【CN109880840A】一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统【专利】

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一种在大肠杆菌中生产可溶性重组蛋白质的方法及其应用[发明专利]

专利名称：一种在大肠杆菌中生产可溶性重组蛋白质的方法及其应用
专利类型：发明专利
发明人：华子春,徐寒梅,孙启明
申请号：CN200410065733.X
申请日：20041116
公开号：CN1614025A
公开日：
20050511
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于基因工程技术领域。

一种在大肠杆菌中将目标蛋白质表达菌株在低温下和分子伴侣一起共表达，从而非常有效地防止目标蛋白质包涵体的形成，大量增加可溶性产物的产量的方法。

利用该技术方法能够显著增加提高可溶性重组人内皮抑素和重组人血管抑素的产量。

本发明建立了一种适用、简便、廉价地在大肠杆菌中生产可溶性的、有生物活性的重组蛋白质的工艺和方法，具有高效、价廉、适用面广、推广性强的特点，适用于生物工程制药业及基因工程、生物化学、分子生物学等研究。

申请人：南京大学
地址：210093 江苏省南京市汉口路22号
国籍：CN
代理机构：南京知识律师事务所
代理人：张苏沛
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一种谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的构建及应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810338976.8(22)申请日 2018.04.16(71)申请人中国科学院微生物研究所地址 100101 北京市朝阳区北辰西路1号院3号申请人中国科学院大学(72)发明人董志扬　陈欣　何永志　张山　张岩峰　(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245代理人关畅　白艳(51)Int.Cl.C12N 15/77(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12P 21/02(2006.01)C12R 1/15(2006.01) (54)发明名称一种谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的构建及应用(57)摘要本发明公开了一种谷氨酸棒杆菌重组蛋白高效表达系统的构建及应用。

本发明提供的谷氨酸棒杆菌表达系统包括一种表达载体和宿主菌：其中表达载体依次包括谷氨酸棒杆菌组成型启动子PglyA、半乳糖苷酶LacZ、乳糖通透酶LacY、T7RNA聚合酶启动子PT7；表达宿主菌含有来源于大肠杆菌Bl21(DE3)的T7RNA聚合酶。

本发明的实验证明，本发明的乳糖诱导表达系统可以使谷氨酸棒杆菌利用乳糖作为诱导剂高效表达外源基因，避免了传统表达系统只能利用IPTG作为诱导剂的局限，在以糖质为原料的大规模发酵生产中具有良好的应用前景。

权利要求书2页说明书8页序列表6页附图1页CN 110387381 A 2019.10.29C N 110387381A1.一种利用乳糖诱导的谷氨酸棒杆菌表达目的蛋白试剂盒，包括谷氨酸棒杆菌、乳糖诱导系统和驱动目的蛋白编码基因表达的T7表达系统；所述T7表达系统包括T7RNA聚合酶基因、目的蛋白的编码基因和驱动所述目的蛋白编码基因表达的T7启动子；所述乳糖诱导系统包括LacY基因和LacZ基因及驱动LacY基因和LacZ基因表达的启动子。

一种重组蛋白及其应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201610608265.9(22)申请日 2016.07.29(71)申请人华中科技大学地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路1037号(72)发明人王擎　姚雨峰　吕丘仑　(74)专利代理机构华中科技大学专利中心42201代理人胡星驰(51)Int.Cl.C07K 14/47(2006.01)C12N 15/12(2006.01)A61K 38/17(2006.01)A61P 9/00(2006.01)A61P 9/10(2006.01)A61P 7/10(2006.01) (54)发明名称一种重组蛋白及其应用(57)摘要本发明公开了一种重组蛋白AGGF1。

所述重组AGGF1蛋白能通过促进急性心肌梗死小鼠心脏中的血管生成，改善小鼠心功能，抑制心肌细胞凋亡和心脏纤维化。

因此，所述重组AGGF1蛋白能制备促血管生成药物，用于缺血性疾病的治疗。

同时所述重组AGGF1蛋白能通过抑制心脏缺血再灌注手术后，心肌内血管的渗漏及水肿，改善小鼠心功能，抑制心脏纤维化。

因此，本发明提供的重组AGGF1蛋白能制备抑制血管渗漏药物，用于心脏缺血再灌导致血管渗漏，水肿及功能紊乱的治疗。

权利要求书1页说明书5页序列表3页附图6页CN 106243212 A 2016.12.21C N 106243212A1.一种重组蛋白，其特征在于，编码所述重组蛋白的核酸序列为：(1)由SEQ ID No.1所示的核酸序列编码的蛋白质；或(2)与序列SEQ ID No.1限定的核酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的核酸序列；或(3)SEQ ID No.1所示的核酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸密码子具有同等活性的由(1)衍生的序列。

2.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，编码所述重组蛋白的核酸序列为：由SEQ ID No.1所示的核酸序列编码的蛋白质。

在大肠杆菌中表达作为分泌的重组人干扰素α1b蛋白[发明专利]

[19]中华人民共和国专利局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1186120A [43]公开日1998年7月1日[21]申请号96114246.4[22]申请日96.12.24[71]申请人深圳科兴生物制品有限公司地址518057广东省深圳市南山区科技工业园谭启堂[72]发明人黄允强 [51]Int.CI 6C12N 15/72C12N 1/21C12N 15/21C12P 21/00C07K 14/56// ( C12N15/72,C12R1∶19)权利要求书 1 页说明书 17 页附图 10 页[54]发明名称在大肠杆菌中表达作为分泌的重组人干扰素α1b蛋白[57]摘要一种采用基因表达的lacUV5启动子和OmpA信号肽分泌重组蛋白质编码顺序分泌型载体已经有效的在大肠杆菌中表达了Cellulomomas fimi细胞外葡萄糖酶并分泌到细胞外。

因其很好的特性,已经将分泌载体用于生产干扰素α 1b蛋白质和具有免疫学和生物学活性的干扰素α 1b蛋白质变异体和片段。

本发明描述了重组DNA构建体lacUV5par8INF及其衍生物的构建方法,并描述了应用前述分泌载体和其变异体在转基因生物体和原核细胞、特别是在大肠杆菌菌株和/或其培养基中生产干扰素α 1b和其变异体蛋白质的方法。

96114246.4权利要求书第1/1页 1.重组DNA构建体pINF，lacUV5par8INF，及其衍生物，所述重组DNA构建体pINF的保藏号是CCTCC M960242.权利要求1所述的重组DNA构建体lacUV5par8INF的构建方法，该方法是通过将编码干扰素α1b蛋白质的基因序列亚克隆到lacUV5par8cex分泌型载体中而构建，所述重组DNA构建体能够表达干扰素α1b活性蛋白质并分泌到细胞外。

3.权利要求1中重组DNA构建体lacUV5par8INF的衍生物的构建方法，该方法是通过将干扰素α1b基因的突变体或片段亚克隆到lacUV5par8cex分泌型载体中而形成，其能够表达干扰素α1b活性蛋白质的变异体并分泌到细胞外。

一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用[发明专利]

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610116652.0(22)申请日 2016.03.02C12N 1/21(2006.01)C12P 7/42(2006.01)C12R 1/19(2006.01)(71)申请人浙江工业大学地址310014 浙江省杭州市下城区潮王路18号(72)发明人牛坤郑裕国熊涛秦海彬黄建峰柳志强(74)专利代理机构杭州天正专利事务所有限公司 33201代理人黄美娟李世玉(54)发明名称一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用(57)摘要本发明公开了一种重组大肠杆菌及合成3-羟基丙酸中的应用，所述重组大肠杆菌是将甘油脱水酶基因dhaB123、甘油脱水酶再激活因子基因gdrA、α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体编码基因TUkgsadh 和甘油三磷酸脱氢酶编码基因gpd1导入宿主菌中构建而成；通过利用基因敲除技术降低副产物1,3-丙二醇产量的同时再生醛脱氢酶的辅因子NAD +，从而提高3-羟基丙酸的产量，提高15倍。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页说明书9页序列表4页附图14页CN 105567622 A 2016.05.11C N 105567622A1.一种重组大肠杆菌，其特征在于所述重组大肠杆菌是将甘油脱水酶基因dhaB123、甘油脱水酶再激活因子基因gdrA、α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体编码基因TUkgsadh和甘油三磷酸脱氢酶编码基因gpd1导入宿主菌中构建而成；所述宿主菌为敲除乙醛还原酶/醇脱氢酶基因yqhD的大肠杆菌，所述α-酮戊二酸半醛脱氢酶突变体是将α-酮戊二酸半醛脱氢酶的120位谷氨酸突变为天冬氨酸，219位脯氨酸突变为丙氨酸获得的。

2.如权利要求1所述重组大肠杆菌，其特征在于所述甘油脱水酶基因dhaB123和甘油脱水酶再激活因子基因gdrA通过重组载体pACYCDuet-tac-dhaB123-gdrA导入宿主菌中。

重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810709802.8(22)申请日 2018.07.02(71)申请人通用生物系统（安徽）有限公司地址 239000 安徽省滁州市经济技术开发区永阳路6号(72)发明人雍金贵　杜攀　李森　(74)专利代理机构北京轻创知识产权代理有限公司 11212代理人沈尚林(51)Int.Cl.C12N 15/70(2006.01)C12N 9/50(2006.01)(54)发明名称重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法(57)摘要本发明公开了重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，包括以下步骤：S1、PET-28a-TEV蛋白酶表达质粒的构建；S2、TEV蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、TEV蛋白酶的纯化与鉴定。

本发明应用大肠杆菌表达系统，通过设计表达载体，实现重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中表达，再经过亲和层析、Superdex 75凝胶过滤层析等方法对目标蛋白酶进行提纯，大幅缩短了目标蛋白酶的纯化流程与纯化时间，同时提高了蛋白酶的纯度、得率和酶活，节省实验步骤并减少成本。

本发明方法，为研发及生产其他蛋白类工具酶奠定了基础。

权利要求书2页说明书4页CN 108774635 A 2018.11.09C N 108774635A1.重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、PET-28a-TEV蛋白酶表达质粒的构建；S2、TEV蛋白酶的诱导表达与鉴定；S3、TEV蛋白酶的纯化与鉴定。

2.根据权利要求1所述的重组TEV蛋白酶在大肠杆菌中的生产方法，其特征在于，所述的步骤S1，具体分如下步骤：a、根据密码子优化后的基因序列，TEV蛋白酶直接进行基因合成；b、将PET-28a载体质粒通过酶切进行线性化，线性化产物与基因合成产物进行无缝构建，形成重组产物；c、取20ul重组产物转移到TOP10感受态细胞中，冰上静置30min，然后42℃热激90s，再冰上静置2min，再加入600ul LB液体培养基，37℃、200rpm条件下摇床培养45min，涂布于含50ug/mL卡那霉素的LB平板中，最后放入37℃培养箱培养过夜；d、使用灭菌牙签从LB平板上随机挑取四个菌落，接入4ml含卡那霉素抗性的LB培养基中；37℃、200rpm条件下摇床培养过夜，抽提质粒并Sanger法测序。

一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基及其制备方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010069255.9(22)申请日 2020.01.21(71)申请人邵国地址 014040 内蒙古自治区包头市东河区建设路31号包头医学院(72)发明人邵国　巴德仁贵　鲍牧兰　姜树原　贾小娥　谢伟　谢雅彬　刘晓蕾　许文强　石蕊　(51)Int.Cl.C12N 1/20(2006.01)C12N 1/38(2006.01)C12P 21/00(2006.01)C12R 1/19(2006.01)(54)发明名称一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基及其制备方法(57)摘要本发明属于基因工程、分子生物学等生物技术领域，具体涉及一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基及其制备方法，本培养基可提高大肠杆菌在细胞质内表达可溶性重组蛋白的成功率和产量。

所述高效培养基选取M9培养基，添加山梨醇、乙醇、葡萄糖、蔗糖等基本成分，并辅以硫酸镁和氨苄青霉素，以IPTG为诱导剂，旨在调高外源蛋白的可溶性表达。

所述高效培养基用于表达重组蛋白，特别是大肠杆菌表达可溶性重组蛋白。

本培养基可以用大肠杆菌BL -21或DH5α菌株作为反应菌，也可以用K12或origami B等大肠杆菌菌株作为反应菌。

权利要求书3页说明书10页附图1页CN 111117933 A 2020.05.08C N 111117933A1.一种大肠杆菌表达可溶性重组蛋白的高效培养基，其特征在于：所述高效培养基选取M9培养基，添加山梨醇、乙醇、葡萄糖、蔗糖等基本成分，并辅以硫酸镁和氨苄青霉素，以IPTG为诱导剂，旨在调高外源蛋白的可溶性表达；所述M9培养基的配比如下：配置1L该M9培养基，取750ml无菌去离子水，该去离子水冷至50度或50度以下，加入：5*M9盐溶液 200ml1mol/L硫酸镁 2ml适当碳源的20% 溶液 20ml1mol/L氯化钙 0.1ml灭菌的去离子水定容到 1000ml。

一种提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的方法[发明专利]

专利名称：一种提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的方法
专利类型：发明专利
发明人：闻崇炜,赵烨清,周慧莲,欧阳臻,王晓燕
申请号：CN201510516845.0
申请日：20150821
公开号：CN105087725A
公开日：
20151125
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种有效提高大肠杆菌中可溶性重组蛋白质表达水平的工艺方法，其步骤如下：将表达重组蛋白质的工程菌冻存液按0.1%比例接种到表达用新鲜LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜获得种子液，随后将种子液按照1%比例接种到表达用新鲜LB液体培养基中，37℃继续振荡培养至培养液OD达到预设诱导起点的75%～90%，然后将培养温度升高至40℃继续培养0.5～1.5hr，待培养液OD达预设诱导起点后，向培养液中添加诱导物，继续以37℃或者40℃振荡培养6hr，菌体内可以产生显著的可溶性重组蛋白质。

本发明简便有效，成本低廉，易于放大，适用于生物工程及基因工程中用大肠杆菌表达各种可溶性异源重组蛋白质。

申请人：江苏大学
地址：212013 江苏省镇江市京口区学府路301号
国籍：CN
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一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法[发明专利]

专利名称：一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法专利类型：发明专利
发明人：孙杨,聂简琪,白仲虎
申请号：CN202010969328.X
申请日：20200915
公开号：CN112080456A
公开日：
20201215
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供了一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法，其能通过对发酵方法的各工艺步骤、参数条件以及培养基配制进行综合优化，以提高外源蛋白的表达水平。

一种采用大肠杆菌体系诱导表达重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、在生长温度条件下培养大肠杆菌，生长温度为30‑37℃；步骤2、待细胞密度在OD条件下达到40±5℃时，转为诱导温度下培养大肠杆菌，诱导温度为20‑35℃，诱导温度低于生长温度；步骤3、在诱导温度下培养0.5‑2 h后加入诱导剂进行诱导。

采用本发明方法的表达调控，可有效地延长大肠杆菌培养周期，提高大肠杆菌的细胞密度，同时实现较高的蛋白表达量。

申请人：江南大学
地址：214000 江苏省无锡市滨湖区蠡湖大道1800号
国籍：CN
代理机构：无锡盛阳专利商标事务所(普通合伙)
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一种生物素化蛋白质的制备方法[发明专利]

(10)申请公布号 CN 102010875 A(43)申请公布日 2011.04.13C N 102010875 A*CN102010875A*(21)申请号 200910192139.X(22)申请日 2009.09.08C12N 15/63(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12P 21/02(2006.01)C12P 21/06(2006.01)C12R 1/19(2006.01)(71)申请人广州复能基因有限公司地址510663 广东省广州市广州科学城国际企业孵化器D 区8楼(72)发明人杨淑伟李华平寿建斐林丹黄冰(74)专利代理机构广州三环专利代理有限公司44202代理人刘宇峰(54)发明名称一种生物素化蛋白质的制备方法(57)摘要本发明涉及一种生物素化蛋白质的制备方法，包括以下步骤：(a)构建一种具有多功能的联合标签的蛋白表达载体，所述联合标签至少包括：便于重组蛋白纯化的标签，含有特异蛋白酶切位点的标签，以及生物素化标签；(b)把目的蛋白的编码序列克隆到步骤(a)所述的蛋白表达载体中，所述联合标签与目的蛋白进行融合表达，获得在体内或体外对融合蛋白中的生物素化标签进行生物素化的重组蛋白；以及(c)采用与联合标签相适应的特异性蛋白酶切除融合蛋白中的便于重组蛋白纯化的标签，并切断联合标签中的特异蛋白酶切位点，获得高纯度的生物素化蛋白质。

本发明具有过程集成、工艺简单、生物素化效率高、蛋白结构和活性不受生物素化影响等优点。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 5 页附图 5 页1.一种生物素化蛋白质的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)构建一种具有多功能的联合标签的蛋白表达载体，所述联合标签至少包括：便于重组蛋白纯化的标签，含有特异蛋白酶切位点的标签，以及生物素化标签；(b)把目的蛋白的编码序列克隆到步骤(a)所述的蛋白表达载体中，所述联合标签与目的蛋白进行融合表达，获得在体内或体外对融合蛋白中的生物素化标签进行生物素化的重组蛋白；以及(c)采用与联合标签相适应的特异性蛋白酶切除融合蛋白中的便于重组蛋白纯化的标签，并切断联合标签中的特异蛋白酶切位点，获得高纯度的生物素化蛋白质。

一种采用大肠杆菌表达串联序列制备GLP-1或其类似物多肽的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201911373533.3(22)申请日 2019.12.27(71)申请人万新医药科技（苏州）有限公司地址 215123 江苏省苏州市苏州工业园区星湖街218号生物纳米园A4-213单元申请人江苏万邦医药科技有限公司(72)发明人辛中帅　赵珊珊　文良柱　平康康　徐晓峰　李夷平　(51)Int.Cl.C07K 19/00(2006.01)C07K 14/605(2006.01)C12N 15/62(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称一种采用大肠杆菌表达串联序列制备GLP-1或其类似物多肽的方法(57)摘要本发明公开一种采用大肠杆菌表达串联序列制备GLP -1或其类似物多肽的方法，本发明设计的GLP -1或其类似物的重组串联蛋白通式为：X -(Y -Z)n。

其中：X为前导肽，Y为胰蛋白酶和CPB酶双酶切位点或Kex2酶和CPB酶双酶切位点及辅助序列，Z为GLP -1或其类似物。

n为串联重复数。

通过大肠杆菌原核表达体系进行发酵诱导表达GLP -1或其类似物的重组串联蛋白形成的包涵体无需变性剂即可完全溶解，溶解液经胰蛋白酶和CPB酶双酶切或Kex2酶和CPB酶双酶切获得GLP -1或其类似物。

本方法获得的GLP -1或其类似物表达量高，酶切后GLP -1目的蛋白收率及酶切后纯度高。

权利要求书1页说明书17页序列表60页附图6页CN 111072783 A 2020.04.28C N 111072783A1.一种GLP -1或其类似物重组串联蛋白序列，其特征在于，氨基酸序列通式为：X -(Y -Z)n；其中：X为5-10个氨基酸形成的前导肽，氨基酸组成包括但不限于：A丙氨酸、L亮氨酸、N天冬酰胺、R精氨酸、S丝氨酸、F苯丙氨酸、H组氨酸、M甲硫氨酸、V缬氨酸；优选的序列组成为MMRLN或MMRLNSA或MMRLNSAFV；Y为胰蛋白酶和CPB酶双酶切位点或Kex2酶和CPB酶双酶切位点及辅助序列，通式为Y＝y -m -y；其中，y为R或K或RR或KK或RK或KR；m为4-12个氨基酸形成的专属连接序列；优选的序列组成GSGSEEGSGS或GSGSDDGSGS或GSGSEDGSGS或GSGSDEGSGS或EEAE或DDAD或TEEAEKL或TDDADKL或TEDAEKL或TDEADKL或EGTEEAEKLG或EGTDDADKLG或EGTEEADKLG或EGTDDAEKLG或EGTEDADKLG或EGTDEAEKLG；Z为GLP -1或其类似物，氨基酸序列选自SEQ ID No.20～SEQ ID No.27中的任意一种：SEQ ID No.20：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG、SEQ ID No.21：HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG、SEQ ID No.22：EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVRGRG、SEQ ID No.23：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS、SEQ ID No.24：HAEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS、SEQ ID No.25：HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPSKKKKKK、SEQ ID No.26：HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR、SEQ ID No.27：HGEGTFTSDVSSYLEEQAAKEFIAWLVKGGG；n为2-7的整数，优选为3、4或5。

用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基及其制备方法[发明专利]

专利名称：用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基及其制备方法
专利类型：发明专利
发明人：谭昊,甘炳成,彭卫红,黄忠乾,李小林,唐杰,谢丽源,吴翔
申请号：CN201610130056.8
申请日：20160308
公开号：CN105671113A
公开日：
20160615
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于重组蛋白表达领域，具体涉及一种用于大肠杆菌分泌表达重组蛋白的培养基及其制备方法，本发明培养基中每1000毫升含有：胰蛋白胨12-16克、酵母提取物6-10克、D-山梨醇60-100克、氯化钠8-16克、D-葡萄糖1-2克、1mol/L？Tris-HCl缓冲液(pH7.2)20-100毫升、加去离子水至1000毫升。

该培养基可促进大肠杆菌通过信号肽向周质空间分泌重组蛋白，促进周质空间中的重组蛋白通过非特异性分泌途径进一步释放到培养基液体中，进而提高大肠杆菌分泌表达重组蛋白的成功率和产量。

申请人：四川省农业科学院土壤肥料研究所
地址：610066 四川省成都市锦江区狮子山路2区四川省农业科学院土壤肥料研究所
国籍：CN
代理机构：成都虹桥专利事务所(普通合伙)
代理人：高芸
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一种生物素化抗体及其制备方法和应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810116100.9(22)申请日 2018.02.06(71)申请人上海蓝怡科技股份有限公司地址 201199 上海市闵行区友东路85号申请人浙江蓝怡医药有限公司(72)发明人李子樵　康绍乐　(74)专利代理机构北京品源专利代理有限公司11332代理人巩克栋(51)Int.Cl.C07K 16/00(2006.01)C07K 1/107(2006.01)G01N 33/53(2006.01)(54)发明名称一种生物素化抗体及其制备方法和应用(57)摘要本发明提供一种生物素化抗体及其制备方法和应用，所述制备方法包括以下步骤：制备待生物素化的抗体蛋白的缓冲液体系；向待生物素化的抗体蛋白的缓冲液体系中加入生物素溶液，进行反应；将反应后的体系在缓冲液中进行渗析，而后进行纯化处理，得到所述生物素化抗体。

本发明制备的生物素化抗体可以显著增加免疫检测的灵敏度和信号强度，并且本方法操作简单，易于完成且不会引入其他不确定因素，对免疫检测试剂盒质量的提高有可预见的作用，具有广阔的应用前景。

权利要求书2页说明书5页CN 108341867 A 2018.07.31C N 108341867A1.一种生物素化抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备待生物素化的抗体蛋白的缓冲液体系；(2)向待生物素化的抗体蛋白的缓冲液体系中加入生物素溶液，进行反应；(3)将步骤(2)反应后的体系在缓冲液中进行渗析，而后进行纯化处理，得到所述生物素化抗体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述制备待生物素化的抗体蛋白的缓冲液体系的方法为：使用缓冲液将待生物素化的抗体蛋白稀释至0.5-2mg/mL，而后在缓冲液中渗析得到所述待生物素化的抗体蛋白的缓冲液体系。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为碳酸盐缓冲液；优选地，使用缓冲液将待生物素化的抗体蛋白稀释至0.1mg/mL；优选地，所述碳酸盐缓冲液的pH值为8.0-8.5；优选地，所述碳酸盐缓冲液中溶质的浓度为0.02-0.2mol/L。

一种实现大肠杆菌基因无痕同源重组的方法[发明专利]

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201610039395.5(22)申请日 2016.01.21C12N 15/72(2006.01)(71)申请人浙江大学地址310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘路866号(72)发明人黄磊姜灵轩徐志南蔡谨(74)专利代理机构杭州求是专利事务所有限公司 33200代理人邱启旺(54)发明名称一种实现大肠杆菌基因无痕同源重组的方法(57)摘要本发明公开了一种大肠杆菌基因无痕同源重组的方法，该方法基于Lac 阻遏系统和抗性筛选实现；通过构建包含lac 操纵序列控制的抗性操纵子的大肠杆菌重组菌和包含正负筛选标记的无痕重组工具基因串，建立了一种大肠杆菌无痕同源重组的方法，可实现目的基因对大肠杆菌染色体上的靶位点进行无痕重组的目标，对大肠杆菌染色体进行基因编辑研究工作具有重要的意义。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页说明书5页序列表9页附图3页CN 105505974 A 2016.04.20C N 105505974A1.一种实现大肠杆菌基因无痕同源重组的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将抗性基因A与lac操纵序列相连，得到操纵子，所述抗性基因A为可用于大肠杆菌抗性筛选的基因；（2）将操纵子同源重组替换大肠杆菌染色体上的野生型lacI基因及其启动子；（3）用无痕重组工具基因串对步骤2同源重组替换后的大肠杆菌的靶位点序列进行同源替换；所述无痕重组工具基因串由正筛选标记抗性基因B与负筛选标记lacI阻遏物基因反向连接而成，抗性基因B为可用于大肠杆菌抗性筛选的基因；负筛选标记lacI阻遏物基因包含placIq启动子；（4）利用抗性对步骤3同源替换后的大肠杆菌进行筛选，获得重组成功的重组子；（5）用目标DNA片段同源替换步骤4所得到的阳性大肠杆菌重组子中的工具基因串，利用抗性对目标DNA片段同源替换后的大肠杆菌进行筛选，得到重组成功的无痕同源重组子。

一种蛋白质生物素连接酶及其邻近蛋白标记系统和应用[发明专利]

专利名称：一种蛋白质生物素连接酶及其邻近蛋白标记系统和应用
专利类型：发明专利
发明人：刘峰,马晓骁,吴苏,松阳洲,李影影
申请号：CN202210131204.3
申请日：20220211
公开号：CN114457048A
公开日：
20220510
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于基因工程技术领域，公开了一种蛋白质生物素连接酶及其邻近蛋白标记系统和应用。

本发明的这种蛋白质生物素连接酶，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，包括F16L、E24Q、F25Y、M44A、H46R、E54F、E54G、W61Y、K110R、R233G、V13D、I14D中的至少一种点突变位点。

本发明的蛋白质生物素连接酶标记强度高，所需标记时间短；减少了在翻译过程中不正确的截短体和二聚化倾向，适用于标记细胞内微弱的蛋白相互作用、信号通路短时间内发生变化的蛋白质及其邻近蛋白质组分，可用于各种细胞器相关组分的探索，细胞内各类信号通路相关蛋白的找寻以及与细胞间交流相关蛋白的捕捉。

申请人：中山大学
地址：510275 广东省广州市新港西路135号
国籍：CN
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910203784.0
(22)申请日 2019.03.18
(71)申请人福建农林大学
地址 350002 福建省福州市仓山区上下店
路15号
(72)发明人聂鑫怡　李博文　
(74)专利代理机构福州元创专利商标代理有限
公司 35100
代理人蔡学俊
(51)Int.Cl.
C12N 15/65(2006.01)
C12N 15/70(2006.01)
(54)发明名称一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统(57)摘要本发明公开了一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统及方法，属于生物技术领域。

该系统使用一种伴侣质粒，可通过阿拉伯糖诱导表达去除DNA结合区的大肠杆菌生物素连接酶催化结构域，与目的蛋白大肠杆菌表达载体及相应的工程菌株配合，可在获得重组目的蛋白的同时，对表达出的目的蛋白进行特异性、高效的生物素标记。

同时，本发明在此系统的基础上，提供了一种可与乳糖操纵子系统的载体配合，适用于高密度自动诱导，可实现大规模重组蛋白的批量生物素化标记方法。

本发明将极大提高蛋白质生物素化标记的效率和操作便利性，进而推动其在生物活性分子（DNA/RNA/蛋白质）标记、检测、纯
化以及固定化等众多过程的应用。

权利要求书1页说明书11页序列表7页附图7页CN 109880840 A 2019.06.14
C N 109880840
A
权　利　要　求　书1/1页CN 109880840 A
1.一种生物素标记伴侣质粒，其特征在于：以带有p15复制起点和筛选标记氯霉素抗性基因为质粒骨架，插入了来源于沙门氏菌的阿拉伯糖操纵子包含阿拉伯糖诱导启动子araBAD Promoter以及其阻遏蛋白编码基因araC，在araBAD Promoter下游插入了去除了N 端63个氨基酸编码区的截短型的生物素连接酶tBirA基因。

2.根据权利要求1所述的生物素标记伴侣质粒，其特征在于：所述截短型的生物素连接酶tBirA，具体为删除大肠杆菌BirA蛋白N端63个氨基酸的截短蛋白，其编码序列选自：（1）核酸序列SEQ ID No. 1，编码蛋白序列SEQ ID No. 2；或
（2）在上述（1）限定的序列中通过密码子简并取代，或一个或几个氨基酸取代、缺失或插入，且具有其对应体内功能的由（1）限定序列所衍生的蛋白或多肽。

3.根据权利要求1所述的生物素标记伴侣质粒，其特征在于：；所述沙门氏菌的阿拉伯糖操纵子包含阿拉伯糖诱导启动子araBAD Promoter以及其阻遏蛋白编码基因araC，两者的编码序列选自：核苷酸编码序列SEQ ID No. 3。

4.一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统，其特征在于：包含权利要求1所述的生物素标记伴侣质粒。

5.如权利要求4所述的一种重组蛋白大肠杆菌体内生物素化标记系统在生物活性分子标记、检测、纯化以及固定化中的应用。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：表达并生物素标记重组蛋白的步骤和条件如下：
（1）目的蛋白编码基因与生物素连接酶底物标签融合克隆，连入表达载体中；
（2）目的蛋白表达载体与生物素标记伴侣质粒共同转化大肠杆菌工程菌株，利用氯霉素和表达载体所需的抗生素联合筛选阳性菌株；
（3）阳性菌株单克隆接入常用大肠杆菌培养基中，加入10-40 μg/mL氯霉素和50-200 μg/mL氨苄青霉素或25-100μg/mL硫酸卡那霉素，以及0.001-0.5%(m/v)L-阿拉伯糖，37℃ 200-300rpm摇床预培养2-6hr，至菌体密度达到目的蛋白诱导密度；
（4）加入目的蛋白的诱导剂以及50μM d-生物素，诱导培养；或在12-25℃下低温冷激直接进行诱导；所述诱导剂为0.1-1mM IPTG或0.05wt.%-0.5wt.%乳糖。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：重组蛋白大肠杆菌体内自动诱导及生物素化标记方法，其步骤和条件如下：
（1）目的蛋白编码基因与生物素连接酶底物标签融合克隆，连入表达载体中；
（2）目的蛋白表达载体与生物素标记伴侣质粒共同转化大肠杆菌工程菌株，利用氯霉素和表达载体所需的抗生素联合筛选阳性菌株；
（3）阳性菌株单克隆接入自动诱导标记培养基中，加入10-40 μg/mL氯霉素和50-200 μg/mL氨苄青霉素或25-100μg/mL硫酸卡那霉素以及0.001-0.5%(m/v)L-阿拉伯糖、50μM d-生物素，37℃ 200-300rpm摇床预培养2-6hr，至菌体密度达到目的蛋白的诱导密度，继续培养或转入目的蛋白10-30℃诱导温度下培养直至收菌。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述自动诱导标记培养基为在大肠杆菌培养基基础上添加0.25%-2.5%(m/v)甘油、0.01-0.1%(m/v)D-葡萄糖、0.1-0.5%(m/v)α-D-乳糖以及0.01-0.5%(m/v)L-阿拉伯糖的组合碳源，同时加入维持培养基pH中性的缓冲盐。

2。