检测犬瘟热病毒的单克隆抗体胶体金试纸条的制备

1 材料与方法
1.1 病 毒 鉴 定 CDV-HB 株 为 扬 州 大 学 兽 医 比 较 医 学 中 心 分 离、 纯 化 和 保 存； 参 照 已 发 表 的 CDV H 基因序列设计引物，上游引物为 5'-GTAG GATCCATGCTCCCCTACCAAGACAA-3'， 下 游 引 物 为 5'-ATGTCGACTATCCCCAGTGACAATA CTAG-3'，使用 RT-PCR 对分离的 CDV-HB 毒株 进行鉴定。PCR 反应参数为：94 ℃预变性 2 min 后， 94 ℃ 变 性 45 s、55 ℃ 退 火 1 min、68 ℃ 延 伸 1 min，进行 30 个循环，最后以 68 ℃延伸 10 min， PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳后，EB 染色观察。 1.2 病 毒 与 细 胞 CDV (Onderstepoort 株 )， 犬 细小病毒（Canine parvovirus, CPV）和犬冠状病毒 （Canine corona virus, CCV）标准抗原均由军事医 学科学院兽医研究所惠赠；6 周龄雌性 BALB/c 小 鼠、ICR 小鼠购自扬州大学比较医学中心；Vero 细 胞和骨髓瘤细胞 SP2/0 由本室保存。 1.3 抗原制备和动物免疫 Vero 细胞长成单层 后经胰酶消化吹散，按 1:2 传代，取细胞培养液 量 1/10 的病毒液同步接种 CDV-HB；待细胞病变 达 80% 时，将培养液反复冻融 3 次，3 000×g 离 心 30 min，10 000×g 离心 30 min，去除细胞碎片 后，在上清中加入 PEG 6000 至终浓度为 9%，加入 NaCl 至终浓度为 0.3 mol/L，4 ℃搅拌 2 h 后，置 4℃ 过夜；18 000×g 离心 2 h，弃上清，用 5 mL PBS 悬浮沉淀，按参考文献 [6] 免疫小鼠。 1.4 MAb ELISA 检测方法的建立 按方阵滴定
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中国动物传染病学报
2011 年 3 月
制备按参考 Millipore 公司免疫层析试纸条制作手 册（第二版）进行。取蛋白浓度为 3.12 mg/mL 的 CDV-HB 单 抗， 以 1.2 μL/cm 的 量 标 记 T 线， 取 蛋白浓度为 2.42 mg/mL 的兔抗鼠 IgG 高免血清， 以 1.0μL/cm 的 量 标 记 C 线； 取 35μL/cm 标 记 的 免疫金垫，与上述 T、C 线组装成试纸条。取标准 CDV，CPV 和 CCV 抗原，PBS 和阴性检测液，用 制备的胶体金试纸条进行检测，验证其特异性。
的不足，导致动物感染 CDV 的诊断延误，错过适 宜的控制时机，会给毛皮经济动物产业带来巨大损 失，严重阻碍该产业的顺利发展。因此，对水貂犬 瘟热进行准确、快速的检验对水貂养殖业的健康发 展非常重要。
CDV 的实验室诊断具有快速、准确和特异性 强的优点，可以在疾病早期确诊，提高疾病的治愈 率，但目前常用的 RT-PCR 方法对专业技术要求高，
1000
904
900
500
图 1 RT-PCR 扩增到 H 基因片段 Fig.1 The H gene fragments (904 bp) was amplified by RT-PCR
法建立间接 ELISA 法 [7]。以 1:100~1:3200 稀释的 抗原包被 ELISA 板，确定抗原的最佳稀释度；以 1:100~1:12 800 倍比稀释 BALB/c 雌性小鼠的阴阳 性血清，确定血清的最佳工作浓度；加入 1:5000 工作浓度的 HRP 羊抗鼠 IgG( 购自 Sigma 公司 )， 以 TMB 为 底 物， 测 定 OD450 值， P/N ≥ 2.1 判 为 阳性。 1.5 细胞融合与杂交瘤细胞的筛选 取免疫小 鼠脾细胞，按照参考文献 [8] 进行细胞融合与选择 性培养，用建立的间接 ELISA 方法进行筛选，阳 性细胞用有限稀释法对其进行克隆与扩大培养。 1.6 腹水的制备和效价及亚类鉴定 按照参考 文献 [9] 制备腹水，并取少量腹水测定效价，按照 Sigma 公司的 MAb 亚类鉴定试剂盒操作说明鉴定 MAb。 1.7 间接免疫荧光试验 接种 CDV-HB 的 Vero 细 胞 培 养 板 经 固 定 后， 用 PBS 洗 涤 3 次，5 min/ 次；拍干，然后分别加入 1:50 稀释的鼠源阳性、 阴性血清各 100 μL，1:50 稀释的腹水各 100 μL， 加完样品后做好标记，置 37 ℃作用 1 h，PBS 洗涤 3 次，每次 5 min，拍干；加入 1:200 稀释的羊抗鼠 IgG+IgM 荧光二抗，37 ℃作用 45 min，同样洗涤 后拍干，荧光显微镜观察结果。 1.8 柠檬酸三钠法制备胶体金溶液 参照参考 文献 [10] 将 200 mL 氯金酸溶液加热至沸腾，迅速 加入 1% 柠檬酸三钠溶液，溶液颜色从浅黄逐渐变 黑，然后变红，继续煮沸 10 min，搅拌状态下冷却， 冷却后微孔滤膜过滤，4 ℃保存备用。 1.9 McAb 的纯化和金标记 按参考文献 [11,12] 纯化抗 CDV-HB 单克隆抗体，紫外分光光度计检 测洗脱液蛋白含量。用 0.2 mol/L K2CO3 溶液将金 溶胶调节到最适 pH 值 8.7，在每毫升胶体金溶液 中 分 别 加 入 12、9、6、3、1μg和 0.5μg单 抗， 室 温作用 5 min；分别加入 10% 的 NaCl 溶液 50μL， 混匀后静置 2 h；记录胶体金溶液颜色变化最小的 蛋白量，室温静置 2 h，此时颜色变化最少的蛋白 量即为最小标记蛋白量；在最小蛋白量基础上增加 10%，即为标记时所需蛋白的最适量。 1.10 免疫试纸条的制备和初步鉴定 试纸条的
(1.Xuzhou Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, JiangSuProvince, Xuzhou 221006,China;
2.YangZhou University, College of Veterinary Medicine, Yangzhou 225009,China)
Abstract: The canine distemper virus (CDV-HB) isolated from mink was cultured and purified. The splenocytes from mice immunized with purified CDV-HB were fused with SP2/0 myeloma cells. Positive hybridoma was screened by indirect ELISA, and two monoclonal antibodies against CDV-HB were generated and designated as 2E1 and 7F3. The ELISA titers of the two antibodies in ascites were more than 107. The subtype identification of the antibodies demonstrated that the 2E1 belonged to IgM, and the 7F3 was IgG1. The specific interaction between CDV-HB virus and monoclonal antibodies was certified by indirect IFA. The MAb of 2E1 was purified and labeled with gold particles, which was prepared by sodium citrate method, to develop a colloidal gold immuno-chromatographic test strip for CDV detection, and the results indicated that the strip had the good specificity for CDV detection. Key words: Canine distemper virus; monoclonal antibody; colloidal gold immunochromatographi010-08-05 基金项目：江苏检验检疫局科研基金资助项目（2009KJ05） 作者简介：房超，男，硕士研究生，临床兽医专业 通信作者：易海华，E-mail:yihaihua88@
第 19 卷第 2 期
房超等：检测犬瘟热病毒的单克隆抗体胶体金试纸条的制备
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病毒电镜观察方法又需要昂贵的仪器和专业的 技术人员 [2]。依赖于单克隆抗体的胶体金免疫层析 检测方法操作简便，特异性高，不仅检测时间短， 还可进行现场检测，但是目前制备抗 CDV 单克隆 抗体的病原均从犬中分离，尚未有用水貂分离病毒 来制备抗 CDV 单抗的报道 [3-5]。因此，用现有单抗 来制备检测水貂犬瘟热的胶体金试纸条可能会造成 假阳性或假阴性结果。鉴于此，本研究利用单克隆 抗体技术制备水貂源 CDV 单抗，并对金标免疫层 析法检测进行摸索，旨在为建立特异、快速、经济 的水貂犬瘟热病毒感染检测方法奠定基础。
2 结果
2.1 CDV-HB 的 RT-PCR 鉴定 采用 H 基因的 引物对 CDV-HB 进行了 RT-PCR 扩增，PCR 产物 在 1% 的琼脂糖凝胶上电泳后染色观察，结果显示 以 CDV-HB 的 RNA 模板可以扩增出大小为 904 bp 的特异性片段 ( 图 1)。
１２３ bp
945
犬瘟热（canine distemper, CD）是由传染性犬 瘟热病毒（Canine distemper virus, CDV）引起的急 性、高度接触性传染病，目前已成为危害我国乃至 全世界养犬业、皮毛动物养殖业和野生动物保护业 最严重的疫病之一 [1]。随着经济动物饲养业的集约 化、规模化，经济动物疫病尤其是水貂犬瘟热等传 染病会形成暴发流行，同时，由于缺乏有效的现场 检测手段以及养殖单位对经济动物感染 CDV 认识