环境微生物学-实验二 微生物的染色

实验二微生物染色
一、实验目的
1、进一步熟悉和掌握显微镜的操作方法；
2、学习用压滴法制作标本片；
3、学习微生物染色的原理；
4、学习微生物涂片、染色的基本技术。

二、实验仪器和材料
显微镜、香柏油（或液体石蜡）、二甲苯、擦镜纸、吸水纸、接种环、载玻片、酒精灯；
美蓝染液，草酸铵结晶紫染液、革氏碘液、95%乙醇、蕃红染液；
酵母菌、大肠杆菌、枯草杆菌。

三、染色原理
微生物（尤其是细菌）的机体小且是无色透明的，在活体细菌内又含有大量的水分。

因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。

当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有明显的明暗差，难以看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。

通常用染料将菌体染上颜色以增加反差，在显微镜下观察。

微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其它化合物组成的，所以微生物细胞表现出两性电解质的性质。

两性电解质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性，带正电；在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性，带负电。

经测定，细菌的等电点pI在pH=2~5之间，故细菌在中性（pH=7）、碱性（pH > 7）或偏酸性（pH=6~7）溶液中，细菌等电点均低于上述溶液的pH值，所以细菌带负电荷，容易与带正电荷的碱性染料结合，故用碱性染料染色的居多。

碱性染料并不是碱而是一种盐，电解时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合，而使细菌着色。

碱性染料有美蓝、甲基紫、结晶紫、龙胆紫、碱性品红、中性红、孔雀绿和蕃红（沙黄）等。

微生物体内各结构与染料结合力不同，故可用各种染料分别染微生物的各结构以便观察。

四、染色方法
1、简单染色法
简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。

此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。

常用的简单染色染料有美蓝、结晶紫、碱性复红、番红（沙黄）等。

2、革兰氏染色法
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状。

它是1884年由丹麦医师Gram创立的。

革兰氏染色法不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：革兰氏阴性细菌（G－）和革兰氏阳性细菌（G+）。

细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。

革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起的网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫和碘的复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此呈紫色；革兰氏阴性菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫和碘的复合物易被乙醇抽出而脱色，经复染后呈现红色。

3、芽孢染色法
芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。

芽孢壁厚、透性差，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料如孔雀绿在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可以经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则芽孢和菌体易于区分。

加热时要补加染色剂，切勿让图片干涸。

4、荚膜染色法
荚膜是包裹在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易被染色，故常用背景染色法（衬托染色法），即将菌体与背景着色，而将不着色且透明的荚膜衬托出来。

荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。

5、鞭毛染色法
鞭毛是细菌的运动器官，一般细菌的鞭毛都非常纤细，其直径为0.01~0.02µm，在普通光学显微镜的分辨力限度以外，故需要用特殊的鞭毛染色法才能看到。

鞭毛染色是借媒染剂和染色剂的沉淀作用，使染料堆积在鞭毛上，以加粗鞭毛的直径，同时使鞭毛着色，在普通光学显微镜下能够看到。

在显微镜下观察细菌的运动性，也可以初步判断细菌是否有鞭毛。

通常使用压滴法或悬滴法观察细菌的运动性。

观察时，要适当减弱光线，增加反差，如果光线很强，细菌和周围的液体就难以判别。

五、实验内容和步骤
（一）用压滴法制作标本片
取一片干净的载玻片放在实验台上，用滴管吸取无菌水（或生理盐水）1/4滴，滴在载玻片的中央，用无菌操作取试管中的目的菌种涂片，用干净的盖玻片倾斜接触液滴，沿液滴方向缓缓覆盖在液滴上（注意不要有气泡），用显微镜观察。

（二）细菌的简单染色步骤
1、涂片取两块干净的载玻片，各滴一滴生理盐水于载玻片中央，用无菌操作分别挑取大肠杆菌和枯草芽孢杆菌于两载玻片的水滴中（每一种菌制一片），调匀并涂成薄膜。

滴生理盐水时不宜过多，涂片必须均匀。

2、干燥于室温下自然干燥。

3、固定涂片面向上，于酒精灯火焰上通过2~3次，使细胞质凝固，以固定细胞质的形态，并使其不易脱落。

热固定温度不宜过高（以玻片背面不烫手为宜，不能在火焰上烤干），否则，细菌的形态将改变甚至破坏。

4、染色放标本片于水平位置，滴加染色液于涂片薄膜上，染色时间长短随不同染色液而定。

美蓝染色液约染2~3分钟，石炭酸复红染色液约染1~2分钟。

5、水洗染色时间到达后，用蒸馏水冲洗，直至冲下之水无色时为止。

冲洗水流不要过急、过大，水由玻片上端流下，避免直接冲在涂片处。

冲洗后，将标本晾干或用吹风机吹干，待完全干燥后再放置在显微镜下观察。

6、镜检涂片赶后镜检。

涂片必须完全干燥后才能用油镜观察。

（三）细菌的革兰氏染色步骤
1、取大肠杆菌和枯草杆菌（均以无菌操作）分别做涂片、干燥、固定。

方法均与简单染色法相同；
2、用草酸铵结晶紫染液一滴，约1分钟，水洗；
3、加革兰氏染液媒染1分钟，水洗；
4、乙醇脱色30秒，水洗；
5、用蕃红染液复染1分钟，水洗；
6、用吸水纸吸掉水滴，用显微镜观察，先用低倍镜，发现目的物后，再用油镜，注意细菌细胞的颜色，绘出细菌的形态图并说明革兰氏染色的结果。

染色的关键：必须严格掌握乙醇脱色的程度，如果脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌，若脱色不够时，阴性菌被误染为阳性菌。

思考题：
1、用压滴法制作标本片时，成功的关键是什么？
2、微生物染色的原理是什么？
3、革兰氏染色后，大肠杆菌和枯草杆菌各染成什么颜色？是阳性还是阴性？
4、革兰氏染色过程中，只进行到脱色，没用复染剂复染，是否能分辨出革兰氏染色结果？为什么？。