花药培养

试管苗移栽及环境调控
幼苗出瓶操作过程要小心仔细，可在容器中加适量水后， 用玻璃棒轻轻搅动后倒出，再用镊子夹取，取出的幼苗用水 将根部的琼脂等冲洗干净，移栽至苗床。
实践操作
外植体选准备 花粉植株鉴定
诱导花粉脱分化、分裂
花药培养技术
驯化和移栽
分化、壮苗培养
完整植株形成
问题探究
什么是花药花粉培养？
小孢子的发育时期 单核期：单核早期，单核晚期； 双核期：双核早期，双核晚期； 三核期：三核型花粉植物。
营养细胞 生殖细胞 精子
雄配子体的发育
小孢子不同发育时期对胚状体和愈伤组织诱导率的影响
愈伤组织诱导率：
葡萄为例，四分体期为15％，单核期为1％，双核期为0。
梨四分孢子期为26.3％，单核－双核期为40％。
分化培养：根据培养目的，调节植物激素
分化培养：降auxin,提cytokinin--有利于芽的形成 壮苗培养：同时下降，有利于胚状体的正常生长。
蔗糖种类和浓度的筛选
花药离体培养中维持培养基渗透压主要依赖于糖，启动小 孢子细胞脱分化对糖的要求，单子叶植物比双子叶植物高。
3w 8w
石刁柏花药培养中，对多细胞花粉粒的诱导效果
.
花粉是植物的生殖器官，花粉细胞是通过减数分裂而来，因此， 花粉细胞内只含有正常植株染色体组数的一半。 几个染色体组就是几倍体，如：
八倍体
六倍体 四倍体 二倍体
单倍体
单倍体 单倍体 单倍体
四倍体
三倍体 二倍体 一倍体 单倍体
为什么多数植物采用单核期花粉培养容易成功？
（一）花粉发育时期：
1、适宜时期：单核期,尤其是单核中、晚期(单核靠边期) 选择合适的花粉发育时期是提高花粉植株诱导成功率的重 要因素，并非任何时期的花粉都能诱导出花粉植株，只有花粉 发育到一定的时期，才对离体培养敏感，对大多数植物而言， 适宜的花粉时期是单核期，尤其是单核中、晚期。
花粉粒（也称小孢子）
是由花粉母细胞经减 数分裂形成。它的染 色体数目为体细胞的 一半，为单倍体细胞。
• Anther—花粉囊 style—花柱 Anther—花粉囊 style—花柱 • Pollen— 花粉 stigma—柱头 • Filament– 花丝 egg cell—卵细胞 Filament– 花丝 egg cell—卵细胞 • Embryo sac– petal—花瓣 petal—花瓣 胚囊 ovary—子房 • ovary—子房 secundarysecundary-Receptacle—花托 • Receptacle—花托 sepal—萼片 • Embryo sac nucleus—胚囊核 EmbryoGerminating pollen– 发芽的花粉 sac nucleus—胚囊核 staminode—退化雄蕊 • ovule—胚珠 Germinating pollen– 发芽的花粉
配制草莓花药培养的培养基
任务3
任务2
花蕾表面消毒、花药培养
任务4 任务5
诱导试管苗、鉴定并增殖培养 试管苗移栽和管理
任务1
采集草莓花蕾、检查花粉的发育时期
一、检查花粉的发育时期（材料选择）
单核靠边期的花药。 方法：从田间采集花蕾数个，从每花蕾1～2枚花药于
载玻片上，加醋酸洋红1～2滴，用玻棒或镊子将花药
倒去消毒液后用无菌水冲洗4次。
接种：用消过毒的镊子或接种环将花药接种于愈伤诱导 培养基上。接种密度宜高。
接种后将材料放置培养室内进行培养，温度为25℃，光 强1000～3000 lx，每日光照12小时。培养15～20d后，花药
开始产生愈伤组织，待愈伤组织长至2～4mm时，转入芽分化
培养基（MS+6BA0.5mg/L+KT0.5mg/L）。
花粉植株的形态发生方式？
1、器官发生型 花粉-----多细胞花粉粒----细胞团 （愈伤组织）-----继代培养-----单 倍体植株。
2、胚状体发生型
花粉-----多细胞花粉粒----进一步培 养----胚壮体-----释放-----植物体。
花粉培养过程
花粉培养 从花药中游离出花粉粒，通过培养使花粉粒脱分 化启动发育为单倍体植株的技术。 特点: 它可以避免花药壁、药隔及花丝等体细胞愈伤 组织的干扰，可以获得大量的花粉植株。 花粉的分离与纯化： 分离法：自然散落法、挤压法、机械游离法（磁力搅拌） 纯 化：用不同孔径的无菌筛子除杂。
压碎，剔除碎片，加盖盖玻片镜检（压片染色法）。 观察几个视野，若多数花粉只有一个核并被挤向一侧， 即为单核靠边期，表明此时花药适合作外植体。
通常花粉单核靠边期的草莓花蕾形态是：未
开放，花萼略长于花冠或花冠刚露白，花冠白色
或淡绿色且不松动，花药微黄而充实。
（二）材料预处理 将从田间采集的花蕾，用湿纱布包好 放塑料袋中，扎好袋口，置4℃左右 冷藏箱中放置24～48小时。
单倍体植株的染色体加倍
单倍体植株染色体的加倍方法： 1.自然加倍 2.人工加倍 3.从愈伤组织再生
草莓
1）人工诱导染色体加倍常用化学诱导方法，有秋 水仙素、富民农、对二氯苯、8-羟基喹啉等。 秋水仙素是由地中海生长的一种百合科植物秋水 仙的种子和球茎提取出来的物质。能溶于水、酒 精，可阻止细胞有丝分裂时纺锤丝的形成。 （1）小苗浸泡加倍 （2）顶芽或腋芽处理加倍 （3）培养基加倍
单倍体植物(haplobiont)
单倍体细胞在人工离体条件下培养，使其单性发育成植物
体。这种具有单套染色体的植物称为单倍体植物。
单倍体概念的理解
1、单倍体内含有的染色体组数同配子体一样。 2、单倍体是一个相对的概念，是相对正常植株而言的。 3、单倍体不一定就是一倍体，它可以是二倍体、三倍体或更高 倍体。
② 提高常规育种的效率 ③有利于隐性性状的选择 ④快速获得自交系的超雄株
⑤其他：如提纯复壮
控制杂种分离，短育种年限，加速F1代杂合体的纯化
提高常规育种的效率
提高常规育种的效率
2
有利于隐性性状的选择
A
பைடு நூலகம்速获得自交系的超雄株
单倍体育种的研究进展
1964年，印度Guha和Maheshwari对毛叶曼陀罗的花药 进行培养并获得了单倍体植株，从此以后，这项技术被迅 速推广。
微室培养
培养基
基本培养基 植物种类不同对培养基的要求不同。如：
值得一提的是培养基中高浓度的NH4+显著抑制花粉 愈伤组织形成。铁对花粉胚发育很重要。
植物激素的种类和浓度 必须结合植物种类和器官发生方式来考虑
细胞分裂素和CM促进花粉分化成胚状体，生长素类尤其 是2,4-D促进愈伤组织形成，但2,4-D抑制愈伤组织分化 成胚状体。
任务4
诱导试管苗、鉴定并进行增殖培养
草莓花药培养自然加倍频率很高，尤其是继代培养的材 料，因而可不进行人工加倍处理。
任务5
试管苗驯化和移栽
将高2～3cm，根系发达的小植株移入温室，打 开瓶盖炼苗3d。然后洗去培养基，即可移栽。 疏松通气、适宜的保水性、清洁卫生是组培 苗对基质的基本要求。
任务6
任务2
配制草莓花药培养的培养基。 愈伤组织诱导：丰香、明宝 B5或MS+BA2.0+KT2.0+IAA4.0 分化培养： MS+BA2.0+ZT2.0+NAA0.2 诱导生根： 1/2MS+NAA0.1
任务3
花蕾表面消毒、花药培养
材料消毒：将接种材料用自来水洗干净20min，用无菌
纸轻轻擦干。然后将材料放入已消毒过的广口瓶内，加入 70%酒精浸润30s，倒去酒精，再倒入0.1%升汞消毒8min，
植物组织培养
项目六
草莓花药培养
主讲：蔡建秀 职称：教授
邮箱：jxcqz57@163.com
泉 州 师 范 学 院生物 江苏农林职业技术学院
项目六
草莓花药 培养
教学内容
教学目标 工作任务 实践操作 问题探究 知识拓展 作 业
教学目标
教学终极目标
会草莓花药培养和脱毒苗快速繁殖
促 成 目 标
会采集合适的草莓花蕾做为外植体消毒灭菌 能剥取花药诱导愈伤组织并分化小苗、继代增殖 能对花药培养试管苗染色体观察 会进行试管苗驯化、移栽
通过胚状体产生的花粉植株，几乎都是单倍体。而经
过愈伤组织产的花粉植株中不少是二倍体。愈伤组织
2）经染色体组型分析，花药培养中发现 继代培养时间愈长，二倍体的比例愈高。 有非单倍体植株的存在。
3）激素对倍性变化有很大影响。
单倍体的鉴定方法
鉴定花药和花粉植株染色体倍性 的方法有： 1. 形态鉴定 2. 结实性鉴定 3. 染色体数目鉴定 4. 遗传标记鉴定。
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单倍体在植物育种中的应用 1、单倍体育种的概念 指将具有单套染色体的单倍体植物，加倍--纯合二 倍体---选出具有优良性状的个体---繁育成 新品 种；或选出具有单一优良性状的个体---育 种的原始 材料，称之为---单倍体育种
2、单倍体育种的优越性
① 控制杂种分离，短育种年限。加速F1代杂合体 的纯化。
的物质消耗殆尽，因此，小孢子就不能再生成植物体。
花粉发育时期的检测
培养花药之前，需要制片镜检，确定花粉发育时期。进 行细胞学花粉发育时期的镜检。 花粉单核晚期的烟草花蕾花萼与花 （1）压片染色法 （2）压片染色法与花器官形态特征结合法 冠等长 A、醋酸洋红：100ml，45%醋酸水溶液加入250ml烧杯，酒 精灯上加热到沸后，慢慢加入2g洋红粉末，再加热10 Different flower stages as used in anther culture. 分钟，冷却后加入数滴2％的铁明矾溶液（2g硫酸铁 Stage 2 is the optimum stage of development for use in 钾或硫酸铁铵加水至100ml），暗红色即可，滤纸过 tobacco anther culture 滤入棕色瓶中，置冰箱保存。 B、碘－碘化钾：1g碘、2g碘化钾加水稀释至100ml。
项目介绍
草莓（Fragari aananassa Duch）是蔷薇科 草莓属多年生草本植物，果实鲜艳美丽、芳香浓 郁、柔软多汁。且富含糖、蛋白质、磷、钙、铁 及大量维生素和有机酸。除鲜食外，还可以加工 成果浆、果汁、果酒及各种冷饮和速冻食品，深 受广大消费者欢迎。
工作任务
任务1
对向日葵下胚轴和子叶的原生质游离
Pollen— 花粉 Embryo sac– 胚囊 stigma—柱头 sepal—萼片 staminode—退化雄蕊 ovule—胚珠
7天
14天 曼陀罗的花药培养
21
30
40后
什么是单倍体植株？
单倍体细胞
植物进行有丝分裂时，要进行一种特殊的细胞分裂，即 减数分裂。减数分裂后形成的雌、雄配子，其染色体数目为 体细胞的一半。将这种具有单套染色体的细胞称为单倍体细 什么是单倍体植株？ 胞。
添加物
CM 、LH、CH 玉米汁、马铃薯汁、酵 母提取液、氨基酸等对提高花粉愈伤组织 和胚状体诱导率、促进其生长有良好效果。 活性炭能促进胚状体发育，提高花粉植株产 量。主要是吸附培养基中抑制生长的有害物质。
花粉植株的倍性
诱导单倍体植株的倍性
1) 花药培养形成单倍体植株。但花药中 的药壁、药隔等为二倍体组织也可能被诱 导发育成植株。
茄子用270目screen
花粉培养的方式：
平培养：花粉在固体培养基中进行培养，使其形 1. 成花粉胚状体，最终分化为植株。 2. 液体培养: 悬浮培养，通气性差。 3. 双层培养：上-液体+下-固体 4. 看护培养：花粉-滤纸-固体培养基
5. 微室培养：
6. 条件培养：在花药培养基中加入失活的花药提取物。
不同植物种类，诱导愈伤组织和胚状体发生，均有适 宜的小孢子发育时期
原因
（1）小孢子发育的第三期（小孢子经二次有丝分裂形成 成熟花粉）的初期是胚胎形成的临界期。离体培养时， 若小孢子的发育期超越这一时期胚状体就不能形成。 Niesch(1968)提出，小孢子的双核期，淀粉逐渐积累形 成，小孢子就不能再生成植物体。 （2）小孢子发育的过程中，花药内源激素的平衡不断 改变，随着花粉的成熟，激素平衡变得不适合小孢子 的脱分化；或者随着花粉成熟，花粉花粉脱分化必备
花粉和花药的培养(pollen and anther culture)
是指将花粉发育至一定阶段的花药接种在人工培养基上， 改变其正常发育和机能，以形成花粉胚或愈伤组织，不经受 精而发生细胞分裂，进而由单个花粉粒分化成完整单倍体植 株的技术。
目的：诱导产生单倍体植株。
雄蕊结构：花的雄
性器官。包括花丝、 花药两部分。其中 花药部分由药隔 （2n）和花粉粒 (1n)组成。