像误差称 为畸变。
色差：由白色物点 向光学系统发出一 束白光，经该光学 系列折射后，组成 该束白光的红、橙、 黄、绿、青、蓝、 紫等各色光，不能 会聚于同一点，即 白色物点不能结成 白色像点，而结成 一彩色像斑的成像 误差，称为色差。
透射电镜
—、光学显微镜 （一）普通光学显微镜
?1. 构成： ? ①照明系统 ? ②光学放大系统 ? ③机械装置 ?2. 原理：经物镜形成倒 立实像，经目镜进一步 放大成像。
透镜的像差 ?球面像差 ?慧形像差 ?像散 ?像场弯曲 ?畸变 ?色差
球差：由主轴上某一物点向光学系统发出的单色圆锥形光束，经该光学系 列折射后，若原光束不同孔径角的各光线，不能交于 主轴上的同一位置， 以至在主轴上的理想像平面处，形成一弥散 光斑（俗称模糊圈），则此光 学系统的成像误差称为球差。
? 放大率(magnification)
- 总放大率 = 物镜放大率×目镜放大率
- 普通光线的波长为400~700nm，分辨力数值不会小于0.2μm， 人眼的分辨力为0.2mm,因此显微镜的最大设计倍数为1000X。
（二）荧光显微镜
? 工作原理：
-利用紫外线发生装置
(如汞)发出强烈的紫 外线光源，通过显微 固定的切片或活染的
1 紫外光压制滤板：可通过可见光、阻挡紫外光通过。能与 UG-1或UG-5组合。常用GG-3K430或GG-6K460。
2 紫蓝光压制滤板：能通过510nm以上滤长的荧光（绿到红 ），能与BG-12组合。通常用OG-4K510或OG-1K530。
3 紫外紫光压制滤板：能通过460nm以上波长的荧光（蓝到 红），可与BG-3组合，常用OG-11K470AK 490，
K510。
用于观察能 激发出荧光 的结构。用 途：免疫荧 光观察、基 因定位、疾 病诊断。
（三）激光共聚焦扫描显微境 Laser confocal scanning microscope, LCSM
? 用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。 ? 能显示细胞样品的立体结构。 ? 分辨力是普通光学显微镜的 3倍。 ? 用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成 立体图像。
细胞。
-?
特点：
光源为紫外线，波长
较短，显微镜有两个
特殊的滤光片；照明
方式通常为落射式。
激发滤板
? 紫外光激发滤板：此滤板可使 400nm以下的紫外光 透过，阻挡 400nm以上的可见光通过。常用型号为 UG1或UG-5，外加一块 BG-38，以除去红色尾波。
? 紫外蓝光激发滤板：此滤板可使 300～450nm范围内 的光通过。常用型号为 ZB-2或ZB-3，外加BG-38。
? 紫蓝光激发滤板：它可使 350～490nm的光通过。常 用型号为 QB24（BG12 ）。
? 最大吸收峰在 500nm以上者的荧光素（如罗达明色素 ）可用蓝绿滤板（如 B-7）激发。
压制滤板（阻断滤板）
? 压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应滤长范 围的荧光。与激发滤板相对应，常用以下3种压制滤板：
慧差：由位于主 轴外的某一轴外 物点，向光学系 统发出的单色圆 锥形光束，经该 光学系列折射后， 若在理想像平面 处不能结成清晰 点，而是结成拖 着明亮尾巴的慧 星形光斑，则此 光学系统的成像 误差称为慧差。
像散：由位于主 轴外的某一轴外 物点，向光学系 统发出的斜射单 色圆锥形光束， 经该光学系列折 射后，不能结成 一个清晰像点， 而只能结成一弥 散光斑，则此光 学系统的成像误 差称为像散。