食品有害微生物快速检验方法

食品有害微生物快速检验方法

摘要食品有害微生物检验在食品卫生检验中具有十分重要的作用。综述食品有害微生物快速检验方法，涉及分子生物学技术、抗原抗体免疫检测技术、载体仪器技术、代谢学技术、生物传感器、色谱技术等方面内容，介绍各种检测方法的原理、应用、结果判断等，可为食品有害微生物的准确检测提供参考和指导。

关键词食品；有害微生物；快速检验方法

中图分类号TS207.4 文献标识码A 文章编号1007-5739（2012）14-0284-02目前，食品有害微生物的污染对食品的影响而造成的疾病仍是主要的问题。常规检测准确灵敏，但缺点是操作时间长，检测步骤较繁琐。因此，针对食品中的有害微生物检测，建立快速、准确的检测体系对确保食品安全极其重要，也是当前各国学者研究的重点[1]。随着现代科技的不断发展，以及人们对食品安全、公共卫生的重视，将会逐步完善和建立各种简便、快捷的新型微生物快速检测技术。

1 分子生物学技术

（1）PCR技术。即聚合酶链反应技术，采用体外酶促（耐热DNA聚合酶）反复作用，通过变性—延伸—复性的循环操作，迅速将DNA模板扩增数百万倍，再用凝胶电泳和紫外核酸检测仪观察扩增结果来识别细菌[2]。当前，主要有3种技术应用到微生物检测中[3]：一是嵌套多聚酶链反应技术，产生扩增的DNA片段上含有第2轮PCR引物的结合位点，在此片段上应用第1套引物，片段中第1轮反应产物被等分转入第2轮PCR引物，PCR受微生物的干扰由扩增靶DNA来消除；二是随机扩增多态DNA分析多聚酶链反应技术（RAPD—PCR），即使用任意引物，得到一群长短不一的DNA片段混合物；三是采用一套

由一个特异引物和一个普通引物所组成的引物，或使用一套特异性的引物，结果仅产生一种产物，进而进行检测。

（2）核酸探针法[3]。即以补体核酸分子作为探针，将标记后的探针加入已变性的被检DNA （单链）样品中，在一定条件下可与样品中的互补的DNA区段形成杂交双链，从而可以鉴定样品中DNA。以前在实验室常采用放射性同位素标记探针。而随着科技的发展，基于核糖体RNA（tRNA）发育过程中储存的核酸成分，现在多采用比色计进行标记和检测。新型检测方法使用富含rRNA的标靶序列，不仅保持较高的灵敏度，而且实现无辐射检测[4]。（3）基因芯片技术[5]。采用一块面积很小的玻片、硅片或尼龙膜作为载体，在预定位置固定肽核苷酸、寡核苷酸或cDNA，集成的微点阵列即构成基因芯片[6]。检测原理：靶基因选定为致病菌的共有基因（16 SrDNA、23SrDNA及ERIC），采用一对通用引物扩增，为区分细菌，利用芯片上的探针检测细菌在共有基因上的独特碱基，从而实现检测。

2 抗原抗体免疫检测技术

抗原抗体反应是指抗原与相应抗体所发生的特异性结合反应。体外反应可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等反应类型。具体应用技术如下。

（1）酶联免疫分析法（ELISA）[7]。ELISA基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，其原理是把抗原或抗体在不损坏其免疫活性的条件下预先结合到某种固相载体表面；测定时将受检样品（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体起反应形成抗原或抗体复合物；反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量（免疫复合物）与标本中待检抗体或抗原的量成一定比例，经洗涤去除反应液中其他物质，加入酶反应底物后，底物被固相载体上的酶催化变为有色产物，通过定性或定量分析有色产物量即可确定样品中待测物质含量[8]。

（2）斑点酶联免疫吸附试验。将抗原或抗体吸附在纤维素膜的表面，通过相应抗体或抗原

和酶标记物形成复合物，加入底物后结合物上的酶将底物水解氧化成带色物质，呈现出肉眼可见的颜色斑点。

（3）免疫电泳技术。该技术将凝胶扩散置于直流电场中，让电流加速抗原和抗体的扩散，并规定其运动方向，从而使沉淀反应时间大大缩短，敏感度显著提高。包括火箭电泳试验和对流免疫电泳试验。

（4）单克隆抗体检测技术。利用细胞培养和细胞融合技术制备具有抗原特异性单一的抗体，可辨认抗原物质结构的微细差异，并发生特异性结合，精确地测定抗原物质含量[9]。（5）免疫磁球法。该技术将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检微生物发生特异性结合；该磁球在外加磁场作用下向磁极聚集，从而快速分离出目的微生物。

（6）免疫胶体金技术。以微孔滤膜为载体包被已知抗原或抗体，加人待检标本后，经滤膜的毛细管作用或渗滤作用使标本中的抗原或抗体与膜上包被的抗体或抗原结合，再用胶体金结合物标记而达到检测目的[10]。

（7）免疫转印技术。将凝胶电泳与固相免疫测定结合，将经电泳分区的蛋白质精确近似定量地转移到固相载体上，并保持其原有的生物活性，再经荧光，免疫、酶免疫、放射免疫技术等进行测定，实质上分3步骤即蛋白质组分分离、各组分转印及免疫检测。

3 载体仪器技术

（1）快速测试片法[11]。培养基的载体采用纸膜、纸片，在其上面附着特定的显色物质和某种培养基，根据载体上微生物的生长特性来测定。

（2）滤膜法。将滤膜放入滤器过滤样品，滤膜保留微生物，样品中生长抑制剂可用无菌水冲洗滤器除去，然后将滤膜放在培养基上培养，在滤膜表面上培养出的菌落可计数。（3）旋转平板和激光菌落扫描法。在琼脂培养基表面倒一薄层样品，在平板旋转作用下液体从中心向边缘流动，分布均匀。采用激光菌落计数器计算菌落的数量，利用仪器底部的光

检测仪扫描平板，激光束通过菌落时可降低光强度，从而检测菌落的存在[8-9]。

（4）流式细胞术（FCM）。FCM通常以激光作为发光源照射于样品流上，被荧光染色的细胞产生散射光和激发荧光。荧光信号强度表征微生物细胞核内物质的浓度或细胞膜表面抗原的强度，光散射信号表征细胞的体积。

（5）固相细胞计数法（SPC）。该方法不需要生长相，在单细胞水平快速检测细菌。先将样品过滤，采用荧光标记滤膜上的存留物，由激光扫描设备自动计数。每个荧光点可直观地由通过计算机驱动的流动台连接到ChemScan上的落射荧光显微镜来检测。在短时间内，可根据荧光标记获得有关微生物特性及生理状态的信息[12]。

（6）VITEK-AM S。主要用于药敏试验和微生物鉴定试验中。包括读数、编码、解码、打印过程，有效结合计算机技术和微生物数码鉴定技术，实现全程操作的自动化。

4 代谢学技术

（1）电阻抗技术。微生物在培养过程中会使培养基中的大分子电惰性物质代谢为具有电活性的小分子物质，由此增加培养基的导电性改变其阻抗。检测电阻抗变化，可实现对不同微生物生长、繁殖特性的判定。

（2）微热量计技术。微生物生长为放热过程，获得产热量—时间变化曲线，即可鉴别微生物。产热可采用微热量计测定，通过计算机信号的数字模拟，在界面记录器上绘制产热量—时间的热曲线，再进行对比分析[13]。

（3）放射量技术。该技术在碳水化合物或盐类等底物分子中引入微量14C，微生物生长代谢过程释放14 CO2，采用自动化放射仪Bactec，通过测定14 CO2量来判断微生物数量。（4）接触酶测定技术。由于接触酶与H2O2反应释放氧气的特性，含有酶的纸盘会浮到试管表面。接触酶含量高，纸盘上浮的时间短。大多数嗜冷性细菌型微生物的接触酶呈阳性，而食品中的嗜冷性菌群可利用接触酶反应来估计。