21世纪单细胞分析发展_程介克

第18卷 第4期大学化学2003年8月今日化学

21世纪单细胞分析发展

程介克X 庞代文XX 黄卫华X X X 鲁馨X X X X

(武汉大学化学与分子科学学院 武汉430072)

细胞是生物体的形态结构和生命活动的基本单位。了解生物体生命活动的规律,必须以研究细胞为基础,探索细胞的生命活动,掌握和控制生、老、病、死的规律,造福于人。

目前细胞研究已经从细胞整体(单细胞)深入到亚细胞(局部细胞质、细胞膜、囊泡)和分子水平(DNA 等生物大分子及单分子)。因此,单细胞分析向分析化学提出了严峻的挑战,也带来众多机遇。由于细胞极小(一般直径7~100L m),样品量很少(体积fL~pL),胞内组分十分复杂(最简单的红血球细胞含蛋白质上千种),胞内生化反应速度快(ms~s 级),因此,单细胞分析要求超小体积、灵敏度高(amol~zmol,10-15~10-21mol/L)、选择性好、响应速度快的分析技术。由于毛细管电泳能满足上述要求,在单细胞分析中研究及应用最为广泛。

国外在单细胞分析领域较著名的研究组均集中在美国,如北卡罗来纳大学J.W.Jorgen -son,R.M.Wightm an,宾州州立大学A.G.Ew ing,衣阿华州立大学E.S.Yeung,伊利诺大学J.V.Sw eedler,密西根大学R.T.Kennedy 及华盛顿大学N.J.Dovichi 等。

国内在单细胞分析方面起步较晚,力量分散,发展较缓慢。目前承担国家自然科学基金资助课题的单位(按资助年代先后为序)有武汉大学、山东大学、中国科技大学北京研究生院、中国科学院化学研究所、北京大学、中国科学院大连化学物理研究所、南京大学、广西师范大学等。近10年来,国家自然科学基金委对单细胞分析研究课题给予了大力支持和积极赞助。由于单细胞分析领域的迅速发展,2002年批准资助课题大幅度上升到6项(/十五0重大项目中子课题1项、重点项目1项、面上项目4项),标志着我国单细胞分析进入一个蓬勃发展时期。武汉大学在单细胞分析领域是承担基金委资助课题最早和最多的单位(1992年以来承担6项),已经开展了毛细管电泳、微流控芯片、电化学、阿达玛变换图像、动力学、微透析及荧光探针分析单细胞的研究,逐步形成一个单细胞分析的研究群体。

单细胞分析发展与毛细管电泳的兴起紧密相关。因此,这一领域的综述均以毛细管电泳为主,结合电化学、激光诱导荧光、质谱等检测方法[1]。近几年,微流控芯片[2]、图像分析[3]、实时动态监测[4]单细胞的研究迅速增长。单细胞分析的应用在不断拓宽和深入,在疾病的早期诊断方面出现了可喜的前景[5]。1X XX XXX XXXX 鲁馨:武汉大学博士研究生。

黄卫华:武汉大学博士,讲师。

庞代文:武汉大学教授,博士生导师。

程介克:武汉大学教授,博士生导师。

本文根据近几年单细胞分析的发展情况,突破了过去仅从毛细管电泳论述单细胞分析,而从单细胞操纵、进样和溶胞,图像分析,实时动态监测,应用4个方面,论述进入21世纪以来单细胞分析的发展。并根据我国国情和单细胞分析现状,提出在我国发展单细胞分析的战略和对策。

1 单细胞操纵、进样及溶胞

1.1 操纵

单细胞操纵是单细胞分析的基础,操纵单细胞的方法主要有接触法和非接触法两种。接触法以微操纵系统控制微型吸管,并采用微吸取装置对微吸管施加负压,将细胞吸在尖端,完成单个细胞操纵、转移等操作。该法直接操纵单个细胞,是目前应用最广泛的方法,其缺点在于需要精密微操纵系统及熟练操作技巧。非接触法操纵可不直接接触细胞,其中应用最多的是激光捕集方法,又称光钳(optical trap)法,利用激光对细胞产生的作用力来完成单个细胞操纵及定位[6]。非接触法对细胞伤害较小,但操纵力度不大,且操纵难度较大。Zare 研究组[7]发展了一种以激光捕集法将单个细胞定位于微型管端,在压力控制下完成单个细胞停留和转移操作,该法综合了接触法与非接触法的优点,操作简便有效。

近年来,随着芯片技术发展,微流控芯片为细胞的传输及定位等操纵提供了一种优良的平台,操纵细胞主要基于电动及流体动力两大类。D.J.H arrison 采用电渗驱动方式最早实现了群体细胞在芯片通道中的传输。我们首次运用流体动力为驱动力控制单个细胞在芯片上的操纵、传输,利用芯片上的微室对单个细胞进行定位,并对定位后细胞的量子释放进行了实时监测[8]。可以预见,微流控芯片技术必将在单细胞的操纵中发挥越来越重要的作用。

1.2 进样

单细胞进样指单个细胞进入毛细管或芯片通道。常用方法是在倒置显微镜下,将氢氟酸腐蚀的毛细管尖端靠近单个细胞,采取电动或压力差的方法将单个细胞吸入毛细管中。该法需对毛细管尖端进行腐蚀,还需精密微操纵系统,操作较为复杂。Dovichi 研究组[9]设计了自动化透明细胞进样器,无须刻蚀毛细管,进样端垂直接触细胞悬浮溶液,控制进样时间,电迁移或压力控制单个细胞进入毛细管。

图1 单细胞连续进样毛细管电泳分析装置

为了提高单细胞进样效率,Lillard 等[10]设计了一种单细胞连续进样装置(图1),将进样毛细管与电泳分离毛细管连接。进样毛细管浸入流动缓冲内,加高电场于毛细管两端时,细胞通过电渗流驱动连续不断进入进样毛细管中,细胞在接口处破膜,进入分离毛细管电泳分离。该法不需要显微镜和微操纵器,分析时间

短,可以方便、快速地进行单个红血球细胞

连续测定。但存在细胞连续进样时间不易

控制,前后两个细胞电泳分离组分出现互

相交叉的现象,尚待改进。

Walt 等[11]采用芯片技术,设计了一种

高密度的单细胞定位芯片,芯片上有直径

为5L m 的阵列微室,将单个细胞随机分散

于各个微室中,实现多个单细胞快速、同步

检测。Schm idt 等[12]也设计了类似的芯片2

阵列单细胞定位及分析系统,可以测定多个细胞和单细胞的动态过程。这种基于微阵列芯片的单细胞进样、定位及检测系统可以实现大量单个细胞的同时测定,大大提高了单细胞分析效率。

1.3溶胞

单个细胞进入毛细管或微流控芯片通道后,一般情况下必须溶解细胞(溶胞)以便进行分离检测。通常采用表面活性剂或低渗溶液引起细胞膜破裂达到溶胞目的。该法操作简单,且效率较高,所需时间一般为几秒钟。对于细胞中化学反应速度慢的分析物,如有机小分子、DNA、RNA及蛋白质等含量的分离检测,实为一种方便、高效的方法,因此已得到广泛应用[1]。

但胞内一些生化反应速度快,为秒级或更短时间。如单细胞内酶活性,为了准确测量,就要求细胞在亚秒(subsecond)时间内快速溶解,终止生化反应。Allbriton等[13]在快溶细胞方面做了一系列研究,首先提出激光快速溶胞方法,可在很短时间(n33ms)内溶胞,有效防止了胞内酶活性在溶胞时发生改变。该法对贴壁细胞和悬浮细胞均可适用,缺点在于需昂贵的脉冲激光器,且操作有一定难度。最近他们提出了一种快速电溶胞方法,电溶胞是基于电穿孔(electroporation)原理,当脉冲电压超过一定值时,造成细胞破裂。电溶胞与激光溶胞时间相当[14],该法不需要昂贵的脉冲激光器,操作也较简便,是一种高效的快速溶胞技术。

2图像分析

细胞的发现与显微镜密切相关,没有显微镜就没有细胞学。因此,显微镜是生物学最普遍应用的仪器。在细胞图像分析领域,生物学家有丰富的知识和经验值得学习。但从细胞图像分析来看,生物学家主要观察细胞的形态和结构,现在商品光学显微镜为了适应生物学需要,重点均放在如何获得清晰的细胞形态图像;而化学家特别是分析化学家,除了要求获得清晰的细胞图像外,更注重细胞图像的鉴定及定量分析,目前的商品光学显微镜一般不能适应这一要求。如荧光显微镜(Olympus,IX70,日本)在显微光路中有较大的孔隙漏光,在检测荧光强度时,导致背景高,影响信噪比,降低了检测灵敏度。为了降低漏光产生的高背景,须将显微镜置于加工的暗箱中检测荧光[15]。高档荧光显微镜(200M,Zeiss,德国)漏光现象少一些,但并未根除。对光学显微镜进行研制及改进,以满足化学家研究生物的要求,为显微光学及显微镜制造厂商提出了新课题。

2.1光学显微镜

单细胞图像分析已经开发出多种途径。最近Stephens[16]对光学显微镜用于活细胞成像进行了详细评述。荧光显微镜用于单细胞成像的报道最多,由于显微光学的发展,已有各种性能的荧光显微镜以适应单细胞图像分析的不同需求。由于分析化学家在这方面接触较少,故作较详细论述。

2.1.1一般荧光显微镜

一般荧光显微镜配备激光器及CCD摄像机,曾获得单个星形胶质神经细胞中神经递质5-羟色胺分布的天然荧光图像。采用高密度微室芯片,将单个酵母细胞分别置于6L m微室中,用多种荧光染料标记,以汞灯倒置荧光显微镜/阵列光导纤维/CCD获得活细胞阵列图像,显著提高了单细胞图像分析的效率[11]。由于数码相机的发展,最近在荧光显微镜中已配备高分辨数码相机,可获得更清晰的单细胞图像。我们在配备高分辨数码相机(3900@3090像素, AxioCam HR,Zeiss)的新型倒置荧光显微镜(200M,Zeiss)上,用萘二甲醛(NDA)荧光染料标

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