离心技术与细胞器分离
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2.3M sucroseCSK buffer: 100mM KCl, 3mM MgCl2, 1mM EGTA(PH8.0), 10mM PIPES(PH6.8), 2.3M sucrose.
实验结果记录
细胞核 叶绿体
ห้องสมุดไป่ตู้
分析性 分析性超速离心机
台式（或地 面式）普通 离心机
台式高、超 速离心机 0.6-10万转/ 分以上
大容量冰 冻离心机
小于0.6万 转/分
高速冰冻 离心机
0.6-2.5万
超速冰冻 离心机
2.5-8万或 更高
离心机的结构
• 离心机的主要部件为转头、主轴、电动机 和传动装置、制动器、外壳和机座。
• 离心机的转头主要有：角度转头（angle-headed rotors）、甩平式水平转头（swing-out rotors）/ 吊桶式转头（swinging bucket rotors）
• 10. 3200g离心32分钟，溶液梯度层重新分布。
• 11.分别吸取一些各层的溶液进行改良品红苯酚染色、镜检 。观察不同大小不同密度的细胞器的分布情况以及他们的 形态特征。
试剂
K．匀H浆2PbOuf4f,e0r.：3M5m山M梨M醇E,S0,.36.M8m甘M露C醇aC, 0l2.,41％1mPVMP-30
• 2．量取10ml 匀浆buffer，先向研钵中倒入5ml后开 始研磨。
• 3．四层纱布过滤，收集过滤液到10ml离心管中， 再将剩下的5ml匀浆buffer 冲洗研钵后也过滤到管 中，5000rpm离心5分钟, 去上清。
• 4．加入 0.5% TritonX-100 2.5ml, 混匀，振荡后静 置3分钟. 5000rpm离心5分钟，去上清。
离心技术与细胞器的分离
一 实验目的
1、以分离叶绿体、细胞核为例,掌握离心机的操作 技术及两种不同的离心方法：差速离心法、密度梯 度离心法;
2、光镜鉴定各种细胞器的提取情况及了解叶绿体、 细胞核的形态。
二 实验原理
• 离心技术（centrifugal technique）是根据 颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向 外的力这一原理而发展起来的一种分离技 术。
水平转头
角度转头
离心技术类型
• 常用离心技术一般包括： • 差速离心法（differential velocity
centrifugation） • 密度梯度离心法(density gradient
centrifugation)。
差速离心法 （differential velocity centrifugation）
CSK buffer: 100mM KCl, 3mM MgCl2, 1mM EGTA(PH8.0), 10mM PIPES(PH6.8), 300mM sucrose. 60%percoll CSK buffer ： 60%percoll, 100mM KCl, 3mM MgCl2, 1mM EGTA(PH8.0), 10mM PIPES(PH6.8), 300mM sucrose.
•
Fc= mω2r
• 其中ω是旋转角速度，以弧度/秒为单位；r 是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位； m是质量，以g为单位。
相对离心力（relative centrifugal force，RCF）
• 又称相对离心加速度，是指离心力相当于 重力加速度的倍数。在文献中常用“相对 离心力”或“数字×g”表示。
• 采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替 进行离心，使沉降系数不同的颗粒在不同 的分离速度及不同的离心时间下分批分离 的方法，称为差速离心法。
• 常用于从组织匀浆中分离各种细胞器。
The preparative ultracentrifuge
Figure 8-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
差速离心法 （differential velocity centrifugation）
密度梯度离心
• 原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力 场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或 向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相 等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长 时间，它们再也不移动了，形成一系列密度区。 从而使不同浮力密度的物质得到分离。
• 7. 把含有2.3M蔗糖的CSK buffer 3ml加至于离心管底部.
• 8. 再把3ml 60%percoll CSK buffer 轻轻的平铺于7的溶液上 方, 用移液枪加时一定要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一 溶液之上. 这时应该能观察到溶液明显的分层现象.
• 9. 然后把6中过滤溶液轻轻的平铺于8的溶液上方。观察分 层现象。
• RCF= (mω2r )/(mg)=1.119×10-5 n2r
式中r为离心转子的半径距离，指离心管的 重心至转轴中心间的距离，以cm为单位；g 为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转 子每分钟的转数（rpm）。
离心力的转换列线图
离心机的基本分类
离心机
概述
制备性 普通离心机 冰冻离心机
• 5．加入1ml CSK buffer 振荡混匀,可以用枪头轻轻 吹打沉淀使其溶解.
• 6．滤膜过滤（300目）, 去掉未裂解的原生质体及裂解的细 胞膜内溶物等大块杂质，收集过滤液。
以上步骤所提到的细胞核不纯,其中混杂有原生质体、线粒 体、叶绿体, 下面采用蔗糖密度梯度离心分离细胞核和叶绿 体。
• 等密度梯度离心一般常用CsCl、RuCl、蔗糖、甘 油等做介质。
• 此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较 大时。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。
Density gradient centrifugation
Density gradient centrifugation
实验步骤
• 1．将材料用蒸馏水洗净。用滤纸吸干水后,去叶脉, 称取2克叶片,用剪刀剪碎后放入研钵。
• 离心力（centrifugal force，Fc） • 相对离心力（relative centrifugal force，
RCF）
离心力（centrifugal force，Fc）
• 离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运 动时受到的一个向外的力。
• 离心力（Fc）的大小取决于角速度与旋转 半径，即：
实验结果记录
细胞核 叶绿体
ห้องสมุดไป่ตู้
分析性 分析性超速离心机
台式（或地 面式）普通 离心机
台式高、超 速离心机 0.6-10万转/ 分以上
大容量冰 冻离心机
小于0.6万 转/分
高速冰冻 离心机
0.6-2.5万
超速冰冻 离心机
2.5-8万或 更高
离心机的结构
• 离心机的主要部件为转头、主轴、电动机 和传动装置、制动器、外壳和机座。
• 离心机的转头主要有：角度转头（angle-headed rotors）、甩平式水平转头（swing-out rotors）/ 吊桶式转头（swinging bucket rotors）
• 10. 3200g离心32分钟，溶液梯度层重新分布。
• 11.分别吸取一些各层的溶液进行改良品红苯酚染色、镜检 。观察不同大小不同密度的细胞器的分布情况以及他们的 形态特征。
试剂
K．匀H浆2PbOuf4f,e0r.：3M5m山M梨M醇E,S0,.36.M8m甘M露C醇aC, 0l2.,41％1mPVMP-30
• 2．量取10ml 匀浆buffer，先向研钵中倒入5ml后开 始研磨。
• 3．四层纱布过滤，收集过滤液到10ml离心管中， 再将剩下的5ml匀浆buffer 冲洗研钵后也过滤到管 中，5000rpm离心5分钟, 去上清。
• 4．加入 0.5% TritonX-100 2.5ml, 混匀，振荡后静 置3分钟. 5000rpm离心5分钟，去上清。
离心技术与细胞器的分离
一 实验目的
1、以分离叶绿体、细胞核为例,掌握离心机的操作 技术及两种不同的离心方法：差速离心法、密度梯 度离心法;
2、光镜鉴定各种细胞器的提取情况及了解叶绿体、 细胞核的形态。
二 实验原理
• 离心技术（centrifugal technique）是根据 颗粒在作匀速圆周运动时都会受到一个向 外的力这一原理而发展起来的一种分离技 术。
水平转头
角度转头
离心技术类型
• 常用离心技术一般包括： • 差速离心法（differential velocity
centrifugation） • 密度梯度离心法(density gradient
centrifugation)。
差速离心法 （differential velocity centrifugation）
CSK buffer: 100mM KCl, 3mM MgCl2, 1mM EGTA(PH8.0), 10mM PIPES(PH6.8), 300mM sucrose. 60%percoll CSK buffer ： 60%percoll, 100mM KCl, 3mM MgCl2, 1mM EGTA(PH8.0), 10mM PIPES(PH6.8), 300mM sucrose.
•
Fc= mω2r
• 其中ω是旋转角速度，以弧度/秒为单位；r 是颗粒离开旋转中心的距离，以cm为单位； m是质量，以g为单位。
相对离心力（relative centrifugal force，RCF）
• 又称相对离心加速度，是指离心力相当于 重力加速度的倍数。在文献中常用“相对 离心力”或“数字×g”表示。
• 采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替 进行离心，使沉降系数不同的颗粒在不同 的分离速度及不同的离心时间下分批分离 的方法，称为差速离心法。
• 常用于从组织匀浆中分离各种细胞器。
The preparative ultracentrifuge
Figure 8-9 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
差速离心法 （differential velocity centrifugation）
密度梯度离心
• 原理：当不同颗粒存在浮力密度差时，在离心力 场下，在密度梯度介质中，颗粒或向下沉降，或 向上浮起，一直移动到与它们各自的密度恰好相 等的位置，在这里颗粒没有重量，不管离心多长 时间，它们再也不移动了，形成一系列密度区。 从而使不同浮力密度的物质得到分离。
• 7. 把含有2.3M蔗糖的CSK buffer 3ml加至于离心管底部.
• 8. 再把3ml 60%percoll CSK buffer 轻轻的平铺于7的溶液上 方, 用移液枪加时一定要小心顺着管壁把一溶液平铺于另一 溶液之上. 这时应该能观察到溶液明显的分层现象.
• 9. 然后把6中过滤溶液轻轻的平铺于8的溶液上方。观察分 层现象。
• RCF= (mω2r )/(mg)=1.119×10-5 n2r
式中r为离心转子的半径距离，指离心管的 重心至转轴中心间的距离，以cm为单位；g 为地球重力加速度（980cm/sec2）；n为转 子每分钟的转数（rpm）。
离心力的转换列线图
离心机的基本分类
离心机
概述
制备性 普通离心机 冰冻离心机
• 5．加入1ml CSK buffer 振荡混匀,可以用枪头轻轻 吹打沉淀使其溶解.
• 6．滤膜过滤（300目）, 去掉未裂解的原生质体及裂解的细 胞膜内溶物等大块杂质，收集过滤液。
以上步骤所提到的细胞核不纯,其中混杂有原生质体、线粒 体、叶绿体, 下面采用蔗糖密度梯度离心分离细胞核和叶绿 体。
• 等密度梯度离心一般常用CsCl、RuCl、蔗糖、甘 油等做介质。
• 此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较 大时。常用来分离提取核酸、亚细胞器和质粒。
Density gradient centrifugation
Density gradient centrifugation
实验步骤
• 1．将材料用蒸馏水洗净。用滤纸吸干水后,去叶脉, 称取2克叶片,用剪刀剪碎后放入研钵。
• 离心力（centrifugal force，Fc） • 相对离心力（relative centrifugal force，
RCF）
离心力（centrifugal force，Fc）
• 离心力是颗粒在一定角度速度下作圆周运 动时受到的一个向外的力。
• 离心力（Fc）的大小取决于角速度与旋转 半径，即：