印迹法的基本原理及应用

印迹法的基本原理及应用

印迹法(blotting)即转移电泳，是20世纪70年代发展起来的一种新方法。Southern于1975年建立了检测特异DNA片段的DNA-RNA杂交法，称作Southern印迹法。1977年Alwine等把此方法应用到RNA的

研究方面，称作Nouthern印迹法。1979年Towbin等则把该方法扩展应用到蛋白质分析方面，称作Western印迹法。1982年Reinhart报道的双向蛋白质印迹法，称作Eastern印迹法。目前，有人把Southern，Nouthern，Western 印迹法分别称作DNA印迹法，RNA印迹法和蛋白质印迹法。而每一种印迹法又可以分为斑点印迹法和电泳转移印迹法。前者是将样品直接吸附于固相载体上，而后者则是将样品先经过电泳后在转移到固相载体表面上，其余操作基本相同。由于核酸和蛋白质等大分子物质印迹到固相载体，容易和各种探针发生化学或免疫反应，因而对检测样品(尤其是粗样品)中某些组分的理化性质是有益的。其操作过程所需的试剂量少，灵敏度高，所以应用较为普遍。

印迹法的基本原理

(一)概念

1．探针用化学方法将有识别能力的物质(如抗原、激素、核酸等)和酶(如辣根过氧化物酶)或核素(如3H、35S、32P)，或荧光物质(如异硫氰荧光素、地高辛等)结合成的复合物称作探针。

2．固相载体即用于吸附生命大分子物质的固体材料。这类材料有硝酸纤维素(nitrocellulose，NC)膜，尼龙膜(nylon-membranes，NDM)，重氮苄氧甲基(yloxymethyl，DBM)膜和重氮苄硫醚(diazophenylthiaether，DPT)纸等。最常用的是孔径为0．45／lm的NC膜，因为它成本低廉，结合力强，背景较清晰。而对于检测核酸和酸性蛋白质来说，理想载体是带正电的尼龙膜，它与负电荷物质结合力很强，操作亦简单。但因

为其与负离子型染料也易结合，背景值高，故使用受到一些限制。

3．封阻用一种与待测物不反应的物质(如蛋白质、核酸、吐温20等)封阻载体印迹区域以外的剩余吸附位点，使探针与印迹物反应，且不吸附到载体上，此过程称为封阻，从而使印迹结果背景干净，印迹的斑点或谱带更为清晰。

4．印迹把经过凝胶电泳后的组分，通过吸附或电泳方法转移或者以直接点样方式吸附到固相载体上，此过程称电泳印迹，或称点印迹。

5．放射自显影将含放射性核素的复合物置X线感光胶片上压片，当放射性核素电离辐射时，胶片上会发生化学“感光”作用，随后经显影，定影，即可呈现

出斑点或谱带，此法较灵敏。

(二)原理

生命大分子物质(如核酸或蛋白质)印迹到固相载体上，经淬灭试剂处理后，可与相应的探针(酶标记)反应，接着用适当的溶液漂洗，置含底物的溶液中显色，即可现出谱带。如所用探针为放射性核素标记物时，则应将漂洗后的载体进行放射自显影，即可检测出样品中特异的成分。

印迹法的应用

(一)分析和制备特异成分一般生命大分子如蛋白质等的粗制品经过凝胶电泳后，常常产生许多谱带。但它再经印迹转移程序分析后，就可以从中找出所需的某一特殊成分，而这种特殊成分又可以从相应的凝胶区段回收。用此方法得到的物质纯度较高，纯化步骤也较简单。

(二)检测生命大分子之间的相互作用

不同生命大分子之间的相互作用是经常发生的，特别是在有机体内。因此，建立一种检测生命大分子物质之间相互作用的有效方法一直是人们研究的重要课题。而用印迹法就可以检测出如DNA-RNA、DNA-蛋白质、RNA-蛋白质、酶—底物、糖蛋白—凝集素、激素—受体等物质之间的相互作用，同时也可用此方法寻找各种大分子物质的相应配体

简述Southern Blot杂交的原理、步骤及应用

原理

Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。

步骤

1．琼脂糖电泳

（1）取一定量的待测DNA样品，用适当的限制性内切酶酶切。DNA的量根据样品的种类及实验目的的不同而异，对于克隆片段的限制性内切酶图谱分析，取0.1-0.5μg即可；而对于鉴定基因组DNA中的单拷贝基因序列，则需要10～20μg；当采用寡核苷酸探针或探针的比放射性活性较低时，则需要30～

50μg。

（2）酶切完毕，在琼脂糖凝胶中电泳。

（3）电泳结束后，EB染色，长波紫外线下观察电泳结果及照相。

2．印迹转移

（1）切胶并作标记（左下角切除），以便于定位，然后将凝胶置于一容器中。

（2）将凝胶浸泡于适量的变性液中，室温下放置1h 使之变性，不间断地轻轻摇动。

（3）将凝胶用去离子水漂洗1次，然后浸泡于适量的中和液中30 min，不间断地轻轻摇动。更换中和液，继续浸泡15 min。

（4）将滤纸，硝酸纤维素膜NC膜(以下简称NC膜）剪成与胶同样大小，NC膜浸入转移buffer中平衡30 min。

（5）按右图操作：逐层铺平，各层之间勿留有气泡和皱折。

（6）虹吸转移12-16h。

3．固定DNA

（1）取出转移后的NC膜，用滤纸吸干NC膜，NC膜光面朝上平铺于变性液中变性5min。

（2）用相同的方法将NC膜平铺在中性液上，中和两遍，每遍5min。

（3）将膜夹在两张干燥滤纸间，80℃烘烤1-2h。

4．预杂交

（1）将膜浸入5×SSC 中2min，将膜放入干净的塑料袋中。

（2）将预杂交液事先在65℃预热，然后将10 ml 预杂交液加入袋中，封口。

（3）65℃预杂交1h 以上，不时摇动。

5．杂交

（1）取出杂交袋，剪去一角去除杂交液后，加入5ml杂交液及5μl 变性探针，排除气泡后封口。

（2）将杂交袋放入65℃水中杂交过夜。

6．按下列条件洗膜

2×SSC, 0.1%SDS 50ml 室温5min /2次

0.1×SSC, 0.1%SDS 50ml 65℃15min /2次

7．免疫酶联检测

（1）偶联反应