狂犬病病毒BD-06株基质蛋白的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

狂犬病病毒BD-06株基质蛋白的原核表达、纯化及其多克隆

抗体的制备

赵雪超;张学炜;张守峰;刘晔;米立娟;扈荣良

【摘要】本研究旨在获得抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为进一步研究M蛋白功能提供材料.本试验以狂犬病病毒BD06毒株为模板克隆M基因序列,将其克

隆至原核表达载体pET28a；经酶切和测序鉴定,M蛋白基因序列已正确插入表达载体pET28a；以表达载体pET28a-M转化E.coli Rosetta株,并以0.5 mmol/L IPTG诱导,结果表达出27 ku左右的M蛋白；将诱导表达的蛋白质回收纯化,以纯化的M蛋白多次免疫兔子制备多克隆抗体；Western blotting分析和间接免疫荧光分析结果表明,制得的抗体与病毒能够反应,运用制得的多克隆抗体定位了基质蛋白在感染狂犬病病毒的BHK-21细胞中的位置.结果表明成功制得了抗狂犬病病毒M蛋白的多克隆抗体,为研究狂犬病病毒M蛋白功能奠定了基础.%The objective of this study was to obtain polyclonal antibody against the matrix protein of rabies virus in order to provide materials for further study on the function of matrix protein. The full sequence of the matrix protein gene from the BD-06 strain rabies virus was successfully cloned and inserted into the expression vector pET28a. The results of restriction enzyme digesting and sequencing proved that the matrix protein gene was correctly inserted into pET28a. After the expression plasmid was transformed into E. coli Rosetta and induced by 0. 5 mmol/L IPTG, 27 ku M protein was obtained. After the matrix protein was purified and vaccinated the rabbit, the polyclonal antibody was obtained. The results of Western blotting and IFA showed that the antibody could react with the rabies virus.

The matrix protein in the BHK-21 cell affected by BD-06 strain rabies virus was positioned by using the polyclonal antibody. The results indicated that the polyclonal antibody against the matrix protein of rabies virus was successfully prepared, which laid a foundation for further study on matrix protein of rabies virus.

【期刊名称】《中国畜牧兽医》

【年(卷),期】2013(040)004

【总页数】4页(P36-39)

【关键词】狂犬病病毒;M蛋白;原核表达;多克隆抗体

【作者】赵雪超;张学炜;张守峰;刘晔;米立娟;扈荣良

【作者单位】天津农学院动物科学系,天津300384;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春 130122;天津农学院动物科学系,天津300384;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春 130122;军事医学科学院军事兽医研究所,吉林长春 130122

【正文语种】中文

【中图分类】Q78

狂犬病病毒的外壳包含2种主要的病毒蛋白，一个是跨膜糖蛋白，一个是基质蛋白，还有一些来源于宿主的少量组分，如CD44和CD99相关的糖蛋白（VAP 21）（Kawai，1977）。M 蛋白是狂犬病病毒最小的结构蛋白，由202个氨基酸组成，

占病毒总蛋白质的11%，为狂犬病病毒5种结构蛋白中变异较大的蛋白质之一（Satoshi等，2003）。M蛋白是一种小的非糖基化的病毒固有蛋白质，存在于

病毒外壳的脂双层下面，以某种方式连接着糖蛋白和RNP。尽管M蛋白是病毒外壳的一种主要组成部分，对M蛋白的详细研究尚未像糖蛋白一样经常报道。因此，它的特性和功能一直以来知之甚少（Wunner等，1988）。近年来，狂犬病病毒

的功能又有了新的发现：Finke等（2003a，2003b）发现狂犬病病毒M蛋白能

够调控病毒的复制和转录；Larrous等（2010）发现其能够刺激宿主细胞的半胱

天冬酶引起宿主细胞凋亡；此外，狂犬病病毒M蛋白还决定着病毒的致病性，与

适应不同的宿主有关（Finke等，2010；Faber等，2004；Pulmanausahakul 等，2008）。所以，研究M蛋白对于更全面认识狂犬病病毒就显得非常必要。

相比单克隆抗体的制备，多克隆抗体有许多抗原作用位点，不会像单克隆抗体那样只有一个抗原作用位点，出现只与某几个基因型的狂犬病病毒反应的现象；且多克隆抗体也较单克隆抗体容易制备。本试验以原核表达的BD－06株狂犬病病毒的

M蛋白为免疫原，免疫日本大耳白兔，多次免疫后，采血，制备了抗狂犬病病毒

M蛋白的多克隆抗体，与狂犬病病毒能够很好的反应，定位了基质蛋白在感染狂

犬病病毒的BHK－21细胞中的位置，为研究狂犬病病毒M蛋白的结构和功能奠

定了基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒、菌株、毒株及试验动物BHK－21细胞、T载体、质粒pET28a、大肠杆菌DH5α、原核表达宿主菌Rosetta株及狂犬病病毒弱毒SRV9均由军事

医学科学院军事兽医研究所流行病学与病毒学技术实验室保存。狂犬病病毒BD－06株由军事医学科学院军事兽医研究所流行病学与病毒学技术实验室分离并保存。日本大耳白兔购于长春生物制品研究所实验动物中心。

1.2 主要试剂 HRP标记的羊抗鼠二抗、FITC标记的羊抗鼠二抗、弗氏完全佐剂与