噬菌体随机肽库 中文说明书 phage display
Phage display
coated microtitre wells
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Wash to remove unbound phage particles
20
Elute bound phage
21
Amplify eluted phage Repeat selection Analyze
a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity
感染 和扩增
E.coli
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举例
• 呼吸道合胞病毒感染呼吸道上皮细胞靶向 肽的筛选及验证
23
4
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噬菌体展示系统的应用及优缺点
应用范围
诊断 被动免疫 蛋白质结构分析 药物导航 蛋白质纯化
抗体
30
蛋白质—蛋白质 蛋白质—DNA 蛋白质—其他
受体—配体 信息传递 拮抗剂 抑制剂
Phage display
——基于将某个蛋白与其遗传信息之间直接 联系的筛选方法
Liu Yun
1
概 述
噬菌体展示技术（Phage Display techniques，
PDT）起源于1985年，是一种用于筛选和改造功能性多 肽、蛋白质强有力的生物技术，广泛应用于蛋白组学、 基因克隆等多个分子生物学领域。 目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原 决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节 分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑 制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不 同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。
1990年Scott等首次将随机序列肽与丝状噬菌体表面蛋 白g 融合展示在噬菌体表面，建立了噬菌体展示随机肽库。
Phage display technology(1)
Ph.D.缺点
首先，所建的肽库容量只能达到109，要想构建 大片段的肽库很困难。 其次，需要解决肽库的多样性问题。 第三，少数多肽由于疏水性过强，或由于影响外 膜蛋白的折叠而不能展示在噬菌体表面。
Ph.D.应用
1. 抗体：抗狂犬病毒的单链抗体等等。 2. 疫苗 3. 多肽类药物 4. 肿瘤药物导航载体
展示系统
Display System
噬菌体展示系统的分类 Classification of phage display systems
Ph.D.步骤
以单克隆抗体筛选蛋白质抗原表位为例 将单抗包被聚乙烯平皿后，再加入噬菌体展示肽 库，使其充分与单抗反应后，洗去未结合的游离 噬菌体，再用洗脱液将结合状态的噬菌体洗脱下 来。将其浸染宿主大肠杆菌扩增后回收，再进行 下一轮筛选。通常经过3、4轮的筛选，并且每次 增加筛选强度，这样就可获得与单抗结合较紧密 的噬菌体克隆。通过序列测定和分析，就能推知 该噬菌体克隆所携带的外源短肽序列，从而确定 该单抗所针对的抗原表位。
壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳 蛋白的表达而表达，同时，外源蛋白随噬菌体的 重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。
Ph.D.原理
将多肽或蛋白质的编码基因或目的基因片段克隆入噬 菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源多肽或蛋 白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重 新组装而展示在噬菌体表面。保持相对独立的空间结 构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。肽库与 固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结 合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分 子结合吸附的噬菌体，洗脱的噬菌体感染宿主细胞后 经繁殖扩增，进行下一轮洗脱，经过3轮～5轮的 “吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体 得到高度富集。
噬菌体肽库技术
噬菌体肽库技术
朱忠玉
【期刊名称】《细胞生物学杂志》
【年(卷),期】2000(22)1
【摘要】80年代中期,George P.Smith在前人对丝状噬菌体分子生物学研究的基础上首先提出了噬菌体展示技术(Phage Display),其核心就是将蛋白质分子的表型和基因型巧妙地结合于丝状噬菌体这样一个便于对其进行一系列生化和遗传操作的载体上,从而大大简化了蛋白质分子表达库的筛选和鉴定。
基于这一优点。
【总页数】4页(P28-31)
【关键词】噬菌体肽库技术;噬菌体展示技术;免疫学;应用
【作者】朱忠玉
【作者单位】中国科学院上海细胞生物学研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q516;Q939.48
【相关文献】
1.应用噬菌体展示肽库技术淘选大鼠 CCR5膜外第一、二胞外环特异性结合的活性拮抗肽与初步鉴定 [J], 刘思雪;胡梅;叶小研;黄花荣;钟英强
2.利用噬菌体随机肽库筛选表达Aβ靶向肽的噬菌体 [J], 周先岭;徐文锐;陈贵海
3.噬菌体肽库技术筛选肿瘤靶向短肽的研究进展 [J], 张洋(综述);张小明;刘刚(审校)
4.噬菌体展示肽库技术淘选蚕丝纤维蛋白连结短肽的实验研究 [J], 戴静;李涵依;全
亚玲;欧小兵;陈艺元;郝葆青
5.噬菌体肽库技术筛选抗PRRSV肽及其应用 [J], 侯凤香;刘珂;李培德;涂宜强;陈溥言;涂国众
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噬菌体展示技术
the leader in enzyme technology
主要衣壳蛋白pVIII
¾ 每个病毒子含约2700个拷贝，约10% 能有效地融合外源多肽或蛋白。 ¾ 以pIII融合子方式表达的多肽是低 价的，而以pVIII融合子方式表达的 多肽则是高价的（每个病毒子~200 个拷贝）。 ¾ 这种高价pVIII展示所增加的亲和力 有利于筛选到亲和力非常低的配体， 而低价pIII展示则将筛选限制在具 有个拷贝的外源多 肽）。
Schematic representation of M13 Phage Schematic representation of T7 Phage
the leader in enzyme technology
M13噬菌体的组成和结构
Structure of M13 filamentous phage
the leader in enzyme technology
噬菌体展示系统 Phage on display
• 噬菌体展示原理 – 噬菌体展示定义、分类 – 简介噬菌体及淘选过程 噬菌体展示应用 商业化噬菌体展示系统
• •
the leader in enzyme technology
什么是噬菌体展示
the leader in enzyme technology
噬菌体展示技术
Smith在1985年首次证实外源DNA可以插入丝状噬 菌体基因III中，并与pIII蛋白融合展示。
Smith GP. Science 1985; 228:1315-7
the leader in enzyme technology
是一项筛选技术，将外源多肽或蛋白与噬菌体的衣壳蛋白融合表 外源多肽或蛋白 达，融合蛋白展示在病毒颗粒的表面，而编码该融合子的DNA则位于 DNA 病毒粒子内。 使大量多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使各种靶分 子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过淘选得以快速鉴定。
噬菌体展示技术在免疫学和分子生物学中的应用
噬菌体展示技术在免疫学和分子生物学中的应用张云20112026 生物化学与分子生物学摘要：噬菌体展示技术指将外源蛋白质分子或肽段的基因克隆至噬菌体基因组DNA中，并使其编码的分子呈现于噬菌体表面，从而构建蛋白质或多肽文库，包括噬菌体抗体库技术和噬菌体肽库技术。
噬菌体抗体库模拟了天然抗体库，使得人们可以不经过复杂的免疫过程，而是直接利用抗原就可以从抗体库中筛选出特异性抗体成为可能。
噬菌体肽库技术在分析抗原表位，开发新型疫苗，筛选肿瘤细胞特异性接合肽和研究蛋白质间相互作用等方面有突出优势。
关键词：噬菌体展示技术，噬菌体抗体库，噬菌体肽库，抗体工程The Usage of Phage Display T echnique in Immunology and Molecular BiologyAbstract: Phage display technique is to clone the genes of foreign proteins or peptides into the genome of phage, displaying the encoded molecules on the surface of phage . In this way the protein or peptide library is constructed, and the technique consists of phage antibody library technology and phage peptide library technology. Phage antibody library simulates the natural library, making it possible for people to screen the specific antibody from antibody library directly by antigen instead of going through the complicated immune processes. Phage peptide library technique has great advantage in analyzing epitopes, developing new vaccines, screening specifically conjugated peptides of tumor cells and researching the interaction between proteins.Key words: phage display technique, phage antibody library, phage peptide library, antibody engineering噬菌体展示技术指利用分子生物学技术，将外源蛋白质分子或肽段的基因克隆至噬菌体基因组DNA中，并使其编码的分子呈现于噬菌体表面，从而构建蛋白质或多肽文库，被展示的外源蛋白或多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性，利用外源蛋白或多肽与筛选靶标的特异性亲和作用，通过吸附、洗脱、扩增的重复过程，将含有特异性外源蛋白或多肽的噬菌体从表达有各种外源蛋白的噬菌体库中筛选出来，并得到大量富集。
噬菌体随机肽库_中文说明书_phage_display
目录简介 (2)培养基和溶液 (5)常规M13方法 (6)淘选程序（固定靶分子） (8)结合克隆的特征 (12)其他淘选方法（液相结合法） (15)其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16)附录：优化肽结合相互作用 (19)文库的氨基酸分布 (21)试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）：•随机十二肽噬菌体展示文库100 µl, 1.5×1013 pfu/ml。
贮存于含50%甘油的TBS溶液中。
复杂度~2.7×109个转化子。
•-28 gIII测序引物5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/µl •-96 gIII测序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/µl, 1 pmol/µl •E.coli ER2738宿主菌F’lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk –m k–McrBC–)。
该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。
贮存于-70℃。
•链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg•生物素，10 mM 100 µl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。
概述噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。
噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。
噬菌体展示技术
In phage display, a heterologous peptide or protein is displayed on the surface of the phage through transcriptional fusion with a coat-protein gene ,producing novel phage particles that have a variety of potential uses. Foreign proteins can usually be displayed on more than one phage coat protein and in varying amounts. Generally, the smaller the foreign protein or peptide the more copies can be displayed, although this also depends on the phage used, the coat protein and the antigen displayed.
噬菌体展示技术(Phage Display techniques,PDT)起源于1985年,是一 种用于筛选和改造功能性多肽,蛋白质 强有力的生物技术,广泛应用于蛋白组 学,基因克隆等多个分子生物学领域.
目前噬菌体展示技术的研究进展非 常迅速,在抗原决定簇的定位,蛋白质 相互作用位点的确定,特异调节分子的 分离和人工抗体和疫苗的制备,诊断技 术,酶抑制剂的研究开发,多肽药物的 研制等生物技术研究的不同领域得到了 应用,并对这些领域产生了深远的影响.
1985年Smith首次通过基因工程的手段,将 外源基因插入丝状噬菌体基因组中,从而使表 达的外源肽或蛋白与噬菌体外壳蛋白一起展示 在噬菌体表面,由此建立了噬菌体展示技术.
从噬菌体展示随机肽库中淘选多肽药物参考模板
从噬菌体展示随机肽库中淘选多肽药物Selection of Peptide drugs from Phage-displayedRandom Peptide Library生命科学学院99级沈抒殚摘要以凝血酶为靶分子，利用噬菌体展示和亲和淘选技术，从随机十五肽库中筛选到结合凝血酶的3个特异结合肽克隆，并对其中结合活性最强的短肽进行了序列测定。
ELISA鉴定结果表明，3个克隆对于凝血酶都有一定的结合能力，且都与凝血酶的天然抑制剂水蛭素产生竞争。
关键词：噬菌体展示，随机肽库，淘选，凝血酶AbstractThrombin as target molecule, and with the new bio-technique of phage display and biopanning, 3 special binding peptide clones were selected out from a phage-displayed random 15-peptide library. The sequence of the clone, which had the highest affinity with thrombin, has been determined. Data of ELISA showed that all the three clones could be combined to thrombin to some extent. And all of them could compete with hirudin, which is the natural inhibitor of thrombin.Key words: phage display, random peptide library, biopanning, thrombin一、前言噬菌体展示随机多肽库噬菌体展示随机多肽库技术是以噬菌体展示技术（phage display）为基础的。
噬菌体展示技术
噬菌体展示技术吴楚1,诸慧2 (1.温州大学生命与环境科学学院,浙江温州325027;2.温州科技职业学院,浙江温州325000)摘要 概述了噬菌体展示技术的基本原理,常用的噬菌体表面展示系统以及噬菌体展示技术的应用、展望等方面,并在抗原表位分析和疫苗的研制、人工抗体、多肽药物的开发等方面,进行了探讨。
关键词 噬菌体;展示技术;亲和富集法筛选中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2009)03-00990-03基金项目 温州大学科研项目(2003Y 31);温州市科技计划项目(G 20204084)。
作者简介 吴楚(1974-),男,浙江温州人,讲师,从事环境微生物学研究。
收稿日期 2008211206 噬菌体展示技术(Phage Display T echniques ,PDT )是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并展示在其表面,同时将遗传密码信息整合到噬菌体的基因组中的一种技术。
该技术的主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒内,即在噬菌体的表面展示特定蛋白质,而在噬菌体核心DNA 中则含有该蛋白的结构基因。
另外,这项技术把基因表达产物与亲和筛选结合起来,可以利用适当的靶蛋白将目的蛋白或多肽挑选出来。
随着肽展示库展示内容的多样化及展示库质量的提高,人们利用目标蛋白来筛选噬菌体展示库,能很容易获得相应的配体,通过分析所获肽段的序列及结构,就能准确地分析出蛋白分子间,如抗原抗体反应、受体与配体、酶与底物之间的相互作用机制及相应分子的特征。
因此,自1985年G eorge S m ith 首次将外源抗原决定簇与丝状噬菌体的次要外壳蛋白融合以来[1],噬菌体展示被用于免疫学、细胞生物学及药物开发等领域,成为生物学后基因组时代一个强有力的实验技术。
1 噬菌体展示技术的基本原理噬菌体展示技术是一种将基因表达产物和亲和筛选相结合的技术[2],它以改构的噬菌体为载体,把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质的基因,使其基因表达产物在噬菌体表面展示,进而通过亲和富集法筛选有特异肽或蛋白质的噬菌体。
应用噬菌体展示随机12肽库筛选诺如病毒抗原模拟表位
应用噬菌体展示随机12肽库筛选诺如病毒抗原模拟表位周飞园1王璐1△梁芷妍1林璧慧2李佳恒1王宇1井多娜1张绪富2戴迎春1（1.南方医科大学公共卫生学院流行病学系，广州 510515；2.南方医科大学中医药学院，广州 510515）中图分类号R392.11 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2024）02-0383-06［摘要］目的：利用Ph.D.-12噬菌体展示肽库筛选诺如病毒（NoV）的抗原模拟表位。
方法：包被与GⅡ.4、GⅡ.6、GⅡ.17型NoV具有高特异性及中和能力较强的单链可变片段抗体（scFv），用Ph.D.-12噬菌体展示肽库进行3轮生物淘选。
ELISA鉴定淘选所得噬菌体与scFv的结合活性及其与NoV P蛋白的竞争作用；阳性克隆测序后进行生物信息学分析，合成多肽鉴定其抗原性。
结果：发现1段与GⅡ.6 VP1区同源性较高的氨基酸序列“MG-D-W”，综合分析提示其可能为GⅡ.6 NoV的抗原模拟表位，且合成的包含“MG-D-W”的多肽可竞争抑制P蛋白与人类组织血型抗原（HBGAs）受体的结合。
结论：“MG-D-W”是与NoV单链抗体高亲和力的肽段，可能模拟了GⅡ.6 NoV与scFv结合的抗原表位。
［关键词］诺如病毒；12肽库；抗原模拟表位；单链可变片段抗体Screening antigen mimic epitope of Norovirus by phage random 12-peptide libraryZHOU Feiyuan1， WANG Lu1△， LIANG Zhiyan1， LIN Bihui2， LI Jiaheng1， WANG Yu1， JING Duona1，ZHANG Xufu2，DAI Yingchun1. 1. Department of Epidemiology， School of Public Health， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China； 2. School of Traditional Chinese Medicine， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China ［Abstract］Objective：To screen mimic epitope of Norovirus （NoV） by Ph.D.-12 phage display peptide library. Methods：Sin‐gle-chain variable fragment antibody （scFv） with high specificity and neutralizing ability against GⅡ.4/GⅡ.6/GⅡ.17 NoV were coated and screened for 3 rounds with Ph.D.-12 phage library. ELISA was used to identify binding activity of phage with scFv and its competi‐tion with NoV P protein. Positive clones were sequenced and bioinformatic analysis was performed， antigenicity was identified by syn‐thetic peptides. Results：A sequence was found to be with highly homologous to GⅡ.6 VP1 region： MG-D-W， suggesting that it was a specific epitope of GⅡ.6 NoV. Peptide containing "MG-D-W" was further synthesized， which could competitively inhibit binding of P protein to HBGA receptor. Conclusion：MG-D-W is a peptide with high affinity for NoV scFv and likely mimics antigenic epitope of GⅡ.6 NoV bound to scFv.［Key words］Norovirus；12-peptide library；Antigen mimic epitope；Single-chain variable fragment antibody诺如病毒（Norovirus，NoV）是导致非细菌性胃肠炎散发及暴发的主要病原体，约占全球急性胃肠炎发病率的1/5［1］。
噬菌体展示随机肽库技术的医学研究应用
噬菌体展示随机肽库技术的医学研究应用史云龙;刘永明【摘要】噬菌体展示随机肽库是将编码外源性多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白基因,产生由数十亿种随机肽段与噬菌体外壳蛋白以融合形式呈现在噬菌体表面的重组噬菌体库.近年来,噬菌体展示随机肽库已成为筛选蛋白和多肽的重要生物技术,并被广泛应用于医学研究.笔者就其在肿瘤和自身免疫性疾病研究以及疫苗研制中的应用现状进行综述.【期刊名称】《华夏医学》【年(卷),期】2016(029)003【总页数】5页(P171-175)【关键词】噬菌体展示随机肽库;多肽筛选;抗原表位【作者】史云龙;刘永明【作者单位】桂林医学院生物化学与分子生物学教研室,广西桂林541004;桂林医学院生物化学与分子生物学教研室,广西桂林541004【正文语种】中文【中图分类】R37;R392.33噬菌体展示随机肽库（phage display random peptide library，PDPL）技术诞生于20世纪80年代。
1985年，Smith将源自限制性内切酶EcoRI的基因片段插入丝状噬菌体的基因Ⅲ中，得到了在外壳蛋白中融合表达该基因片段编码多肽的重组噬菌体颗粒[1]。
这些融合表达的EcoRI肽段可被EcoRI抗体所捕获，表明展示在噬菌体外壳表面的外源性蛋白与天然蛋白有着相同或相近的空间结构和生物活性。
1990年，Scott等[2]成功将PDPL技术应用于抗原表位的筛选。
目前，噬菌体展示随机肽库已是包含数十亿个随机肽段序列的大容量肽库，对蛋白靶分子而言是一种丰富的资源库。
30多年来，PDPL已发展成为筛选蛋白和多肽的重要生物技术，并被广泛应用于医学研究。
PDPL是将编码外源性多肽的DNA序列插入噬菌体外壳蛋白基因，产生由数十亿种随机肽段与噬菌体外壳蛋白以融合形式呈现在噬菌体表面的众多重组噬菌体。
PDPL作为一项新的技术平台，其特点，一是首次有能力通过基因信息与蛋白质功能无缝连接的方式同时研究众多的蛋白质变异体，并已被广泛而有成效地用于探索受体与配体相互作用结合位点、寻找高亲和力配体分子等蛋白质与蛋白质相互作用的研究[3]；二是不仅能筛选天然蛋白质上的线性抗原表位，而且还能筛选天然蛋白质不存在的模拟表位[4]。
噬菌体培养试剂盒产品说明书(中文版)主要用途
用转导。
产品内容
培养液（Reagent A） 裂解液（Reagent B） 稀释液（Reagent C） 固养液（Reagent D） 胶顶液（Reagent E） 产品说明有 固养液（Reagent D）的 90mm 直径的细菌培养板，确保铺满整个表面
放进 37℃培养箱孵育 16 小时：可见透亮区域的为噬菌斑
放进 4℃冰箱里
计数噬菌斑
计算噬菌体原液和繁殖效价以及噬菌体感染复数（multiplicity of infection；MOI）
噬菌体效价（PFU/毫升）＝
1
台式离心机：用于沉淀细胞或残渣
实验步骤
一、 噬菌体繁殖
1、 移取 xx 毫升 培养液（Reagent A）到无菌的 125 毫升三角烧瓶 2、 加入 100 微升用户自备的过夜新鲜培养的敏感宿主细菌（例如 1 X 108/毫升） 3、 放进 37℃摇床孵育 1 小时，速度为 220RPM 4、 加入 100 微升用户自备的P1 噬菌体，总量为 5 X 109 5、 放进 37℃摇床孵育 2 小时，速度为 220RPM，或可见明显的细胞溶解 6、 转移上述培养噬菌体到新的无菌的 15 毫升锥形离心管 7、 加入 xx 毫升 裂解液（Reagent B） 8、 盖上盖子，上下反复倾倒混匀 30 秒 9、 放进台式离心机离心 15 分钟，速度为 10000g 10、移取上清液相到新的无菌的 15 毫升锥形离心管 11、加入 xx 微升 裂解液（Reagent B） 12、即刻放进 4℃冰箱里保存 13、或即刻进行各种后续操作
2
管号 1 2 3 4 5 6 7
噬菌体展示技术
噬菌体展示的应用
•抗原表位分析 •发现特异性抗体 •新疫苗、多价疫苗的开发
淘选过程中常见问题及解决方案
谢谢
• Helper phage：提供噬菌体质粒复制、合成ssDNA和 病毒包装所需要的所有蛋白和酶。
筛选的方法－亲和淘选
直接包被淘选法： 直接将靶分子包被在固相表面 优点：简单直接。 缺点：偶尔会导致配体结合位点难以进入 可能是由于分子的立体封阻 或者是靶分子表面的部分变性而引起 液相淘选法： 将靶蛋白与噬菌体抗体库先结合，之后再亲和捕获靶分子-噬菌体
pIII展示 单价展示 亲和力高
主要应用于抗体库
噬菌体展示技术流程
噬菌体抗体库的构建
建库：[例子]
噬菌体质粒-phagemid
• 噬菌体质粒特征： • 携带有欲在噬菌体上融合展示的外源蛋白基因和pIII基
因，没有其他噬菌体基因。 • 有包装序列信号。（packing signal）
• 有供筛选的抗生素标记基因。
6. 感染后1小时内平均每个细胞 分泌1000个噬菌体
次要外壳蛋白 pIII
1. 406 aa 组成，5个拷贝，位于噬菌 体的尾部。
2. 由三个功能区组成： • N1 穿膜区：作用于E.coli细胞膜上
的TolA蛋白；与噬菌体的入侵有关。 • N2 受体结合区：负责结合F菌毛。 • CT 疏水区：组装前黏附在细菌内
pIII展示和pVIII，如果太大会影响噬菌体壳蛋白的组 装。
• pIII只要不影响感染，可以展示更大的多肽及蛋白。
• 丝状噬菌体展示系统一般是在外壳蛋白pIII或pVIII的N端融合 表达外源多肽及蛋白。
pVIII展示 多价展示
噬菌体展示肽库说明书
-96 gIII sequencing primer 5´- HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG –3´, 100 pmol, 1 pmol/µl
-28 gIII sequencing primer 5´- HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C –3´, 100 pmol, 1 pmol/µl
Introduction
Phage display describes a selection technique in which a library of peptide or protein variants is expressed on the outside of a phage virion, while the genetic material encoding each variant resides on the inside (1-3). This creates a physical linkage between each variant protein sequence and the DNA encoding it, which allows rapid partitioning based on binding affinity to a given target molecule (antibodies, enzymes, cell-surface receptors, etc.) by an in vitro selection process called panning (4). In its simplest form, panning is carried out by incubating a library of phage-displayed peptides on a plate (or bead) coated with the target, washing away the unbound phage, and eluting the specifically bound phage (Figure 1). The eluted phage are then amplified and taken through additional binding/amplification cycles to enrich the pool in favor of binding sequences. After 3–4 rounds, individual clones are characterized by DNA sequencing and ELISA.
噬菌体展示技术解析
噬菌体展示技术解析噬菌体展示技术经过近20年的发展与完善，已被广泛应用于抗原抗体库的建立、药物设计、疫苗研究、病原检测、基因治疗、抗原表位研究及细胞信号转导研究等。
噬菌体展示系统模拟了自然免疫系统，使我们有可能模拟体内抗体生成过程，构建高亲与力抗体库。
由于噬菌体展示技术实现了基因型与表型的有效转换，使研究者在基因分子克隆基础上实现了蛋白质构象体外控制，从而为获取具有良好生物学活性的表达产物提供了强有力手段。
另外，噬菌体展示技术已成为不经过免疫获取特异性人源抗体的新途径，为获取对人类与动物疾病有诊断与治疗价值的单克隆抗体提供了重要手段。
应用面这么高大上，那么原理到底是什么呢？那接下来将由小编为您揭开其神秘的面纱！一、噬菌体展示技术的原理噬菌体展示技术（phage display）是将多肽或蛋白质的编码基因插入噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳蛋白融合表达，融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬菌体表面。
展示到噬菌体表面的多肽或蛋白保持相对独立的空间结构与生物活性，可以与靶分子结合与识别。
噬菌体展示的肽库或蛋白库与固相抗原结合，洗去未结合的噬菌体，然后用酸碱或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中与后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶分子的噬菌体比例，最终获得识别靶分子的多肽或者蛋白。
下图粗略展示了技术筛选的过程：二、噬菌体展示系统的分类1.M13噬菌体展示系统M13噬菌体属于单链环状DNA病毒，其基因组为6.4 kb，编码10种蛋白，其中5种为结构蛋白，包括主要衣壳蛋白的PⅧ与次要衣壳的pⅢ、pⅥ、PⅦ与PⅨ。
其中，pⅢ与PⅧ是噬菌体展示中最常用的两种蛋白，构建了pⅢ与PⅧ展示系统。
pⅢ蛋白分子量为42 kDa，分布在噬菌体颗粒的一端。
一般一个噬菌体有3-5个拷贝的pⅢ蛋白，可在N端的柔性连接区插入外源蛋白或者多肽。
Phage display 噬菌体展示技术ppt课件
Introduction
• Invented by George P. Smith in 1985. • A method for the study of – protein–protein, protein–peptide, and protein-DNA interactions
Applications
• Determination of interaction partners of a protein. • Determine tumour antigens (for use in diagnosis and therapeutic targeting). • Searching for protein–DNA interactions using specially-constructed DNA libraries with randomised segments. • In vitro protein evolution (also called protein engineering). • Drug discovery. • Finding new ligands (enzyme inhibitors, receptor agonists and antagonists) to target proteins.
Life Cycle of M13
M13 pIII & pVIII Coat-Protein System
• pIII minor Coat-Protein – Consist of 406 aa, 5 copies per phage. – Located at the tail of the phage. – Can display 300aa protein. • pVIII major Coat-Protein – 2700 copies per phage, 10% can used for display. – ~200 copies of fusion proteins per phage. – Proteins are usually small. – High affinity abilities because of high copy numbers.
免疫学基础：第五章 噬菌体展示技术及其应用
1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选溶 菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一 个广力。
2021/7/17
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以改构的噬菌体为载体，
cDNA基因片段定向插入 噬菌体外壳蛋白基因区，
使外源蛋白表达并展示 于噬菌体表面，
通过亲和富集法筛选 表达有特异蛋白质的噬菌体。
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产品概况 载体
T7Select415-1 T7Select1-1 * T7Select1-2 a, b & c T7Select10-3b*
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L H
图3.5轻链和重链插入pComb3 流程
2021/baI 双酶切的人抗体轻链 PCR产物与用相同内切酶酶切、去磷酸化的pComb3载 体，16℃连接，用该连接产物进行电转化，根据1μl和 10μl菌液铺平板所长出来的菌落数，可推算出人抗体 轻链的库容量。2021/7/17
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噬菌体cDNA展示技术的应用
1 用于模拟表位的研究。
2 用于DNA、RNA结合蛋白的研究。
3 用于蛋白-蛋白相互作用的研究。
4 用于非蛋白小分子与蛋白相互作用的研 究。
5 细胞与蛋白相互作用的研究。
6 酶作用底物的分析、先导化合物的发现、 定位信号转导途径等。
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- In vivo use of phage libraries. Initially the phage library is injected in the circulation. Next, phage is allowed to circulate for minutes or hours (in this case when internalized phages are to be recovered). Finally, after deep anesthesia, mice are euthanized and the organs are dissected for phage recovery and peptide sequencing.
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目录简介 (2)培养基和溶液 (5)常规M13方法 (6)淘选程序（固定靶分子） (8)结合克隆的特征 (12)其他淘选方法（液相结合法） (15)其他抗原表位作图方法（Protein A/G捕获法） (16)附录：优化肽结合相互作用 (19)文库的氨基酸分布 (21)试剂盒组成：（如无特殊说明，试剂盒中所有成分均需-20℃保存）：•随机十二肽噬菌体展示文库100 µl, 1.5×1013 pfu/ml。
贮存于含50%甘油的TBS溶液中。
复杂度~2.7×109个转化子。
•-28 gIII测序引物5’-HOGTA TGG GAT TTT GCT AAA CAA C-3’, 100 pmol, 1 pmol/µl •-96 gIII测序引物5’-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’, 100 pmol/µl, 1 pmol/µl •E.coli ER2738宿主菌F’lacIq Δ(lacZ)M15 proA+B+ zzf::Tn 10 (TetR)/fhuA2 supE thi Δ(lac-proAB) Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk –m k–McrBC–)。
该菌株以含50%甘油的菌体培养物形式提供，非感受态细胞。
贮存于-70℃。
•链霉亲和素Streptavidin, 冻干粉1.5 mg•生物素，10 mM 100 µl Ph.D.TM是New England Biolabs, Inc. 的注册商标。
概述噬菌体展示是一项选择技术，它将外源多肽或蛋白与噬菌体的一种衣壳蛋白融合表达，融合蛋白将展示在病毒颗粒的表面，而编码这个融合子的DNA则位于该病毒粒子内。
噬菌体展示技术使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子（抗体、酶、细胞表面受体等）的多肽配体通过一种被称为淘选（panning）的体外选择程序得以快速鉴定。
最简单的淘选程序，是将噬菌体展示肽库与包被有目的靶分子的平板（或磁珠）共温育，先洗去未结合噬菌体，然后洗脱特异性结合的噬菌体。
被洗脱的噬菌体进行扩增，然后再进行下一轮的结合/扩增循环，以富集那些可结合序列。
经3-4轮淘选后，通过DNA测序对每个可结合克隆进行定性。
展示在噬菌体表面的随机肽库可应用于许多方面(3)，包括绘制抗原表位图谱(4-6)、研究蛋白质-蛋白质相互作用（7）和鉴定非肽配体的肽模拟型（8-11。
）生物活性肽分子的鉴定可以通过对固定在平板上的纯化受体进行淘选（12）也可以在完整细胞上进行淘选（13-15）。
蛋白酶底物的鉴定可通过在随机肽区域的上游加一段亲和tag，然后选用特异性的介质来区分切割和未切割的噬菌体（16）。
另外，大的蛋白质分子[如：抗体（17）、激素（18）、蛋白酶抑制剂（19）、酶（20）和结合蛋白（21）]也可展示在噬菌体上，通过对随机突变文库的筛选，分离出各种具有亲和力或特异性改变的变异株。
Ph.D.-12噬菌体展示肽库试剂盒将随机十二肽融合到M13噬菌体次要衣壳蛋白(pIII)上，因而是一个组合文库。
所展示的十二肽表达在pIII的N末端，即：成熟蛋白的第一个氨基酸就是随机十二肽的第一个氨基酸, 十二肽后面是一段短小的间隔多肽，由Gly-Gly-Gly-Ser 组成，然后是野生型pIII蛋白。
该文库含有~2.7×109个电转化序列，用10 µl本品提供的噬菌体进行扩增，每个序列一次可产生~55个拷贝，对原始文库进行大量测序（见附录）表明该文库序列具有广泛的多样性，无明显的残基位置偏嗜。
建议不要扩增原始文库来进行另外的淘选试验，因为一旦再扩增便会出现序列偏嗜现象。
NEB应用本品分别鉴定出了与链霉亲和素和单克隆抗体相结合的共有结合肽序列（见图2）。
大量实验证明，任何情况下该文库的复杂度都足以产生多个可编码相同肽基序的DNA序列。
图2用Ph.D.-12肽库测定抗原决定簇。
用抗?-内啡肽单克隆抗体对Ph.D.-12展示肽文库进行液相淘选，然后用ProteinA-琼脂糖（第1和第3轮淘选）或Protein G-琼脂糖(第2轮淘选)亲和捕获抗体-噬菌体复合物。
每轮淘选所选到的结合序列与R-内啡肽的前12个氨基酸残基序列比较列于上图内，共有序列元件用方框示出。
结果清楚地显示该抗体的抗原决定簇序列落在R-内啡肽的前四个氨基酸残基（YGGF）处，在第三位有一定的可变性。
第三轮筛有一个筛选到的克隆无插入子。
培养基和溶液LB培养基：每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl。
高压灭菌，室温贮存。
LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+ 15 g/L琼脂粉。
高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml IPTG/Xgal*，混匀倒平板。
平板4℃避光贮存。
顶层琼脂：每升含：10 g Bacto-Tryptone，5 g yeast extract, 5 g NaCl, 1 g MgCl2·6H2O, 7 g 琼脂粉。
高压灭菌，分成50 ml等份。
固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。
四环素贮液：以20 mg/ml的浓度溶于乙醇中。
-20℃避光贮存。
用前摇匀。
LB-Tet平板：LB培养基+ 15 g/L琼脂粉。
高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1 ml四环素贮液，混匀倒平板。
平板4℃避光贮存，如果平板显棕色或黑色请勿用。
封阻缓冲液：0.1 M NaHCO3 (pH 8.6), 5 mg/ml BSA, 0.02% NaN3。
过滤除菌，4℃贮存。
TBS: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl。
高压灭菌，室温贮存。
PEG/NaCl: 20% (w/v) PEG-8000, 2.5 M NaCl。
高压灭菌，室温贮存。
碘化物缓冲液：10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaCl。
室温避光贮存。
链霉亲和素贮液：将1.5 mg链霉亲和素冻干粉（本试剂盒提供）溶于1 ml 10 mM磷酸钠(pH7.2)、100 mM NaCl、0.02% NaN3溶液中。
4℃或-20℃贮存，避免反复冻融。
*IPTG/Xgal配方：将 1.25 g IPTG (isopropyl β–D-thiogalactoside)和 1 g Xgal(5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside)溶于25 ml二甲基甲酰胺中。
溶液-20℃避光贮存常规M13方法M13不是一个裂解性噬菌体，噬菌斑的形成不是由于菌体裂解而是由于细胞生长力减弱所致，因此其噬菌斑是浑浊的而不是清亮的。
菌株保存1. 本试剂盒提供的宿主菌是一个强F+菌株，生长迅速，特别适合于M13噬菌体的增殖。
尽管ER2738是一个recA+菌株，但我们在使用M13或噬菌粒载体的过程中从未发现有体内重组现象发生。
其他F+的商品菌株如：DH5αF’和XL1-Blue或许可以代替ER2738应用,但未曾用本系统检验过。
2. 由于M13是一个雄性特异性大肠杆菌噬菌体，建议用于M13增殖的所有菌液都是从F 因子正向选择培养基上挑菌接种的，而不是直接从本试剂盒提供的甘油菌接种培养的。
ER2738的F因子上含有一个小转座子，赋予该细胞四环素抗性，因此可以在含四环素的平板上铺板筛选含F因子的细胞。
3. 从随产品提供的ER2738甘油菌划线接种LB-Tet平板，倒置平板37℃培养过夜。
用封口膜封闭平板后4℃避光保存，最长可达一个月。
4. 用于感染噬菌体的ER2738菌液既可以在LB也可以在LB-Tet培养基中生长。
只要不对培养物进行连续稀释，在非选择性培养基中F因子的丢失并不严重。
避免噬菌体污染M13噬菌体的衣壳蛋白pIII通过与受体菌的F性纤毛相结合而介导感染。
与野生型噬菌体相比，外源蛋白或多肽融合在pIII蛋白的N端展示明显降低了文库噬菌体的感染力。
因此，当有任何野生型噬菌体污染时，每轮淘选试验之间的扩增步骤会强烈倾向于扩增野生型噬菌体，如果同时没有一个强有力的体外噬菌体结合选择程序来避免，即使痕量水平的污染也会在三轮淘选后使淘选出的噬菌体多数为野生型。
1. 在本手册所述的所有步骤中均使用带滤芯吸头，可以使污染外界环境中噬菌体的可能性大大降低。
2. 由于文库噬菌体源于常规克隆载体M13mp19，其含有lacZα基因，当铺在含IPTG和Xgal 的平板上时，噬菌斑将呈蓝色。
而外界污染的丝状噬菌体在同样的平板上将呈白色噬菌斑，同时这些噬菌斑还会比文库噬菌体的噬菌斑更大更模糊。
因此所有的滴度检测步骤，建议一定要在LB/IPTG/Xgal培养基上铺板，如果有白色噬菌斑，则只挑取蓝色噬菌斑进行测序。
测定噬菌体滴度只有当噬菌体的感染复度MOI (multiplicity of infection)值远低于1时（即细胞过量时），噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。
正因如此，建议检测噬菌体贮液的滴度时，在感染前进行稀释，而不是在高MOI值的情况下稀释被感染的细胞。
低MOI值有助于确保每个噬菌斑仅含一个DNA序列。
1. 接种ER2738单菌落于5-10 ml LB培养基中，摇床培养至对数中期（OD600 ~0.5）。
2. 细胞生长时，微波炉融化上层琼脂，分成3 ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。
保存于45℃备用。
3. 37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。
4. 在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。
建议稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：108-1011；未扩增的淘选洗脱物：101-104。
每个稀释度换一新鲜吸头，建议使用带滤芯吸头以避免交叉污染。
5. 当菌体培养物达对数中期，分成200 µl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。
6. 每管加入10 µl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5 min。
7. 将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。
适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。
8. 待平板冷却5 min后，倒置于37℃培养过夜。
9. 检查平板，计数有~102个噬菌斑的平板上的斑数。
然后用此数目乘以稀释因子即得到每10 µl噬菌体的空斑形成单位（pfu）滴度。
淘选程序最简单直接的淘选方法有：直接将靶分子包被于塑材表面（通过非特异的疏水作用或静电相互作用），洗去过量的未吸附分子，然后将噬菌体库覆盖在已包被的靶分子的表面。
根据靶分子的不同，直接包被法偶尔会导致配体结合位点难以进入，这或许是由于分子的立体封阻或许是由于靶分子表面的部分变性而引起。