蛋白水解度测定方法
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3.2 丝氨酸标准溶液 将 50mg 丝氨酸(serine)溶解于 500ml 去离子水中。此溶液中 Serine-NH2 约为 0.9516 meqv/L.
3.3 样品溶液
将 Xg 样品溶解于 100ml 去离子水中,X 的值在 0.1~1.0 之间。
如果样品蛋白含量为 80%,则 X 取 0.1g,如果样品蛋白含量为 8%,则 X 取 1.0g。
A2. 将 160mg 邻苯二甲醛(OPA,纯度 97%)溶解于 4ml 无水乙醇中。溶解完全后 将此 OPA 溶液转移至上述 A1 溶液中,并用去离子水冲洗,转移。
A3. 将 176mg 1,4-二巯基苏糖醇(DTT,纯度 99%)加入到 A1 溶液中,去离子水冲 洗,转移。
A4. 用去离子水将 A1 溶液定容至 200ml. 此试剂现配现用。
2. 标准溶液测试
将 400ul 丝氨酸标准溶液加入到一个装有 3mlOPA 试剂的测试管中(时间点 0), 混合均匀(5S)后精确静置 2min 后立即读取 340nm 的吸光值。
在测空白和样品值之前测 2 个标准品,另 2 个标准品在测完空白和样品后再测。标 准品的吸光值取 4 次的平均值。
一般情况下 ODstand.≈0.8
h=
������������������������������������ ������������2−������ ������
meqv/g
protein
各底物的 α 和 β 具体数值见附表。
如果未对底物进行测试,α 和 β 可按 1.00 和 0.40 粗略计算。
5.2 计算 DH
DH= ℎℎ1���−���������ℎ������0*100%
蛋白水解度(DH)测定方法—OPA 法
一、 定义
水解度(DH)是指蛋白质中被水解的肽键占总肽键的百分比。其基本计算公式如下:
被水解的肽键数
h
DH = 蛋白质总肽键数 × 100% = htot × 100%
htot 的值根据不同的底物蛋白会有所不同,h 是用等价 serine NH2 表示的。 ℎ = ������������������������������������ ������������2−������ meqv/g protein
4. 样品测试 将 400ul 样品溶液加入到一个装有 3mlOPA 试剂的测试管中(时间点 0),混合均 匀(5S)后精确静置 2min 后立即读取 340nm 的吸光值。 因为吸光值会随时间变化,所以读取 OD 值的时间必须是同样的(2min)。
五、 计算
5.1 计算 h
Serine
NH2=
������������������������������������������������−������������������������������������������ ������������������������������������������.−������������������������������������������
h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度;
h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。
备注: 大豆、面筋、酪蛋白、乳清、明胶、肉、鱼
OD 值在 0.2~1.2 之间的读数会比较准确,太小或太大精确度都会有影响。因此须注 意丝氨酸标准品浓度和样品中蛋白浓度是否合适。
Reference
P.M. Nielsen, D.Petersen, and C. Dambmann, 2001. Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis. Journal of Food Science Vol.66 NO.5 (642-646)
3. 空白测试 将 400ul 去离子水加入到一个装有 3mlOPA 试剂的测试管中(时间点 0),混合均 匀(5S)后精确静置 2min 后立即读取 340nm 的吸光值。 测 4 次空白取平均值。一般情况下 ODblank≈0.07。 *如果用 5% SDS 溶液取样灭酶,则空白就是 5% SDS 溶液。
AR AR (sigma) (sigma) (sigma)
紫外可见分光光度计(可测 340nm 吸光值) 容量瓶 100ml,200ml,500ml 各数个 10ml 测试管数个
3.1 OPA 试剂
A1. 将 7.620g 硼砂(CAS 1303-96-4)和 200mg 十二烷基硫酸钠(SDS)溶解于 150ml 去离子水中。溶解完全后方可加入其他试剂。
三、 试剂
测试所需试剂及设备如下: 硼砂 (CAS 1303-96-4) 十二烷基硫酸钠(SDS, CAS 151-21-3) 邻苯二甲醛(OPA,CAS 643-79-8,纯度 97%) 1,4-二巯基苏糖醇(DTT,CAS 3483-12-3,纯度 99%) 丝氨酸(serine)标准品 (CAS 302-84-1)
������
更多 α,β,htot 的精确数值请参见备注。 此处的 Βιβλιοθήκη BaiduH 是指样品相对于原始底物的水解度,如果要计算水解反应前后的水解度,需要 使用如下公式:
h1 − h0 DH = htot × 100%
h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度; h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。
二、 原理 OPA(邻苯二甲醛)法测定蛋白质水解度的原理是 OPA 在 β-巯基乙醇的存在下会与自由 α氨基形成黄色化合物,其在 340nm 处有特征吸收,用分光光度计可检测其 OD 值。实际使 用中 1,4 二巯基苏糖醇(DTT)比 β-巯基乙醇更易使用。
*水解实验中可取 100ul 水解样品加入到 900ul,5%(W/W)热的(85℃)SDS 溶
液中,保温 5min 灭酶。样品保存在-18℃以备测试。计算时注意蛋白浓度的变化。
四、 测试步骤
使用分光光度计测试所有样品的 340nm 吸光值,空白对照为去离子水。
1. 加 3ml OPA 试剂到所有的测试管中。 分析一个样品所需的测试管: 标准溶液 4 个 空白 4 个 样品溶液 2×2 个 每个样品须测 2 次,每次需有一个平行样,故需 4 个测试管。
∗
0.9516meqv/L∗0.1∗100
������∗������
������/������������������������������������������������
Serine NH2 X P 0.1
meqv serine NH2/g protein g sample (0.1~1.0g) protein % in sample sample volume in L
3.3 样品溶液
将 Xg 样品溶解于 100ml 去离子水中,X 的值在 0.1~1.0 之间。
如果样品蛋白含量为 80%,则 X 取 0.1g,如果样品蛋白含量为 8%,则 X 取 1.0g。
A2. 将 160mg 邻苯二甲醛(OPA,纯度 97%)溶解于 4ml 无水乙醇中。溶解完全后 将此 OPA 溶液转移至上述 A1 溶液中,并用去离子水冲洗,转移。
A3. 将 176mg 1,4-二巯基苏糖醇(DTT,纯度 99%)加入到 A1 溶液中,去离子水冲 洗,转移。
A4. 用去离子水将 A1 溶液定容至 200ml. 此试剂现配现用。
2. 标准溶液测试
将 400ul 丝氨酸标准溶液加入到一个装有 3mlOPA 试剂的测试管中(时间点 0), 混合均匀(5S)后精确静置 2min 后立即读取 340nm 的吸光值。
在测空白和样品值之前测 2 个标准品,另 2 个标准品在测完空白和样品后再测。标 准品的吸光值取 4 次的平均值。
一般情况下 ODstand.≈0.8
h=
������������������������������������ ������������2−������ ������
meqv/g
protein
各底物的 α 和 β 具体数值见附表。
如果未对底物进行测试,α 和 β 可按 1.00 和 0.40 粗略计算。
5.2 计算 DH
DH= ℎℎ1���−���������ℎ������0*100%
蛋白水解度(DH)测定方法—OPA 法
一、 定义
水解度(DH)是指蛋白质中被水解的肽键占总肽键的百分比。其基本计算公式如下:
被水解的肽键数
h
DH = 蛋白质总肽键数 × 100% = htot × 100%
htot 的值根据不同的底物蛋白会有所不同,h 是用等价 serine NH2 表示的。 ℎ = ������������������������������������ ������������2−������ meqv/g protein
4. 样品测试 将 400ul 样品溶液加入到一个装有 3mlOPA 试剂的测试管中(时间点 0),混合均 匀(5S)后精确静置 2min 后立即读取 340nm 的吸光值。 因为吸光值会随时间变化,所以读取 OD 值的时间必须是同样的(2min)。
五、 计算
5.1 计算 h
Serine
NH2=
������������������������������������������������−������������������������������������������ ������������������������������������������.−������������������������������������������
h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度;
h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。
备注: 大豆、面筋、酪蛋白、乳清、明胶、肉、鱼
OD 值在 0.2~1.2 之间的读数会比较准确,太小或太大精确度都会有影响。因此须注 意丝氨酸标准品浓度和样品中蛋白浓度是否合适。
Reference
P.M. Nielsen, D.Petersen, and C. Dambmann, 2001. Improved Method for Determining Food Protein Degree of Hydrolysis. Journal of Food Science Vol.66 NO.5 (642-646)
3. 空白测试 将 400ul 去离子水加入到一个装有 3mlOPA 试剂的测试管中(时间点 0),混合均 匀(5S)后精确静置 2min 后立即读取 340nm 的吸光值。 测 4 次空白取平均值。一般情况下 ODblank≈0.07。 *如果用 5% SDS 溶液取样灭酶,则空白就是 5% SDS 溶液。
AR AR (sigma) (sigma) (sigma)
紫外可见分光光度计(可测 340nm 吸光值) 容量瓶 100ml,200ml,500ml 各数个 10ml 测试管数个
3.1 OPA 试剂
A1. 将 7.620g 硼砂(CAS 1303-96-4)和 200mg 十二烷基硫酸钠(SDS)溶解于 150ml 去离子水中。溶解完全后方可加入其他试剂。
三、 试剂
测试所需试剂及设备如下: 硼砂 (CAS 1303-96-4) 十二烷基硫酸钠(SDS, CAS 151-21-3) 邻苯二甲醛(OPA,CAS 643-79-8,纯度 97%) 1,4-二巯基苏糖醇(DTT,CAS 3483-12-3,纯度 99%) 丝氨酸(serine)标准品 (CAS 302-84-1)
������
更多 α,β,htot 的精确数值请参见备注。 此处的 Βιβλιοθήκη BaiduH 是指样品相对于原始底物的水解度,如果要计算水解反应前后的水解度,需要 使用如下公式:
h1 − h0 DH = htot × 100%
h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度; h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。
二、 原理 OPA(邻苯二甲醛)法测定蛋白质水解度的原理是 OPA 在 β-巯基乙醇的存在下会与自由 α氨基形成黄色化合物,其在 340nm 处有特征吸收,用分光光度计可检测其 OD 值。实际使 用中 1,4 二巯基苏糖醇(DTT)比 β-巯基乙醇更易使用。
*水解实验中可取 100ul 水解样品加入到 900ul,5%(W/W)热的(85℃)SDS 溶
液中,保温 5min 灭酶。样品保存在-18℃以备测试。计算时注意蛋白浓度的变化。
四、 测试步骤
使用分光光度计测试所有样品的 340nm 吸光值,空白对照为去离子水。
1. 加 3ml OPA 试剂到所有的测试管中。 分析一个样品所需的测试管: 标准溶液 4 个 空白 4 个 样品溶液 2×2 个 每个样品须测 2 次,每次需有一个平行样,故需 4 个测试管。
∗
0.9516meqv/L∗0.1∗100
������∗������
������/������������������������������������������������
Serine NH2 X P 0.1
meqv serine NH2/g protein g sample (0.1~1.0g) protein % in sample sample volume in L