小鼠睾丸细胞染色体的制备与观察

小鼠睾丸细胞染色体的制备与观察

一、实验目的

1、了解快速制备动物染色体的方法，掌握小鼠睾丸细胞染色体的制备方法；

2、观察小鼠睾丸染色体的数目及其形态特征；

3、掌握小鼠睾丸染色体标本制备基本过程，了解操作步骤的原理。

二、实验原理

染色体是基因的载体。真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传指标之一。制备染色体标本无疑是细胞学最基本的技术之一，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。

染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体（由于分裂旺盛）。本实验采用的方法是从小鼠的睾丸细胞中获取。在小鼠睾丸中，细胞有丝分裂和减数分裂比较旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到分裂中期细胞。通过小鼠睾丸得到染色体比较简便，一般不需要无菌操作。用秋水仙素作为有丝分裂的抑制剂。

染色体的形态结构在细胞增殖周期中是不断地运动变化的，一般在有丝分裂中期，染色体的形态最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标本获取的是中期细胞。通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。

用适量的秋水仙素溶液注入动物腹腔内，可以阻止分裂细胞纺锤丝的形成，从而积累大量处于分裂中期的细胞。利用上述原理，通过常规的制片方法，观察小鼠睾丸细胞的染色体。

三、实验用品

解剖盘解剖剪镊子 10ml刻度的离心管离心机载玻片盖玻片显微镜小鼠秋水仙素 0.3% KCl 固定液（甲醇：冰醋酸=3：1） Giemsa染液 0.9%生理盐水

四、实验步骤

（一）标本的制备

1、取雄性小鼠以每克体重4μｇ注射秋水仙素，经14～16小时后，断头法

杀死小鼠，取出睾丸用生理盐水（0.9%的NaCl）洗去血污。

2、放入装有1ml 0.3%KCl液的小烧杯中剪碎至呈乳白色。

3、用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl液至4ml。37℃静置30分钟，

进行低渗处理。以800～1000转/分离心8分钟。

4、弃上清液，加入2ml甲醇·冰醋酸固定液（3：1），并用吸管至管底吹气，

轻轻打散细胞，固定8分钟。

再以800～1000转/分离心8分钟。

5、弃上清液，加1ml固定液，再制成细胞悬液，固定5分钟。

6、取洁净的低温预冷载片，距载片10～15cm高度滴下2～3滴细胞悬液，

从载片一边向另一边轻轻吹气，并同时轻轻敲打载片，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。

7、将玻片竖直放置于玻片盒中

一周后

（二）标本的染色与观察

1、用 Giemsa染色20 ～ 30分钟，采用倒置染色法：在玻璃板上用废旧玻

片做支架，使标本玻片的标本面朝下放置到支架上，在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液。

2、细水冲洗玻片背面，去多余染液，气干。

3、镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观

察染色体形态并计数。

五、实验结果

显微镜下（共有20个染色体）

所观察的细胞处于同一时期（分裂中期），即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样，小鼠染色体呈U形或V形在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在。

染色体数目减半，推测是减数第二次分裂中期的细胞。

六、讨论与结论

1、离心务必要控制在800-1000r/min，过大会使细胞涨破，导致实验失败，时间也要控制，过长也会影响观察；

2、滴片时，玻片应是从冰水中取出，利于细胞分散。距离一定高度滴下细胞悬液，并敲打，目的在于使细胞均匀分布和促进染色体展开；

3、采用倒置染色法，目的在于可使载玻片充分接触染液，若有杂质也可沉降至底部，不会和玻片直接接触。

作业：

总结染色体增加或减少的原因

1、滴片后敲打时用力过大，使部分染色体分散到其他区域，造成染色体数目的增加或减少。

2、精巢中存在发生减数分裂的细胞，有可能部分细胞处于减数第二次分裂中期，染色体数目为正常细胞的一半，为20。

3、极少可能，小鼠发生染色体数目变异。