植物发育生物学研究方法

突变体选择的概念

组织培养筛选突变体的方法，又称离体筛选。 组织培养过程中表现出的变异，体细胞无性系变异 在培养基中加选择压（化学物质）诱导产生变异，具有 定向突变特征。 植物细胞工程目前分为五个分支： 脱毒与快速繁殖。 细胞的大量培养。 体细胞杂交。 细胞遗传转化及产生转基因植株。 无性系变异与分离突变体。 后三者则主要利用遗传变异，创建新种质。
RNAi广泛存在于自然界


随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、 水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的 早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐 明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工 具，RNAi也越来越为人们所重视。

RNAi的发现
20多年前，在对矮牵牛（petunias）进行的研究中有个奇怪 的发现：Rich Jorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一 个强启动子后，导入矮脚牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果 没看到期待中的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。 Jorgensen将将这种现象命名为协同抑制“cosuppression”，因 为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。后来发现在其 他许多植物中，甚至在真菌中也有类似的现象。
化学诱变：在组织培养中常用化学诱变剂处理，好处是不 需专门设备，操作方便，由于处理的材料是组织块、细胞 团、游离的单细胞或原生质体，因此可以在一定程度上克 服化学诱变剂穿透力差的缺点。所以对培养组织进行诱变， 目前较多采用化学诱变剂。用各种诱导剂处理可以提高突 变频率10～100倍，下面介绍植物组织培养诱变中常用的 诱变剂的种类和使用方法。



离体筛选的优点： 离体筛选突变体的可控程度高，便于进行定向选择。

突变频率高，筛选群体大，在较小容器中可操作百万 到千万个植物细胞。
离体筛选的意义： 对农作物形状进行遗传改良；为细胞杂交和转基因技 术提供选择标记，如互补选择；对突变体细胞进行遗 传及生理代谢研究。 突变是遗传变异性的终极来源，它为种群变异提供原 材料。是体现生物多样性和适应多变环境的重要方式。


烷化剂 甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基磺酸甲酯（MMS）、 乙基磺酸乙酯（EES）、乙烯亚胺（EI）、亚硝基 乙基脲（ENH）等。 烷化剂是栽培作物中诱发突变极其重要的一类化 学诱变剂，它带有许多活烷基，烷基能够转移到 其他分子中电子密度极高的位臵上去，这种通过 烷基在分子内的臵换作用称为烷基化作用。这些 物质通过磷酸基、嘌呤、嘧啶基的烷化而与DNA作 用，最终引起遗传物质的破坏、修复与错误修复 的各种酶促反应而发生变异。
RNAi的定义


目前对RNAi (RNA interference)的定义有很多种，如 果将RNAi看作一种生物学现象，可以有以下定义： ① RNAi是由dsRNA介导的由特定酶参与的特异性基 因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平 上阻断基因的表达。 ② RNAi是有dsRNA参与指导的，以外源和内源 mRNA为降解目标的转基因沉默现象。具有核苷酸序 列特异性的自我防御机制，是一种当外源基因导入或 病毒入侵后，细胞中与转基因或入侵病毒RNA同源 的基因发生共同基因沉默的现象。
突变体的诱导与选择

源自文库

突变体可以通过植物自发突变产生，不过研究中常常通过 人为手段诱导获得突变体。一般来说，单个植株自发突变 的频率介于千分之一至万分之一，单个基因自发突变的频 率则介于十万分之一至百万分之一。除了自发突变外，体 细胞无性系也会产生突变体。不过最常见的突变体还是通 过人工诱变的方法产生的，如理化诱变突变体和插入突变 体。 自发突变是在自然条件下发生的突变，是生物变异的重要 来源和自然进化的基础。但是自发突变的频率较低，而且 许多突变常常是致死型或通过表型无法鉴定而无法获得， 因此系统收集自发突变体存在很多困难。即使获得感兴趣 的突变体，分离突变体基因和鉴定其功能也是比较困难的。


亚硝基胍（NTG，N-甲基-N-硝基-N-亚硝基胍）是已知的 最强的化学诱变剂，在合适的条件下可产生很高的突变率， 而致死率较低，利用浓度的不同可控制突变率的高低，常 用的浓度为10～50µg/ml。用这种化学诱变剂处理后，通 过离心或微孔滤膜过滤的方法收集细胞，然后用水或培养 液洗涤后植平板。 叠氮化物是在常规诱发突变中对植物诱变效果最好的一种 诱变剂，在诱发大麦、豌豆、小麦、水稻等作物上都能获 得高的诱变率。 对大麦叶绿素缺失突变体诱变的效果，比γ射线和中子诱 导率高，对人毒性小，对植物引起的损伤也小。γ射线和 中子诱变率为10%，叠氮化钠诱变率为40%～50%。

体细胞无性系变异的特征表现在：随机性，无法精确地分 批重复。再生植株的遗传变异性广，包括染色体变异，畸 变，点突变，转座，以及线粒体和叶绿体基因组的改变等。


2. 人工诱发突变
物理方法：主要有X射线，r射线处理，32P、14C等。有时 用热中子或快中子处理。物理诱变的好处是，使用方便， 干净，穿透力强，重复性好，突变频率高，但需专门的设 备。
二、变异的类型
1. 农作物的品质改良 食品的营养价值主要取决于种子中蛋白质和氨基酸的含量， 特别是氨基酸的组成和含量。谷类作物中的多数作物赖氨 酸、苏氨酸、异亮氨酸含量偏低，而在一些豆类作物中蛋 氨酸偏低。如赖氨酸含量在玉米中约为0.3%，小麦在0.34% 左右。 作物体内某些特定的氨基酸在细胞内保持一定的浓度，过 高回发生毒害作用。而某些细胞一旦获得对这些氨基酸的 抗性后，可大大减轻这些毒性，从而允许细胞内这些氨基 酸及类似物的过量积累，这些氨基酸也许就是对人们特别 有用的氨基酸。如获得高赖氨酸细胞系的突变植物类型， 就可达到改良品种的目的。
RNAi的定义



如果将其作为一门生物技术，则定义为 ： ① RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特 异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与内源靶基因 具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱 导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。 ② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA） 在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。 ③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链 RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产 生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post transcriptional gene silence , PTGS)。
2.抗病突变体

当病原菌侵染植物组织后往往会产生一种 毒素，破坏寄主细胞正常的代谢，严重的 甚至导致细胞的死亡。病原毒素一般为一 些次生产物，如糖苷、萜类、酚类或氨基 酸类似物等。在培养基内加入某种病原毒 素可淘汰不抗病的细胞，筛选出可以抗病 的细胞。

3 抗逆突变体 耐盐突变体的筛选是通过在培养基中加入高盐浓度，甚至 海水来进行的。在盐浓度逐渐增加的条件下，诱导并筛选 出耐盐的细胞系。 Dix和Steet（1975）利用加入NaCl的液体培养基，培养辣 椒和烟草，结果得到一种可在含1%～2% NaCl条件下生存 的抗盐突变细胞株，培养几代在回到含盐培养基中，仍具 有抗盐性。在抗盐细胞中游离脯氨酸积累量增加，表明脯 氨酸与植物抗盐性的关系。 Dix和Steet用辣椒愈伤组织细胞进行悬浮培养，用甲基磺 酸乙酯（EMS）作为诱变剂，在0～-3℃条件下，得到两个 抗低温的突变细胞系。
定向基因突变


T-DNA插入突变 转座子插入突变

T-DNA插入法主要是利用农杆菌Ti或Ri质粒中的一段转 移DNA序列，从农杆菌中转移并稳定整合到植物的基因 组中。由于农杆菌转化技术的成熟和广泛使用，因此通过 大量T-DNA独立转化子建立T-DNA插入突变体库，是一 种快速构建插入突变体库的方法之一。以拟南芥为例，目 前为止，已经构建了22500多个拟南芥T-DNA插入突变体， 获得约360000个T-DNA插入位点序列，几乎涵盖了拟南芥 整个基因组，使得研究和分析植物生长发育过程中各个相 关基因的功能成为现实。 转座子插入法主要是利用来自于玉米的Ac和Ds转座子能 在植物基因组中跳动，且跳动后经常以高频率在原位点附 近再插入从而破坏原位点周围的基因为原理。目前通过转 座子插入系统已经获得多种包括植物和微生物在内的各种 突变体库，为分析基因在植物生长发育过程中发挥的功能 提高大量的材料。


RNAi的提出




直到1998年2月，Fire A和Mello C才首次揭开这个悬 疑之谜。 他们将体外转录得到的单链RNA纯化后注射线虫时 发现，基因抑制效应变得十分微弱；而经过纯化的 双链RNA却正好相反，能够高效特异性阻断相应基 因的表达。 他们证实，Guo S博士遇到的正义 RNA 抑制基因表 达的现象，以及过去的反义RNA技术对基因表达的 阻断，都是由于体外转录所得 RNA中污染了微量双 链RNA而引起。 该小组将这一现象称为RNA干扰（RNA interference， 简称RNAi）。



抗UV植物细胞克隆
三、变异的来源
1 .离体培养细胞的自发突变

组织培养后植株变异的原因：
组织培养过程中引起的可遗传的变异。植株的再生方式、 生长调节物质、继代培养的时间。 由外源遗传及生理作用引起的变异

植物的细胞、组织、在离体培养时，由于环境条件可以 人为控制和培养基中化学因素的影响，会发生各种各样 的变异，外植体体细胞发生的变异称为体细胞变异



1995 年， Guo S 等试图阻断秀丽新小杆线虫 （C. elegans）中的par-1基因的表达。 设计： 反义RNA 特异性地阻断par-1基因的表达； 正义RNA 以期观察到基因表达的增强。 结果: 二者都同样地切断了 par-1 基因的表达途径。 这是与传统上对反义 RNA技术的解释不相符 合。该研究小组一直没能给这个意外以合理 解释。

基因沉默 反向遗传学
基因沉默的概念及发现

基因沉默（Gene silencing）是指生物体中特定基 因由于种种原因不表达或者是表达减少的现象。 基因沉默现象首先在转基因植物中发现，接着和 线虫、真菌、昆虫、原生动物以及才鼠中陆续发 现。大量的研究表明，环境因子、发育因子、 DNA修饰、组蛋白乙酰化程度、基因拷贝数、位 置效应、生物的保护性限制修饰以及基因的过度 转录等都与基因沉默有关。


四、突变体的选择方法 1.直接选择法 通常是把细胞培养在一种亲本细胞不能生长的培养基上， 或亲本细胞死亡的培养基上，即施加选择压。经诱变或未 经诱变的培养组织都可用增加选择压抑制未突变细胞生长 的化学物质的方法进行选择。在培养基中施加不同的选择 压可以对所需要的性状进行定向选择。 如以抗植物毒素（选择压）选择抗病性，以高浓度的盐选 择耐盐性，以高浓度的除草剂或农药选择耐药性，以某种 代谢中间产物为选择压筛选高氨基酸、高糖的优质谷物新 品种。 例如，要分离某种除草剂有抗性的突变体，首先是把培养的材 料接种在含一系列浓度除草剂的培养基上，测定最低的开 始抑制生长的浓度。对能进一步生长的组织可以在含一系 列浓度的除草剂的培养基上进行在培养，以确定其耐药的 最高极限浓度。
野生型
试验
预测
RNA interference

1995，RNAi现象首次在线虫中发现。


1998，RNAi概念的首次提出。
1999，RNAi作用机制模型的提出。在线虫、果蝇、 拟南芥及斑马鱼等多种生物内发现RNAi现象。 2001，RNAi技术成功诱导培养的哺乳动物细胞基 因沉默现象。RNAi 技术被《Science》评为2001 年度的十大科技进展之一。 至今，蓬勃发展，成为分子生物学领域最为热门 的方向之一。
植物发育生物学研究 方法
发育生物学在生命科学中的地位
生理学 分子生物学
发育生物学
遗传学
免疫学 细胞学
生物化学
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植物发育生物学常用研究方法及原理

突变体库构建 基因沉默（RNAi） 蛋白质互作研究


突变体的诱导与选择 正向遗传学
突变体的诱导与选择

随着大量物种全基因组序列测序完成，对基因的研究进入 了以功能基因组学为代表的后基因组时代。功能基因组学 是在结构基因组学丰富信息资源的基础上，利用植物全基 因组序列的信息，应用各种实验方法并结合统计和生物信 息学方法研究和分析基因的表达、调控与功能以及植物的 生长、发育规律的学科。要了解植物体内各基因的生物学 功能，如何协调发挥作用，参与一系列的生长发育过程， 就需要我们精确了解每个基因的功能及基因间的相互作用； 构建基因突变体库，通过突变体分析鉴定基因功能是一种 最直接最有效分析鉴定基因功能的方法。