蛋白质的修饰和表达

第一节 蛋白质修饰的化学途径
★ 2. 单一的或限制性取代
特异性的C 末端取代是另一类反应：
通常在水溶液中，由蛋白水解酶所催化的反应以压倒的优势 向水解方向进行。因为①在反应基质中水分子具有高活性；② 在相当宽的pH值范围内，新释放出的氨基和羧基具有解离倾向 。如果要使式(3-3)或式(3-4)的反应逆向进行，通常要耗费大量 的能量去抑制这些荷电的倾向。如果所生成的产物沉淀，根据 质量作用的原则将推动此反应向着合成方向进行。但当产物是 大分子时，产物与底物之间在溶解度上的差异很小，利用某些 巧妙的生物学上特异亲和过程来捕捉回收产物的研究甚少。
4. 嵌合蛋白质—通过酶连接反应形成肽键
5. 通过非肽键形成嵌合蛋白质
第一节 蛋白质修饰的化学途径
虽然基因重组表达技术的应用对蛋白质结构功能的研究以 及蛋白质分子的改造提供了一条非常有效的途径，然而用化 学方法直接对蛋白质分子进行修饰有时仍然是很有用的方法 ，可以弥补正常生物表达体系的不足。例如，利用化学法和 酶法相结合，可以从猪胰岛素制备人胰岛素；通过区段特异 性取代制备适合于肿瘤定位的抗体；对用重组方法得到的多 肽进行C末端酰化以及制备各种类型的蛋白质嵌合体等。因 此化学法和重组方法的相互补充，使蛋白质工程的实施更有 效。 蛋白质工程的化学方法通常是产生半合成的结构，在此结 构中一个天然的多肽与一个人造（或化学修饰）的多肽相缔 合。产生这种缔合的方法主要有4种：①非共价缔合、②产 生二硫键、③形成肽键以及④产生非天然型的共价键连接。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
★ 2. 单一的或限制性取代
用化学方法对蛋白质分子上单一的特定功能基团（如α-氨基） 进行修饰而不对与其相类似的基团（如ε-氨基）产生作用是一 件很困难的事。少数的化学试剂，如α-异硫氰酸苯酯在严格控 制的条件下可对α-氨基进行相当特异性的修饰，而不作用于ε-氨 基。由于酶蛋白可以将两个极相似的基团区分开来，所以可利 用酶蛋白的这一特异性对蛋白质分子的功能基团进行特异性修 饰。 在天然状态下，蛋白水解酶是催化肽键的水解，其作用机制是 酶的活性位点首先被一羧基酯化（此羧基来自于被切开的肽键 ），所产生的酰化-酶中间体随之通过水分子的亲核攻击而分解 ：
★1. 多位点取代
※(2)亚氨代乙酰基
绝大多数氨基取代反应至今尚无可靠方法将α-氨基和ε-氨基区 分，但亚氨代乙酰化反应是一特例，尽管对α-氨基和ε-氨基的 区分尚不完美。当ε-氨基几乎完全被亚氨代乙酰基取代时，α氨基在很大程度上可不被修饰。被亚氨代乙酰基取代的氨基仍 可解离。完全亚氨代乙酰化的蛋白质仍保持其在水溶液中的可 溶性，其性质与修饰前一样或相近，因此通常在修饰后这一基 团可不必从蛋白质分子上去除。只有在处于与蛋白质活性相关 的赖氨酸残基的侧链被修饰后，导致蛋白质活性丧失。 然而，亚氨代乙酰化反应在较低pH值下可形成烷基亚胺， N-烷基亚胺可进一步与赖氨酸侧链产生交联，从而影响被修饰 蛋白质的活性。因此，在对ε-氨基进行修饰时，要适当地控制 反应条件，使反应向着形成Nε-乙酰亚胺化的反应进行。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
■ 一、功能基团的特异性修饰
在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条 件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特 别容易产生有用的取代。因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质 分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修 饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。 对于氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有 差别，但在化学上很难将肽链的α-氨基或α-羧基基团与侧链上的 氨基或羧基相区别。 很多在临床上重要的肽其C末端是被酰化的。但当用重组的方 法得到这些产物时，其C末端是自由羧基。在自然界能进行这种 酰化作用的氧化酶体系很难实用化。寻找一种有效的方法，使C 末端的谷氨酸和天冬氨酸酰胺化，而不作用于处在肽链中的谷 氨酸和天冬氨酸仍是努力的方向。
★1. 多位点取代
※(3)其他的侧链取代
羧基的甲基酯化一般可以在室温下将蛋白质加入到含有乙酰 氯的无水甲醇中来完成。由于反应产生盐酸，需将反应物及时 地稀释到冰水中，小心地用碱中和盐酸以使多肽或小分子蛋白 质活力得以保持。 半胱氨酸出现在蛋白质分子中的概率比其他氨基酸要小。相 对于其他功能基团而言，巯基有着十分不同类型的化学反应， 因此半胱氨酸残基是一个很好的靶位，利用这一靶位可以将少 数的取代基团引入到蛋白质分子的确定位置。当一对半胱氨酸 通过二硫键相连时，通常可加入二硫苏糖醇之类的还原剂或通 过磺酸氧化将其打开。用磺酸氧化的方法往往比简单还原的方 法要好，因为磺酸氧化形成的半胱氨酸的磺酸化残基对氧化作 用很稳定，而且可以通过巯基将其还原成自由琉基。
蛋白质的修饰和表达
第九讲 蛋白质的修饰和表达
一、功能基团的特异性修饰 1. 多位点取代
第一节 23蛋.. 白单次一级质的取修限代饰制性取代
的化学途径
第二节 蛋白质改造
的分子生物学途径
二、基于蛋白质片段的嵌合修饰
1. 嵌合第蛋三白质节—非重共价组缔蛋合白系统质
2. 3.
二嵌硫合的键蛋表与 白嵌质达—合通蛋过白化质学的激形活成形成肽键
第一节 蛋白质修饰的化学途径
★ 2. 单一的或限制性取代
按照同样的机制，上面这个水解反应可以逆向进行，这样在 蛋白水解酶的存在下肽键可以重新形成，即一个肽的氨基（ 或其他非肽的亲核物）攻击酰化-酶中间体，从而导致肽键的 形成。这一逆反应（肽连接）的成立无论在科学理论上还是 在实际应用上都具有重要的意义。因为在常规肽合成中对氨 基酸侧链进行保护的操作可以省去，以这种可逆方式进行的 酶连接反应至少可以达到每年100kg的生产规模。
第一节 蛋白质修饰的化学途径
■ 一、功能基团的特异Baidu Nhomakorabea修饰
★1. 多位点取代 ※(1)常规的氨基保护
氨 基 可 用 取 代 基 进 行 修 饰 。 常 用 的 取 代 基 有 两 种 ： tbutyloxy-carbonyl (Boc) 是 典 型 的 酸 不 稳 定 取 代 基 ， 而 Methanesulphonyl ethyloxy carbonyl (Msc)是典型的碱不稳 定取代基。这两种基团常用于对氨基进行临时保护，以防 止其他反应试剂对氨基的作用。当其他反应完成后，可分 别用无水三氟乙酸和强碱将Boc和Msc基团去除，很多多肽 或小分子蛋白质在这些基团去除后仍保持其活性。