高效液相色谱_蒸发光散射检测法测定肉苁蓉中的甜菜碱

2 结果与讨论
2. 1 色谱条件的选择 甜菜碱具有季铵碱性基团和羧酸酸性基团 , 是 极性较大的两性物质 。实验尝试用酸 、碱以及缓冲 溶液抑制极性 , 采用 C18柱反相色谱分离模式测定
收稿日期 : 2006207228 第一作者 :龚立冬 , 女 ,硕士研究生 , E 2m a il: gong_ld @ s ina. com. cn. 通讯联系人 :曹玉华 ,女 , 教授 , Te l: ( 0510) 85800939, E 2m a il: yuhuacao @ yahoo. com. cn. 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (N o. 20375013) .
2007年 3月 M a rch 2007
色
谱
C h in ese J ou rn a l of C h rom a tog raph y
Vo l. 25 N o. 2 280～281
高效液相色谱 2蒸发光散射检测法测定肉苁蓉中的甜菜碱
龚立冬 , 曹玉华 , 侯建霞
(江南大学化学与材料工程学院 , 江苏 无锡 214122)
参考文献 :
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第 2期
龚立冬 ,等 :高效液相色谱 2蒸发光散射检测法测定肉苁蓉中的甜菜碱
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甜菜碱 ,由于 ELSD 本身检测方法的限制 ,实验选用 甲醇和水作为流动相 , 采用挥发性的 TFA、三乙胺 调节水相的 pH 值 。结果显示 :当流动相的 pH 值从 210到 910,以 015为步长变化时 , 甜菜碱的保留时 间短 ,且不随 pH 值而改变 , 说明加入弱酸 、弱碱或 调节缓冲溶液酸度均不能改善甜菜碱在 C18柱上的 保留行为 。而加入离子对试剂来抑制甜菜碱的极性 又是 ELSD 检测所不允许的 。若用离子交换色谱 柱 ,同样不能避免使用盐溶液 ,因此本实验采用了弱 极性的氨基柱 ,利用挥发性的弱酸作洗脱液分析两 性物质甜菜碱 。 选择不同配比和不同酸度的甲醇 2水作为流动 相进行考察 。在水相中加入不同浓度的 TFA, 当其 体积分数从 0105%变化到 011%时 , 甜菜碱的保留 时间逐渐增大 , 且与样品中相邻峰的分离度增加 。 进一步试验了 011% TFA 水溶液与甲醇的配比 , 考 虑到分离度 、峰形以及分析时间 , 选择 011% TFA 水 溶液与甲醇的体积比为 15∶85。 2. 2 重复性 、线性范围 、回归方程及检出限 取 1 g /L 甜菜碱标准溶液 2μL 进样 ,日间重复 进样 7次 ,保留时间 、峰高和峰面积的相对标准偏差
(RSD )分别为 0172%, 2155%和 2112%,表明该测定 方法是可靠的 。
配制系列浓度的标准溶液进样 , 以甜菜碱的峰 面积 ( Y)的对数为纵坐标 , 甜菜碱的质量 ( X )的对 数为 横 坐 标 绘 制 标 准 曲 线 , 回 归 方 程 为 lgY = 11440 3·lgX + 61866 5, 相关系数 ( r2 )为 01999, 表 明甜菜碱在质量 0125 ～3 μg 范围内有良好的线性 关系 。以 3倍信噪比确定检出限为 011μg。 2. 3 回收率试验 精确称取内蒙产样品约 015 g, 提取 , 在 1 m L 样品中加入 1 g /L 的标样 25μL,测得方法的加样回 收率为 9912%。 2. 4 样品测定 精确称取 4种肉苁蓉样品各约 015 g, 提取 , 测 定 , 3次测定的结果见表 2。标样及样品的 H PLC 2 ELSD 图谱见图 1。
样品 1# 2# 3# 4#
表 1 四个肉苁蓉样品的种属和产地 种
正品肉苁蓉 ( C is ta n che deser ticola Y. C. M a ) 正品肉苁蓉 ( C is ta n che deser ticola Y. C. M a ) 管花肉苁蓉 ( C. tu bu losa ( schen k) R. W igh t) 管花肉苁蓉 ( C. tu bu losa ( schen k) R. W igh t)
样品 1# 2# 3# 4#
表 2 样品中甜菜碱含量的测定结果
测定结果 / (m g / g)
平均值 / (m g / g)
73. 50 73. 94 73. 42
73. 62
57. 85
58. 01 未检出 未检出
57. 63
57. 80 / /
RSD / % 0. 38 0. 34 / /
图 1 ( a )甜菜碱对照品 、( b )内蒙古产肉苁蓉样品 、( c )甘肃产肉苁蓉样品和 ( d )新疆产肉苁蓉样品的 H PL C 2EL SD 图谱
测定结果表明 , 新疆和云南产的管花肉苁蓉中 未检出甜菜碱 ,内蒙和甘肃产正品肉苁蓉中的甜菜 碱含量较为丰富 。目前 , 苯乙醇苷类物质 、甘露醇 、 甜菜碱均被建议作为评价肉苁蓉质量标准的物质 , 但本研究小组的前期工作发现 , 正品肉苁蓉和管花 肉苁蓉中均含有含量相近的苯乙醇苷类物质和甘露 醇 。因此 ,可以是否含有甜菜碱作为鉴别正品肉苁 蓉和管花肉苁蓉的参考依据 。
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摘要 :建立了高效液相色谱 2蒸发光散射检测法测定中药材肉苁蓉中甜菜碱含量的方法 。采用 W a te rs Sp he riso rb S5 N H2色谱柱 ( 250 m m ×416 m m , 5μm ) ,柱温 25 ℃,流动相为 011% (体积分数 )三氟乙酸水溶液 2甲醇 (体积比 为 15∶85) ,流速 016 m L /m in。蒸发光散射检测器参数 :漂移管温度 90 ℃,喷雾器温度 45 ℃,载气 (氮气 )压力 110 kP a ( 16 p s i) 。结果表明 ,该法具有良好的线性关系 , 同时 , 不同种肉苁蓉的测定结果表明 :管花肉苁蓉不含甜菜 碱 ,因此建议将甜菜碱作为标志物质来鉴别正品肉苁蓉 ( C is ta n che dese r ticola Y. C. M a )和管花肉苁蓉 ( C. tu 2 bu losa ( sch en k) R. W igh t) 。 关键词 :高效液相色谱法 (H PLC ) ; 蒸发光散射检测 ( ELSD ) ; 甜菜碱 ( be ta in e ) ; 肉苁蓉 ( H e rba C is ta n che) 中图分类号 : O 658 文献标识码 : B 文章编号 : 100028713 ( 2007) 0220280202 栏目类别 :技术与应用
1 实验部分
1. 1 仪器和试剂 W a te rs 1525 二元泵 ; W a te rs 2420 ELSD; 雾化 载气 : 氮 气 ( 99199%) ; Em p ow e r 色 谱 软 件 。甲 醇 (色谱纯 ) ,水 (重蒸水 ) 。其他试剂为分析纯 。盐酸 甜菜碱标准品 ( ≥99%)购自 S igm a 公司 。肉苁蓉药 材均由洛阳高新开发区陆生天然植物研究所王忠东 教授提供并鉴定 ,其种属及产地见表 1。
肉苁蓉 ( H e rba C is ta n ch e)为列当科肉苁蓉属 多年生高等寄生植物 。始载于《神农本草经 》, 具有 填精补髓 、养血润燥 、悦色延年之功效 [ 1 ] 。中国药 典规定以列当科植物肉苁蓉 ( C is ta n che dese r tico la Y. C. M a )的干燥带鳞片肉质茎入药 [ 2 ] 。肉苁蓉中 的甜菜碱 ( b e ta ine )含量丰富 [ 3 ] ,是它的主要化学成 分之 一 。甜 菜 碱 的 化 学 名 称 是 三 甲 基 氨 基 乙 酸 (C5 H11 NO2 ) ,最早从甜菜中分离得到 , 是一种广泛 分布于动植物组织中的季铵型水溶性生物碱 [ 4 ] , 是 人体唯一可替代叶酸或 S 2腺苷蛋氨酸的甲基供体 。 文献 [ 5 ]报道甜菜碱有许多药理活性 。甜菜碱含量 测定的方法多样 , 文献报道有光谱法 [ 6 ] 、薄层扫描 色谱法 [ 7 ] 、高效液相色谱法 ( H PLC ) [ 8 ] 、酸碱滴定及 重量法 [ 9, 10 ]等 。其中 , H PLC 兼具分离效率高 、分析 结果准确的特点, 已成为甜菜碱测定的首选方 法 [ 11 ] 。由于甜菜碱缺乏生色基团 、极性较大 , 目前 对甜菜碱的测定大多采用柱前衍生 2H PLC 2紫外检 测的方法 [ 12 ] , 虽然灵敏度和选择性有了很大的改 善 ,但是操作较为繁琐 。本实验采用 H PLC 2蒸发光 散射检测器 ( ELSD )对中药肉苁蓉中的甜菜碱进行 了测定 ,方法快速 、简便 ,测定结果令人满意 。
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产地 内蒙古 甘肃 新疆 云南
1. 2 实验方法 1. 2. 1 标准溶液的配制 精确称取盐酸甜菜碱对 照品 01006 6 g,用超纯水定容至 5 m L 容量瓶中 , 得 1 g /L 甜菜碱储备液 。将储备液用重蒸水稀释至所 需浓度作标准溶液 ,待用 。 1. 2. 2 样品溶液的制备 将肉苁蓉药材切成片状 , 置于 60 ℃烘箱中烘 60 m in。将药材粉碎 , 精密称 取肉苁蓉粉末 0150 g左右 , 置于具塞锥形瓶中加入 30 m L 重蒸水 , 微波提取 30 s, 静置 , 取上清液 , 于 0145μm 微孔滤膜过滤得滤液 , 取滤液 2 m L 定容 至 5 m L,备用 。 1. 2. 3 H PLC 2ELSD 分 析 条 件 色 谱 柱 : W a te rs Sp he riso rb S5 N H2 ( 250 m m ×416 m m , 5 μm ) 分 析柱 。柱温 : 25 ℃。流动相 : 011% (体积分数 )三氟 乙酸 ( TFA ) 2甲醇 (体积比为 15 ∶85) , 等度洗脱 , 流 速为 016 m L /m in。 ELSD 参数 :漂移管温度 90 ℃; 喷雾器温度 45 ℃; 氮气压力 110 kP a ( 16 p s i) 。
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