南方根结线虫侵染黄瓜幼根组织病理学观察

中国农业大学学报２００８，１３（４）：５卜５６ＪｏｕｍａｌｏｆＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａＩＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ南方根结线虫侵染黄瓜幼根组织病理学观察刘奇志１李娜１’２王丽２谢德燕１（１．中国农业大学农学与生物技术学院，北京１００１９３；２．中国农业大学生物学院，北京１００１９３）摘要人工接种南方根结线虫（ＭＰ￡ｏｉｄｏｇｙ行ｉｎｃｏｇ疗ｉ￡口），观察不同侵染时间黄瓜根部组织的病理特征。

结果显示：接种后６ｄ的根尖分生区、伸长区出现膨大、对称的根结，根中心的原形成层细胞分化出巨型细胞；１０ｄ在根毛区及以上部位出现既有对称又有偏于一侧的根结，周围有原生木质部导管出现，根结中巨型细胞阻断了导管｝１６ｄ次生维管组织提早出现；２０～３０ｄ导管纵向排列无序，形状扭曲，皮层中有新维管组织产生。

总之，随侵染时间的延长，根部受害部位逐渐由内皮层扩展至皮层，根结逐渐由巨型细胞、提早形成的次生维管组织以及皮层中的新维管组织共同形成；导管逐渐受阻，排列扭曲无序。

关键词黄瓜；南方根结线虫；根结；巨型细胞；维管组织；病理结构中图分类号Ｓ４３６．４２１．２９；Ｓ４３２．２５文章编号１００７—４３３３（２００８）０４一００５１一０６文献标志码ＡＨｉｓｔＯｐａｔｈｏＩＯｇｉｃａＩＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｃｕｃｕｍｂｅｒｒａｄｉＣＩｅｉｎｆｅＣｔｅｄｂｙｒＯＯｔ－ｋｎＯｔｎｅｍａｔＯｄｅＬＩＵＯｉ．ｚｈｉｌ，ＬＩＮａｌ”，ＷＡＮＧＬ．２，ＸＩＥＤｅ－ｙａｎｌ（１．ｃｏ¨ｅｇｅ０ｆＡｇ舢ｍｙａｎｄＢｉｏｔ∞ｈｎｏＩｏｇｙｔＣｈｉｎａＡｇｒｊｃｕＩｔｕｒａｌＵｎｉＶｅｒ８ｊｔｙ，朗ｉｊｉｎｇ１００１９３，ＣｈｉｎａＩ２．ｃｏＩＩｅｇｅｏｆＢｉｏ嘲ｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＣｈｉｎａＡｇｒｌｃｕＩｔｕｒａｌＵｎｉＶｅｒｓｉｔｙ，鼬ｉｊｉｎｇ１００１９３，ｃｈｉｎａ）Ａｂｓ”ａｃｔＰａｔｈＯＩｏｇｊｃａｌｆｅａｔｕｒｅｓＯｆａｃｕｃｕｍｂｅｒｒａｄｉｃＩｅｔＩｓｓｕｅｉｎｏｃｕＩａｔｅｄｗｉｌｈｒｏｏｌ·ｋｎＯｔｎｅｍａｔｏｄｅｓ（ＲＫＮ，Ｍｅ『ｏｆｄＤｇｙｎｊｎ—ｃｏｇ几ｊｆａ）ｗｅｒｅｏｂｓｅｒＶｅｄＯｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄａｙｓ．Ｓｉ×ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｏｃｕｌａｌｉＯｎ，ｔｈｅｃｕｃｕｍｂｅｒｎＤ０ｔｔｉｐｗａｓｓ¨ｇｈｔＩｙｓｗｏｌＩｅｎａｎｄＳｙｍｍｅｔｒｉｃａＩｒ∞ｔ—ｋｎＯｔｓｗｅｒｅＯｂ∞ｒｖｅｄａｔｔｈｅｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃａｎｄｅ１０ｎｇａｔｉＯｎＺ０ｎｅｓ．Ｇｉａｎｔｃｅ¨ｓｗｅｒｅｄＩｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｂｙｐ旧一ｖｉＯｕＳｃａｍｂｉｕｍｃｅｆＩｓｉｎｔｈｅｃｅｎｔｅｒ０ｆ竹ＩｅｒｃＤｔ，１０ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｏｃｕＩａｔｉＯｎ，ｓｙｍｍｅｔｒｉｃａＩａｎｄｓｅｃＯｎｄａｒｙｒｏｏｔ．ｋｎＯｔｓｗｅｒｅｏｂ一∞～ｅｄａｔｔｈｅｒ００ｔｈａｉｒａｎｄｕｐｐｅｒＺｏｎｅｓ．Ｖｅｓ∞Ｉｓｗｅｒｅ∞ｐａｒａｔｅｄｂｙｇｉａｎｔｃｅＩＩｓ，ａｒｏｕｎｄｗｈｉｃｈｐｒｏＩｏｘｙｌｅｍＶｅｓ∞Ｉｓｗｅｒｅｏｂ∞ｒｖｅｄｌｌ６ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｏｃｕＩａｔｉｏｎ，ｈｙｐ弘Ｖａ∞ｕＩａｒｔＩ胬ｕｅａｐｐｅａｒｅｄｅａｒ¨ｅｒｔｈａｎｎｏｒｍａＩ；２０—３０ｄａｙｓａｆｔｅｒｉｎｏｃｕＩａｔｉｏｎ，ｔｈｅｖｅｒｔｉｃａｌａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｏｆＶｅｓ∞ｌｓｗａｓｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ，ｓｈａｐｅｗａｓｄｉｓｔｏｒｔｅｄａｎｄａｎｅｗＶａｓｃｕＩａｒｔｉ豁ｕｅａｐｐｅａｒｅｄｉｎｌｈｅｃｏｒｔｅｘ．ＷｉｔｈｔｉｍｅａｆｔｅｒｉｎｏｃｕＩａｔｉｏｎｗｉｔｈＲＫＮ，ｔｈｅｉｎｉｕｒｅｄＤａｒｔｓｏｆｔｈｅｒｏｏｔｔｉｓｓｕｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｆｒｏｍｅｎｄｏｄｅｒｍｔｏｃｏｒｔｅ×，ｔｈｅｒＯｏｔ－ｋｎＯｔｓｗｅｒｅｇｒａｄｕａｌＩｙｆＯｒｍｅｄｂｙｇｉａｎｔｃｅ¨ｓ，ｅａｒＩｉｅｒａｐｐｅａｒｅｄｈｙｐｏ－ＶａｓｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｎｅｗＶａｓｃｕｌａｒｔｉｓｓｕｅｓｉｎｔｈｅｃＯｒｔｅ×；ＶｅｓｓｅＩｓｗｅｒｅ８ｕ竹ｏｃａｔｅｄｇｒａｄｕａ¨ｙｕｎｔｉＩ廿１ｅｙｗｅｒｅｄｉ∞ｒｄｅｒｅｄａｎｄｄｉｓｌｏｒｔｅｄｉｎｓｈａｐｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓｃｕｃｕｍｂｅｒ；ｒｏｏｔ－ｋｎｏｌｎｅｍａｌｏｄｅ，ｎＤ０ｔ—ｋｎｏｌ，ｇｉａｎｔｃｅ¨ＩＶａｓｃｕＩａｒｔｉｓｓｕｅ；ｐａｔｈｏＩｏｇｉｃａＩｓｔｒｕｃｔｕ怕以南方根结线虫（ＭＰｚｏｉｄｏｇｙｎＰｉ行ｃＤｇ，２ｉ￡口）、爪哇根结线虫（Ｍ．，口撇，ｌｉｆ口）、花生根结线虫（Ｍ．口ｒＰ一，ｚ口ｒ缸）和北方根结线虫（Ｍ．＾口ｐ缸）为主要植物病原的根结线虫危害多种作物［１］根部，造成重大病害，其中瓜类、茄类、豆类作物受害最重［２］。

关于线虫问题，多数研究集中在防治方面，近些年在抗性基因定位、克隆、品种分子选育等方面也有研究报道［３］，但对根结线虫侵染后根部组织结构变化的研究较少，仅见少量有关巨型细胞的报道陆川。

如，爪哇根结线虫（Ｍ．．『口口口以ｉ∞）侵染豆科植物（Ⅵ一ｃ缸厂口妇）后正常细胞核多次分裂而胞质不分裂，从而形成巨型细胞［４３；巨型细胞过多消耗寄主营养，影收稿日期：２００８一０１—１５基金项目：国家“８６３”计划课题（２００６ＡＡ０６２３５４）作者简介：刘奇志，教授，主要从事线虫的生物防治研究，Ｄｍａｉｌ：ｌｑｚｚｙｘｌ２６＠１２６．ｃｏｍ｝王丽，副教授，通讯作者，主要从事植物超微结构与病变特征研究，纪ｚｈａｎｇ＠ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ中国农业大学学报２００８年第１３卷响植物体营养和水分的运输［４１；根结线虫侵染鹰嘴豆（ｃｈｉｃｋｐｅａ）后所产生的巨型细胞来源取决于取食位点细胞，位点不同，细胞来源可能不同，由此推断巨型细胞可以来源于多种细胞［５１；不同种的根结线虫，侵染产生的巨型细胞数量不同，每个巨型细胞内的细胞核数目不同，取食位点也不同［５。

６１；植物对根结线虫的抗性表现在植物生长过程中对巨型细胞的解体形式，如南方根结线虫侵染不同品种的烟草，产生的巨型细胞在不同品种中的解体形式不同，抗性品种中所产生的巨型细胞以空洞化的形式解体，以此枯竭根结线虫的食物来源，最终导致根结线虫饥饿死亡，由此认为巨型细胞空洞化具有积极意义，可能是寄主植物的一种抗性机制口］。

但是，此时的巨型细胞毕竟已经导致了植物过多营养的消耗以及营养和水分的运输［８］。

因此，跟踪观察根结线虫侵入寄主植物后不同时间内巨型细胞的形成部位和来源分化、维管组织的病理学特征，对及时采取有效措施控制根结危害部位的扩展、进而控制生产中根结线虫的危害有指导意义。

本研究拟观察南方根结线虫侵染黄瓜（ＣＨｃＨ—ｍｉｓｓｎ￡而＂ｓ）寄主后，随侵染时间的延长，根部根结的病理结构变化，以明确根部受害时间、部位及病理特征，为进一步探讨根结线虫的致病机理、确定防治时间、选择或研制有效的防治药剂提供参考。

ｌ材料与方法１．１根结线虫收集及接种自来水洗带有大量根结的寄主根系，去表面土后，１％（质量分数）的ＮａＣｌ０消毒４ｍｉｎ，自来水冲洗３ｍｉｎ，蒸馏水漂洗４次，剖取根上的卵块置于３０肚ｍ尼龙筛上，室温孵化二龄幼虫，每日收集幼虫，４℃保存Ⅲ，取近５ｄ内收集的幼虫接种［６’８１。

１．２幼苗培养花卉营养土（吉林省德惠市芳洁花土厂生产）、沙子和黏土按３：３：ｏ．５比例（体积比）混合，高压灭菌锅１２１℃、０．１０５ＭＰ大气压下湿热灭菌４０ｍｉｍ，以杀死其中的微生物和线虫。

将灭菌土装入具有小格（上底４．５ｃｍ×４．５ｃｍ、下底３ｃｍ×３ｃｍ、高５ｃｍ）的培养盘内，装２盘，每盘７２棵。

黄瓜种子（市售千秋四号）浸泡发芽后，分别埋入方格中，每格种子１粒。

２８℃、１４ｈ和２０℃、１０ｈ光照培养箱培养，每２ｄ淋或浇１次水。

长出第１片真叶时（约６ｄ）在其中一盘内每孔接种根结线虫约１５０条，作为处理，未接种根结线虫的一盘作为对照。

接种后每２ｄ取样观察１次，记录黄瓜根系根结数量、大小，并进行染色、切片观察。

１．３根系透明及染色分别取接种苗及对照苗６株，次氯酸钠一酸性品红法染色观察，酸性甘油（加若干滴５ｍｏｌ／ＬＨＣｌ）保存［引，于ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ５１光学显微镜下观察根结的形成及其部位，并拍照。

１．４石蜡切片及染色南方根结线虫在１９．５℃下生活周期为４４ｄ，３０℃条件下生活周期２０ｄ［１０］。

本试验黄瓜幼苗培养温度为２０～２８℃，观察至第３０天根表面见到卵块止（根结线虫１个生活周期）。

从接种后第３天开始，每２ｄ取接种及对照幼苗各３株切片染色。

第１次取初发现的根结，之后每次取根系上较大的根结，对照苗取根系对应部位。

ＦＡＡ固定２４ｈ后每隔１ｈ依次用体积分数分别为７０％、８０％、９０％、９５％、１００％的酒精脱水，其中１００％酒精脱２次；二甲苯透明后６０℃浸蜡包埋；旋转切片机横、纵切片，厚度１０似ｍ；动物胶粘片于载玻片上，４０℃烘干，番红一固绿对染，加拿大树胶封固［１１。

１２。

，０ｌｙｍｐｕｓＢＸ５１光学显微镜下观察并拍照。

２结果与分析２．１根结数量及根结最大直径观察黄瓜幼苗接种根结线虫后，在观察周期内，根结数量及根结最大直径变化随接种天数的增加而增加（图１）。

接种后６ｄ，在接种苗的各级侧根根尖部位开始见有根结（图２（ｃ）），直径最大可达０．５ｍｍ，而对照根相应部位只有Ｏ．１ｍｍ；接种后１０ｄ，对照根系生长正常，主根明显，下胚轴笔直，苗根的相应部位只有Ｏ．２ｍｍ（图２（ａ）），而接种苗主根不明显，下胚轴弯曲。

根尖部位及远离根尖的部位均有明显根结（ｒｋ），既有对称的又有偏于一侧的，部分根结成串存在（图２（ｂ）），直径最大可达１．１ｍｍ；１６ｄ时接种苗根结数量明显增多，直至第３０天时平均每株幼苗根结数增加到５４．５个，根结直径最大可达２．８ｍｍ（图１），而对照根无根结，相应部位只有Ｏ．４ｍｍ。

２．２根系整体观察及整体透明染色观察本实验观察到根结出现的第一时间在接种后第６ｄ，根尖部位整体透明ＮａＣｌｏ酸性品红染色后，观察到红色膨大、对称的根结，最初出现部位主要在各级侧根尖端的分生区及伸长区（图２（ｃ））；接种后８第４期刘奇志等：南方根结线虫侵染黄瓜幼根组织病理学观察５３嚣、赧埒轻接种后天数量蹬删好骧斗＜嚼圈１根结线虫接种天数与根结数量及根结最大直径的关系Ｆｉｇ．１Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｎｅｍａｔｏｄｅｉｎｃｕｂａｔｉｏｎｐｅｒｉｏｄａｎｄｒ∞ｔ—ｋｎｏｔｑｕａｎｔｉｔｙａｎｄｉｔｓｂｉｇｇｅｓｔｓｉｚｅｄ，通过ＮａＣｌｏ酸性品红染色，在伸长区之上的根毛区及更上方可见侵入根内的二龄根结线虫（图２（ｆ））；接种后１０ｄ，根系整体观察，根结线虫侵染的幼苗主根不明显，下胚轴弯曲，根结明显，有的连接成串，可见既有对称又有偏于一侧的根结（图２（ｂ））。