电镜及电子显微镜技术

电子显微镜技术

前言

自从光学显微镜出现以后，人类打开了微观世界的大门，看到了很多用肉眼所看不到的微小物体，例如细胞、细菌等，使人眼睛的分辨力由0.2mm提高到0.2μm。但是，光学显微镜由于光线波长的限制，它的分辨极限是0.2μm，有效放大倍数最高不超过2000倍，如果想要看到更小的物体，它就无能为力了。

从20世纪30年代开始，人们利用工业技术的发展，成功地研制了电子显微镜，它的出现，使人们能在超微结构或原子的尺度上观察研究物体的结构，人们的观察从宏观世界进入了超微结构或原子级的微观世界。

与许多伟大的发明一样，电子显微镜的发明，也经历了那个时代艰苦的历程。在光学显微镜发明长达300年的时间里，由于光波波长的限制，直接限制了光学显微镜的分辨能力，始终难以突破1000倍的放大倍数。寻找更短波长的光源成为了科学家们呕心沥血的漫长征程。

1924年，法国物理学家Broglie提出了“电子与光一样，具有波动性“的假说，他证明了任何一种粒子在快速运动时，必定都伴有电磁辐射，辐射的电磁波长与粒子的运动速度成反比，并计算出电磁波长为0.005nm。

1926年，德国科学家Busch发现了带电粒子在电场或磁场中偏转聚焦的现象，类似于光线通过透镜可被聚焦一样。由此奠定了电子显微镜的理论基础。

1928—1931年间，德国年轻的大学生Ruska测量了磁透镜的聚焦特性，并开展了电子放大成像的研究，终于在1938年成功研制了世界上第一台真正的电子显微镜，放大倍数为1200倍，被誉为电子显微镜之父,并在1986年获得诺贝尔奖。电子显微镜的发明被誉为20世纪最重要的发明之一。

1939年，德国Siemens公司生产了第一台作为商品用的透射电镜，分辨率为10nm 左右。但其体积庞大，无法进一步推广。

20世纪50年代初到60年代末期，电镜发展很快，从性能到构造都得到很大的改进，特别是分辨本领得到大幅度提高，达到1nm左右，到80年代的分辨率已接近0.1nm，最新研制的超高压透射电镜的分辨率可达0.005nm。

自从1938年第一台电镜在德国问世以来，在短短的几十年时间里，电镜技术取得了飞跃的发展，在医学、生物学、材料学、地质学、考古学、天文学等许多领域中得到了广泛的应用。在现代医学、细胞超微结构、分子生物学、基因组学等学科的迅速发展，出现了更适合生物医学研究的新型电镜。

在生命科学方面，电镜的应用为阐明组织细胞的结构和功能起了巨大的作用，已成为医学科学研究和临床疾病诊断的重要工具。

随着科学技术的不断发展，电镜样品制备技术也得到飞速发展。在透射电镜超薄切片基础上，又相继出现负染色技术、电镜放射自显影技术、免疫和细胞化学技术、电镜核酸原位杂交技术等；在扫描电镜常规技术基础上，也出现了冷冻割断技术、蚀刻复型技术、管道铸型技术、电子探针技术等。

在透射电镜原有的基础上安装各种测试仪器如能谱仪（EDX）、波谱仪（WDX）等，出现了各种分析型透射电镜；还有加速电压在200kV以上的高压电子显微镜以及加速电压在500Kv以上的超高压电子显微镜；由于压电传感器的发明，使得机械探针的定位性增强，出现了扫描探针显微镜系列（包括扫描隧道显微镜、原子力显微镜、激光扫描共聚焦显微镜、扫描光子显微镜、扫描热显微镜、静电力显微镜等十几种

类型），其中在生命科学中应用较多的是扫描隧道显微镜、原子力显微镜和激光扫描

共聚焦显微镜。

第一章透射电子显微镜

一、与透射电镜有关的几个基本概念

1、光的衍射现象：

由于光具有波动性，当光线通过小孔或小

孔光源经光学系统成象会产生衍射。其图案是:

中央部分一个亮斑，在其周围有明暗交替的园

环，即埃里（Airy）圆盘,其中心亮斑的能量大

约占入射光源能量的84%（如图所示）。

2、瑞利准则

光线通过二个比较靠近的小孔时，这二个小孔的衍射图会重叠在一起。当一个

衍射图的中央亮斑正好落在另一个衍射图的第一暗环中心时，这二个点刚可以分

辩。这就是显微镜分辩本领的瑞利准则。

3、分辨率

分辨率又称分辨本领，它表示仪器的分辨能力足以清楚分开的两点或两个质点

圆心间最小距离的本领。它与光的性质，即衍射、干涉及透镜像差有关。

可以这么说，显微镜分辩本领是由其产生的衍射图中央亮斑半径D（分辨能力）

的大小而定：

光学显微镜的分辨力可以根据阿贝公式来计算，即

D =

瑞利准则图示

这里以油镜为例推算其分辨本领：

光的平均波长为λ=500n m=0.5μm

油的介质折射率或系数N=1.5

物体与物镜所形成夹角的半数α<90º

则中央亮斑的半径D≈200n m=0.2μm

一般人眼在明视距离250mm处能分辨0.2mm的两点，油镜最小能分辨0.2μm的

两点，则油镜理论最大放大能力为：0.2mm/0.2μm = 103

4、电磁波长

真空中相对集中并高速运动着的电子流称为电子束。电子束具有粒子性和波动

性，它能产生一定波长的电磁波，其所产生电磁波长由下列公式表示，即：

λ= n m

其中λ为电磁波长，V为加速电压。

由此可见，电子束的波长完全取决于加速电压，加速电压越高，则得到的电子

波长越短，得到的分辨本领也就越高。

假如一台电镜的V = 50kV 时，则λ≈ 0.005nm= 0.000005μm是光的λ=500nm

的10万分之一，大大减少了衍射光斑D的值。又假如一台电镜的点分辨率为0.1nm,那么其理论放大倍数为0.2mm/0.1nm = 2x106 ，而实际有效放大倍数为1.6x106。

我室的H-7500型透射电镜的点分辨率为0.24nm，则其理论放大倍数为

0.2mm/0.24nm = 0.83x106，而实际有效放大倍数只有 0.6x106。

电镜的分辨率除了受电子束加速电压高低的影响外，还受很多方面的影响，如电镜本身部件的加工精度（各种透镜尤其是物镜的质量精度）、电镜的工作状态（如加速电压、真空度、电镜的运行模式等）、电镜室内及周边情况（如湿度、温度、电镜台的抗震动能力、电磁干扰等）以及样品制作的质量问题（如标本的固定情况、切片厚度、染色反差情况）等。也就是说，一台分辨力为0.1nm的电镜并不能就看清楚0.1nm大小的结构，可能只看清楚0.2nm大小的结构。由此可见，电镜的理论放大倍数与实际有效放大倍数还是有一定的差距的。

5、电镜的像差和畸变

电镜和光镜一样，由于光源或透镜的缺陷，可以发生各种像差或畸变。

①球差：电子束光源通过透镜受到偏转，通过样品，从物平面向下发射，形成物点孔径角。从物点发出的射线，到达下一级透镜又被聚集。如果透镜有缺陷或孔径角太大，则靠近光轴的射线和远离光轴的射线，受到电磁场的作用就会不同，这些射线在光轴上会聚的位置不同，结果远离光轴的射线就会在像面上形成一个最小模糊圈。此时可有图象中央凸起感。这是目前影响电镜分辨率的一个主要因素。

②像散：由于透镜的磁场强度在纵向或横向上不同，以致纵向与横向上的射线。聚焦于光轴的位置也有上有下，两者共同形成一个最小模糊像。

③色差：由于电磁波长随加速电压而变化，当加速电压不稳定时，电子束波长就可变异，因而发生类似的像差。

④畸变：由于离轴较远处的径向磁场的作用力强，使放大倍数随物点离轴的距离而变化，进而使图象发生改变而产生的。畸变常见的有枕形畸变、桶形畸变和S 形畸变等，如下图所示：

6、反差

人的眼睛在区分物体时，主要根据物体不同部位或物体之间的光强度与波长的差别，这些差别构成了物体的反衬度，又称为“反差”。电镜与光镜一样也存在反差现象。

由于电镜标本上的不同部位的物质结构不同，疏密度不同，它们散射电子的能力也各不相同，结果使透过样品的电子束发生疏密差别。散射电子能力强的地方，透过电子数目少，因而，荧光屏上所激发的荧光就弱，显现为暗像；相反，散射能