电穿孔法转化大肠杆菌TG1的条件优化

药　物　生　物　技　术

Pharmaceutical Biotechnology　2001,8(3):143～146

电穿孔法转化大肠杆菌TG1的条件优化Ξ

李　南,凌世淦2,吴梧桐1

(11中国药科大学生物制药学院,南京210009;21军事医学科学院基础医学研究所分子病毒学实验室,北京100850)

摘　要　研究了质粒pFab74X经电穿孔转化大肠杆菌TG1菌株的影响因素,并优化其转化条件。电场强度和脉冲时间的影响较为复杂,两者适当组合才可获得高转化效率。此外,采用对数生长早期的细菌,提高细菌浓度和降低筛选用氨苄青霉素的浓度均可提高转化效率。

关键词　电穿孔;转化效率;大肠杆菌TG1

中图分类号:Q68,Q936　文献标识码:A 文章编号:100528915(2001)0320143204

构建cDNA文库或基因文库时,转化效率高低是决定其多样性的关键因素之一。但常用的磷酸钙及原生质体等转化法转化效率均较低,批间差异较大,转化后再生时间长。电穿孔法(E lec2 troporation)则较好的解决了这个难题,它是利用瞬间高压电脉冲作用于受体细胞,使细胞表面产生暂时性的孔隙,从而将DNA、RNA、蛋白质等多种生物分子或颗粒导入胞内的方法,也称为电转化法。由于电穿孔是一个物理过程,适用范围广,转化效率高,特别是针对易受溶酶体消化的生物分子[1]及没有合适遗传转化系统或转化效率低的细胞,效果显著。目前,电穿孔法已经广泛应用于生物学、医药学、食品学等各个领域,成为转化细胞的常用方法。

电穿孔法最早是应用于真核细胞。1982年, W ong和Neumann成功的用电穿孔法转化小鼠成纤维细胞[2],但效率不高。现在,由于技术改进,操作简便快速,转化效率高,已广泛应用于原核细胞外源生物分子的导入。但影响转化效率的因素众多,不同的电穿孔体系[3]、受体细胞[4]、外源生物分子[5],其最佳转化条件均有一定差异。因此要获得高转化效率必须寻找这些因素的最佳组合。本文探讨了电场强度、脉冲时间、细菌浓度、细菌生长周期及转化子筛选过程氨苄青霉素浓度对TG1细菌转化效率的影响,并优化转化条件,以便利用TG1菌株建立高度多样性的基因文库,促进基因工程药物的发展。1　材料与方法

111　材料与仪器

E1coli TG1supE hsdΔ5thiΔ(lac2proAB)F’[traD36proAB+lacI q lacZΔM15]和质粒pFab74X (613kb,Ap r),由军事医学科学院基础医学研究所分子病毒学实验室保存;蛋白胨和酵母提取物为Ox oid公司产品,MOPS购自北京鼎国生物工程公司,氨苄青霉素(简称Ap)和其余试剂为进口或国产分析纯;S B培养基(3%蛋白胨,2%酵母提取物,1%MOPS,014%葡萄糖,10mm ol/L MgCl2, pH710),S OB培养基(2%蛋白胨,015%酵母提取物,0105%NaCl,215mm ol/L K Cl,10mm ol/L MgCl2, pH710),S OB2A培养基(含100mg/L Ap的S OB培养基),S OC培养基(S OB培养基,加20mm ol/L葡萄糖),S OC2A培养基(含100mg/L Ap的S OC培养基);I N2101型基因脉冲导入仪(天津理工学院), Lambda2UV/VIS型光谱分析仪(美国Perkin2 E lmer公司)。

112　菌株制备

将270℃冻存的TG1菌种分别于S OB和S OB2 A琼脂平板上划线培养,验证其为Ap s。从S OB 平板上挑取单菌落,37℃于S B培养基中培养至OD600约为110。取培养物按1∶100的比例重接于S B培养基中,37℃培养至OD600约为016。培养物冰浴中放置30min后,在4℃以4000r/min离心

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Ξ收稿日期:2001203212

基金项目:北京市自然科学基金资助,N o.7002031

作者简介:李南(1976年生),男,江苏南京人,中国药科大学硕士生,分子生物学,E2mail:s outh-lee@etang1com

15min。用预冷的10%甘油溶液重复洗涤细菌3次,最后于4℃,3000r/min离心20min。弃上清后加少量10%甘油溶液将细菌悬浮,取样稀释测OD600值,计算细菌浓度并调整至2×1010/ml,每管200μl分装后-70℃冻存备用。

113　质粒制备

pFab74X在E1coli JM109中扩增,采用上海华舜生物工程公司质粒提取试剂盒提取,经琼脂糖电泳和紫外吸收法分析和鉴定产物纯度。用灭菌超纯水稀释至100mg/L,-20℃保存备用。

114　转化方案

-70℃保存的感受态细菌于冰浴中缓慢解冻,与2μl质粒溶液混匀后,加于预冷的样品杯内。电击后,迅速加入1ml预冷的S OC培养基,混匀后37℃缓慢振荡培养45min。培养物用S OC培养基有限稀释,分别铺于S OC和S OC2A平板上,培养过夜后计数,计算转化效率(转化子数/μg DNA)和存活率(转化后活菌数/转化前细菌总数)。

2　结　果

211　脉冲时间和电场强度对TG1菌株转化效率的影响

分别在6,8,10,12kV/cm的电场强度下,通过改变电路中电容值的大小来控制脉冲时间的长短,结果见图1。电场强度恒定时,脉冲时间延长,转化效率在一定范围内增加而达到最大值。更长的脉冲时间导致转化效率迅速降低。如场强为10kV/cm时,转化效率在脉冲时间约为15ms时达到最高。电场强度的影响较为复杂。脉冲时间较短(小于11ms)时,转化效率与电场强度呈正相关。脉冲时间较长(大于21ms)时,随着场强的增大,转化效率明显降低。当脉冲时间适中(在11ms和21ms之间)时,转化效率在某一场强处达到最大值,场强增大或减小均降低转化效率。本实验表明,8kV/cm电场强度下脉冲18ms时,TG1菌的电转化效率最高。

212　脉冲时间和电场强度对TG1菌株存活率的影响

以上实验中,同时记录电穿孔后存活细菌的数量,观察脉冲时间和电场强度对存活率的影响(图2)。由图2可知,脉冲时间延长,电场强度增大均会导致存活率降低。当转化效率达到最高时,死亡率也很高,说明外源生物分子进入菌体内同时,也有大量细菌不胜“重压”而死亡。在此基础上再延长脉冲时间,或增大电场强度,转化效率和死亡率均增高,此时转化效率的主要限制因素就是大量受体细菌的死亡。

213　TG1细菌浓度对转化效率的影响

将细菌悬液按1∶10梯度稀释。取等体积不同浓度的细菌悬液进行电穿孔,电场强度为8kV/ cm,脉冲时间控制在17到19ms。细菌浓度和转化效率的关系如图3所示。从图3可知,实验范围内,细菌浓度越高,转化效率就越高,两者成正

相关。菌浓为1010个/ml时,转化效率达到最高。

●6kV/cm　■8kV/cm　▲10kV/cm　◆12kV/cm

Fig1　

E ffects of pulse time and field strength on trans forma2 tion efficiency

●6kV/cm　■8kV/cm　▲10kV/cm　◆12kV/cm

Fig2　E ffects of pulse time and field strength on survival rate 214　TG1菌株生长周期对转化效率的影响将细菌培养至不同的生长时期(OD600分别为012,014,016,018),分别制备电感受态细菌(浓度均为2×1010/ml)后,按213中条件进行电穿孔,结果如图4所示。生长至OD600为012的细菌转化效率最高,可达107个转化子/μg DNA,表明处于

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