葡聚糖凝胶G-25的使用方法

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葡聚糖凝胶 Sephadex LH20 使用说明及使用心得

2 100g 填料已不少了，样品如果实在太多，就只好分开上柱了. 3 一般 Sephadex LH20 上样体积具体也没有明确的规定，在柱床体积的 1／10 吧。
问：分得效果不是很好，上了有 8 毫升的样，我用甲醇洗脱，结果用约一个保留体积就洗完了，东西不仅越分越少，而且仍然和没上柱之前差不多，很让人困惑，郁闷。
了 1g 干态的,Sephadex LH20 对不同溶剂中的保留体积： water 2.1ml MeOH 1.9ml EtOH 1.8ml CHCl3 1.6ml n-BuOH 1.6ml 丙酮 0.8ml 乙酸乙酯 0.4ml 甲苯 0.2ml
2 "还有是不是样品的溶解是不是要与洗脱的起使浓度相同?如何确定样品在最佳配比的容液中溶呢?"
不要着急,实验是一点一点做出来的,刚开始总是困难的.首先我要说的是 Sephadex LH20 不是万能的,你的样品不一定适于用它分离,
1 "结果用约一个保留体积就洗完了",这很正常,这也是 Sephadex LH20 这种填料的特点:"洗脱体积一般为 2-3 个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱 5 个保留体积",
3. 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（必须要进行过滤！否则把 Sephadex LH-20 堵塞，就必须将 Sephadex LH-20 的柱头部分弃去，造成不必要的浪费）。
如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
当然有影响,Sephadex LH20 在不同的溶剂中的吸涨程度是不同的(任何填料都是这样,只是 Sephadex LH20 很明显),一般在丙酮，乙酸乙酯中收缩很厉害,所以一般不用丙酮，乙酸乙酯作溶剂,如果前后使用的两种洗脱溶剂对 Sephadex LH20 的吸涨程度相差很大,还会产生大量气泡.以下列举

5 葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质

方法性质亲和层析对配体分子的亲和力吸附层析吸附性质电泳离子交换层析等电荷等电点沉淀盐析有机溶剂沉淀等溶解度透析超滤密度梯度离心凝胶层析等分子大小凝胶层析的基本原理分子大于凝胶孔隙范围的物质
葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
教学目标
了解：层析技术的基本原理;
有效分配系数Kav的计算。
理解：葡聚糖凝胶的选择和准备。掌握：凝胶层析的原理和操作方法;
积Ve有关：
Kav = （Ve — Vo）/（Vt — Vo）
Vt和Vo恒定，Ve随分离物分子量的变化而变化
？思考：为什么分离物分子量越大Kav值越小
葡聚糖凝胶柱层析法的特点
天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。人工合成凝胶：葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。
葡聚糖凝胶（Sephadex）：由许多右旋葡萄糖单位通过 1，6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交联形成不溶水的多孔网状高分子化合物。
溶解度等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等
电荷电泳、离子交换层析等
吸附性质吸附层析
对配体分子亲和层析的亲和力
凝胶层析的基本原理
凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析）指混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离的技术。
凝胶层析的过程
凝胶层析过程的数理关系
适用范围
脱盐、小肽等低分子量蛋白、多肽中、低分子量蛋白、多肽中、高分子量蛋白高分子量蛋白
X：① 交联度。X越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子量产品。反之亦然。
② 吸水量。G-25表示：1g干胶吸水2.5mL，依次类推。
• 本实验中用Sephadex G 50（分离分子量范围 1500~20000），以蒸馏水为洗脱剂。

葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结

凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝
胶
柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。
层析法的基本原理
层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）体系中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。
如盐析（粗分级分离）向蛋白质溶液中加入大量的中性盐[（NH4)2SO4， Na2SO4，Na2SO4]，使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀，这种现象称为盐析。
可见，不同类型的各种凝胶溶涨所需的最少时间是不相同的，请参考有关的技术数据。在凝胶溶涨的处理过程中，不能进行剧烈搅拌，禁止使用电磁搅拌器，以为这样会使凝胶颗粒破裂而产生碎片。
2. 装柱
将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻璃砂板，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长，分离效果越好。但柱过长，层析时间长，样品易稀释造成扩散。

Sephadex G-25 凝胶层析2

Sephadex G-15
Sephadex G-25
粗中粗细超细
Sephadex G-50
粗中粗细超细
Sephadex 中粗
G-75
超细
Sephdex G-100
中粗超细
Sephadex 中粗 G-150 超细
Sephadex 中粗 G-200 超细
干胶颗粒直径/μm
40-120
40-120
凝胶装置图
色谱峰和分离结果
影响凝胶柱层析的主要因素有哪些？
①层析柱的选择与装填层析柱的大小应根据分离样品量的多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无汽泡。
②流动相――洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液，目的是为了防止凝胶可能有吸附作用。其选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解洗脱物质，并不使其变性的缓冲液都可用于凝胶层析。
（1）凝胶处理。将Sephadex G-25 凝胶干粉放入过量水中浸泡24h或沸水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶再静置，戴凝胶沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反复多次。
（2）层析住的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。
（3）装柱。将处理好的凝胶在烧杯内用一倍体积的洗脱液搅拌成悬浮液，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。
补：核黄素
维生素B2，又称核黄素，维他命B2。分子式 C17H20N4O6。它是人体必需的13种维生素之一，作为维生素B族的成员之一，微溶于水，可溶于氯化钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液。维生素B2 是机体中许多酶系统的重要辅基的组成成分，参与物质和能量代谢。
【实验器材与试剂】
（2）离子交换层析(ion exchange chromatography)

凝胶过滤层析如何操作？

凝胶过滤层析如何操作？凝胶过滤层析操作 1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒，使用前必须充分溶胀。

方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入5,10倍的去离子水中，参照相关资料中凝胶溶胀所需时间，进行充分浸泡，然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒，并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡，准备装柱。

在许多情况下，也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，同时排除气泡。

表凝胶型号和层析柱大小与规格及凝胶用量层析柱规格凝胶的规格和用量(g)直径(cm) 高(cm) 容量 (ml) G25 G50 G100 G200 0.9 15 9.5 2.5 1 0.6 0.3 0.9 30 19 5 2 1.2 0.60.9 60 38 10 4 2.5 1.21.6 20 40 10 42.5 1.21.6 40 80 20 8 5.02.41.6 70 140 35 14 9.0 4.4 1.6 100 200 50 20 12.5 6 2.6 40 210 50 20 12 72.6 70 370 90 35 20 122.6 2.6 100 60 530 1 000 130 250 50 110 30 70 17 352.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。

纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25,100倍。

去除盐及游离荧光素约为样品体积的4,10倍。

柱太短，影响分离效果。

柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。

层析柱的内径也要选择适当。

内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。

所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。

对于除盐来说应为1:5,1:25;对于纯化蛋白质来说应为1:20,1:100。

凝胶柱的装填方法和要求，基本上与离子交换柱的制备相同。

一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致，没有空隙和气泡。

不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu

不同分子量蛋白质的分离――凝胶管柱层析法(gel filtration colu实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。

该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。

大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。

凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。

这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。

任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数 Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。

Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。

分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。

通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。

该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。

但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。

测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。

本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。

葡聚糖凝胶G-25的使用方法

葡聚糖凝胶柱的使用方法：(1) 预处理称取Sephadex G-25（50－100目）约5g，加入蒸馏水100ml，置室温下3h进行溶胀。

(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。

柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。

然后将柱垂直安装好，先加入1/3柱体积蒸馏水，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们在柱内自然沉降。

同时大开下口慢速流出蒸馏水。

装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。

否则，必须到出重装，装好后，用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离。

(3) 加样加样前，首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出，直到柱内液面与凝胶表面相齐（或留一极薄液层）为止。

然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要让溶液把凝胶冲松浮起，加完样品后，打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐，再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次，待全部进入层析柱后，即可进行洗脱。

(4) 洗脱与收集洗脱时，用蒸馏水作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。

本实验洗脱液流出的速度应控制在0.8－1.0ml/min。

洗脱液的收集采用分管连续顺序收集，每管收集3ml，共收集10管。

据经验，4或5号管核苷酸浓度最大，可作为层析鉴定的样品液。

但因层析柱长度的差异，管号会有变化，必要时可用紫外检测A260nm，找出浓度最大的管号。

(5) 凝胶的再生和回收凝胶柱使用一次后，必须反冲疏松一次，平衡后再使用。

若使用数次，就需要再生处理。

用0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡，然后用蒸馏水洗至中性备用。

若实验完毕，将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干，再用95%乙醇洗两次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。

实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。

2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

凝胶层析法分离蛋白质

【实验器材】
层析柱洗脱装置试管等普通玻璃器皿
【实验试剂】
待分离样品：1。鸡血红蛋白：取新鲜抗凝全血5ml，于 2000r/min离心10min，弃血浆，用三倍于血球体积的 0.9﹪Nacl溶液洗血球（颠倒混匀）。离心弃去上清液，重复1～2次，至上清液清亮为止。于血球中加入10倍体积的蒸馏水，混匀，使血球破碎，过滤，即得血红蛋白溶液。2。 1mg/ml溴酚蓝溶液 (待分离样品老师已准备好) 葡聚糖凝胶 Sephadex G-25 洗脱液：0.2mol/L NaCl缓冲液
单个凝胶珠本身象“筛子”。不同Байду номын сангаас 型凝胶的筛孔的大小不同。
带网孔的葡聚糖珠小分子进入葡聚糖珠内
大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出
凝胶层析过程示意图
凝胶凝胶基质珠
小分子大分子
凝胶层析过程示意图
总结：
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程较短，移动速度快；所以首先流出。
【操作方法】
一、凝胶的处理
Sephadex G-25干粉置于蒸馏水中室温下溶胀3h，沸水浴加热，再用蒸馏水洗涤几次，将不易沉降的细小颗粒随水倾倒（以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速）。洗涤后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。（凝胶已处理）
二、装柱
A, 将层析柱垂直固定在铁架台上，关闭出口，向柱内加入洗脱液约1cm高，若不漏则证明柱完好。
凝胶层析法分离血红蛋白和溴酚蓝
【目的】
掌握凝胶层析的基本原理学习利用凝胶层析法分离生物大分子和小分子的实验技能
【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。

葡聚糖凝胶G系列使用说明手册

葡聚糖凝胶使用说明Sephadex Gel Manuals1化学和物理性质葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。

G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。

葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。

葡聚糖凝胶有不同的粒度。

超细级的葡聚糖凝胶是用于需要极高分辨率的柱色谱和薄层色谱。

粗级和中级的凝胶用于制备性色谱过程，可在较低的压力下获得较高的流速。

另外，粗级也可用于批量工艺。

1.1化学稳定性葡聚糖凝胶不溶于一切溶剂（除非它被化学降解）。

它在水、盐溶液、碱和弱酸性溶液中都是稳定的，在强酸中凝胶骨架的糖苷键被水解。

长期接触氧化剂将破坏凝胶，因而应避免使用。

1.2物理稳定性葡聚糖凝胶并不熔融，可以在湿态、中性PH进行灭菌。

干态的凝胶加热至120℃以上将开始焦糖化。

葡聚糖凝胶的机械强度取决于交联度。

2产品说明名称分离范围（球蛋白）应用葡聚糖凝胶G-10<700缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子葡聚糖凝胶G-15<1500缓冲液交换、脱盐，分离小分子，去除小分子葡聚糖凝胶G-251000-5000工业上脱盐及交换缓冲液葡聚糖凝胶G-501000-30000多肽分离、脱盐、清洗生物提取液、分子量测定葡聚糖凝胶G-752000-70000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶G-1002000-120000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶G-1505000-300000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定葡聚糖凝胶G-2005000-600000蛋白分离纯化、分子量测定、平衡常数测定3使用方法3.1乙醇浸泡在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干。

3.2无盐水浸泡室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀。

血清清蛋白球蛋白的分离提纯与鉴定

血清清蛋白、γ-球蛋白的分离、提纯与鉴定一、实验目的1.掌握盐析法、凝胶层析法、离子交换层析法分离蛋白质的原理和基本方法；2.掌握醋酸纤维素薄膜电泳法的原理和基本方法；3.了解柱层析技术。

二、实验原理血清蛋白主要由清蛋白和球蛋白组成，各行使其重要的功能。

本实验利用盐析方法将血清中的清蛋白和球蛋白分离，并用电泳技术观察蛋白质分离教果。

1．盐析蛋白质分子能稳定存在于水溶液中是因为有两个稳定因素：表面的电荷和水化膜。

当维持蛋白质的稳定因素破坏时，蛋白质分子可相互聚集沉淀而析出，蛋白质分子沉淀析出的方法很多，根据对蛋白质稳定因素破坏的不同有中性盐析法、有机溶溶剂法、重金属盐法以及生物碱试剂法等。

盐析法的原理是：中性盐如硫酸铵((NH４)２SO4)等对蛋白质作用破坏了蛋白质表面水化膜，并且中和了部分电荷，从而使蛋白质相互聚集而析出。

由于血清中各种蛋白质分子的颗粒大小、所带电荷的多少和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不同，因此调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。

血清球蛋白在半饱和状态下发生沉淀，而血清清蛋白在完全饱和状态下沉淀，利用此特性可把蛋白质分段沉淀下来，即在半饱和的中，血清蛋白不沉淀，而血球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀蛋白加少量蒸馏水即可溶解，由此达到分离清蛋白和白蛋白的目的。

2．脱盐盐析得到的蛋白质含有高浓度中性盐，需要有脱盐过程去除蛋白质遗留的中性盐，常用方法有：透析法脱盐和凝胶层析法脱盐。

本实验采用凝胶层析法脱盐，在葡聚糖凝胶柱中，蛋白质与盐的分子量不同，当样品通过层析柱时，分子量较大的蛋白质因为不能通过网孔而进入凝胶颗粒，沿着凝胶颗粒间的间隙流动，所以流程较短，向前移动速度较快，最先流出层析柱；反之，盐的分子量较小，可通过网孔而进入凝胶颗粒，所以流程长，向前移动速度较慢，流出层析柱的时间较后。

分段收集蛋白质洗脱液，即可得到脱盐的蛋白质。

3.纯化（离子交换层析）离子交换是溶液中的离子和交换剂上的离子进行可逆的的交换过程。

血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定

实训二血清γ-球蛋白的分离纯化与鉴定目的要求1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。

2．掌握盐析法、分子筛层析法、离子交换层析等实验原理及操作技术。

实验原理血清中蛋白质按电泳法一般可分为五类：清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白，其中γ-球蛋白含量约占16％，100ml血清中约含1.2g左右。

首先利用清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中(常用硫酸铵)溶解度的差异而进行沉淀分离，此为盐析法。

半饱和硫酸铵溶液可使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解在溶液中，经离心分离,沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。

用盐析法分离而得的蛋白质中含有大量的中性盐，会妨碍蛋白质进一步纯化，因此首先必须去除。

常用的方法有透析法、凝胶层析法等。

本实验采用凝胶层析法，其目的是利用蛋白质与无机盐类之间分子量的差异。

当溶液通过SephadexG--25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔之中．因此在洗脱过程中，小分子的盐会被阻滞而后洗脱出来，从而可达到去盐的目的。

脱盐后的蛋白质溶液尚含有各种球蛋白，利用它们等电点的不同可进行分离。

α－球蛋白、β-球蛋白的PI<6.0；γ－球蛋白的PI为7.2左右。

因此在PH6.3的缓冲溶液中，各类球蛋白所带电荷不同。

经DEAE(二乙基氨基乙基)纤维素阴离子交换层析柱进行层析时，带负电荷的α－球蛋白和β-球蛋白能与DEAE纤维素进行阴离子交换而被结合；带正电荷的γ－球蛋白则不能与DEAE纤维素进行交换结合而直接从层析柱流出。

因此随洗脱液流出的只有γ－球蛋白，从而使γ－球蛋白粗制品被纯化。

其反应式如下：用上述方法分离得到γ－球蛋白是否纯净，单一？可将纯化前后的γ－球蛋白进行电泳比较而鉴定之。

试剂和器材1．试剂（1）饱和硫酸铵溶液：称固体硫酸铵(分析纯)850g，置于1000ml蒸馏水中，在70一80℃水温中搅拌溶解。

将酸度调节至pH7.2，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。

凝胶色谱仪使用操作规程

凝胶色谱仪使用操作规程一、基本理论(一)分子筛效益一个含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶色谱柱时，各分子在柱内同时进行着两种不同的运动：垂直向下的移动和无定向的扩散运动。

大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布颗粒之间，所以在洗脱时向下移动的速度较快。

小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶相内，在向下移动的过程中，从一个凝胶内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质，从而使样品中分子大的先流出色谱柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，这种现象叫分子筛效应。

具有多孔的凝胶就是分子筛。

各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。

分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，就会全部被排阻在凝胶颗粒之外，这种情况叫全排阻。

两种全排阻的分子即使大小不同，也不能有分离效果。

直径比凝胶最小孔直径小的分子能进入凝胶的全部孔隙。

如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差别，也不会有好的分离效果。

因此，一定的分子筛有它一定的使用范围。

综上所述，在凝胶色谱中会有三种情况，一是分子很小，能进入分子筛全部的内孔隙;二是分子很大，完全不能进入凝胶的任何内孔隙;三是分子大小适中，能进入凝胶的内孔隙中孔径大小相应的部分。

大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。

对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的：分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶孔隙内，而分子的可进入较多的凝胶颗粒内，这样分子较大的在凝胶床内移动距离较短，分子较小的移动距离较长。

于是分子较大的先通过凝胶床而分子较小的后通过凝胶床，这样就利用分子筛可将分子量不同的物质分离。

另外，凝胶本身具有三维网状结构，大的分子在通过这种网状结构上的孔隙时阻力较大，小分子通过时阻力较小。

G25脱盐纯化柱 BP003-1

寡核苷酸的储存
长期保存DNA，可储存于TE缓冲液中，并于-20℃保存。
注意事项
缓冲液：期望将物质置换到的缓冲液洗脱时可以用ddH2O或者TE(10 mmol/L Tris-Cl，1mmol/L EDTA，pH 8.0)。如果长期保存 D研使用。请勿用于医药、临床治疗、食品及化妆品等用途。
试剂
TE缓冲液：10 mmol/L Tris-Cl，1 mmol/L EDTA ，pH 8.0
操作步骤
柱子的准备柱平衡：用缓冲液平衡脱盐柱，5-10 CV。
纯化步骤 1.上样：最大样品量可达 30%柱体积； 2.洗脱：使缓冲液通过G25脱盐柱，所有的样品物质都应在一个柱体积之内洗脱出来； 3.清洗：常用的清洗液为 0.2 M NaOH 或非离子型去垢剂。可用一倍的柱体积清洗。
版本号：BP003-1
G25 脱盐纯化柱
G-25脱盐纯化柱介质是一类以葡聚糖为基质的凝胶过滤层析介质，其工作原理主要是利用具有网状结构的葡聚糖凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析时，大于凝胶孔径的大分子，被阻于凝胶相外，沿着凝胶颗粒之间的间隙走，下移速度最快，故最先洗脱下来，中分子物质部份进入凝胶内部，洗脱速度为其次，而小分子物质因全部进入凝胶，受到阻力最大，故最后被洗脱下来，如此物质得到分离。

葡聚糖凝胶 g25 分子量范围

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凝胶过滤层析的基本操作

凝胶过滤层析的基本操作①凝胶介质的选择根据待分离蛋白质的分子量选择具有相应分离范围的凝胶。

对于未知蛋白，应选用分离范围较宽的凝胶，如用sephacryls-300。

对于分子量在3~5kda的蛋白质，脱盐时应选用sephadexg50或g25；而对于小分子量多肽物质（1~5kda），脱盐则应选用sephadexg10或sephadexg15。

②凝胶介质的处置和装柱商品凝胶一般是干粉，使用前应用水溶胀。

一般情况下，1份凝胶加十份水，自然溶胀至少24小时。

溶胀后，将上清中细小的凝胶碎块弃除，重新搅拌悬起，待凝胶沉淀后，再次弃去凝胶碎块，重复数次，直到液相澄清为止。

为加速溶胀，可将凝胶煮沸一小时，该法同时具有灭菌的作用。

凝胶过滤器层析柱的短与直径的比例应属50~100:1。

装柱时柱体必须横向，先在柱内重新加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）烘烤光滑，缓慢并已连续地一次性转化成柱内。

装柱过程中，必须防止柱内缓冲液流干，特别注意维持柱体凝胶光滑无气泡和裂缝。

出厂后，需用2ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的光滑性。

例如柱体光滑，可知蓝色区带光滑稳定地通过凝胶，不取任何条纹。

必须维持凝胶和缓冲液温度一致，以增加气泡的产生。

③上样凝胶过滤柱层析对于样品的体积有严格的要求。

样品体积不应超过柱床体积的1~5%，如超过5%，则会导致分离效率降低，低于1%则分离效率也不会提高，所以蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20mg/ml。

样品本身对洗脱液的相对粘度不能超过2，样品粘度过高，会使层析区带不稳定，或流速不规律，区带变宽或扭曲。

上样前样品应经0.2μm?孔径滤膜过滤或10，000g离心5min，去除残渣，加样时避免破坏柱体表面，保持其表面均匀平整。

④洗脱洗脱液应当维持一定的离子强度以消解凝胶中所含的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的融合促进作用。

sephadex和sepharosecl凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应属0.02mol/l；sephacryl凝胶应属0.05mol/l。

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项(包含各种溶剂的溶胀系数)

葡聚糖凝胶柱使用及注意事项1 Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用，Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20。

其既有分子筛作用，在由极性与非极性溶剂组成的溶剂中还有反相层析效果。

虽然价位很高，但由于性能颇佳，可再生利用，所以倍受亲睐。

此外上柱样品损失很少，对处理小样品较好，这也是我们实验室常用的原因之一。

2 Sephadex LH20 的原理。

Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。

因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。

如果使用反相溶剂洗脱，Sephadex LH20对化合物还起反相分配的作用，所以极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。

如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。

3 Sephadex LH20 洗脱溶剂。

看完第2点后，就应该清楚Sephadex LH20 洗脱溶剂因分为两类：反相和正相两种。

用得最多的是反相溶剂洗脱，以甲醇－－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

正相系统以氯仿－－甲醇最为常见，先用50％氯仿－－甲醇，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。

4 Sephadex LH20 样品的处理和洗脱溶剂的选择。

如果样品极性大，这选用反相溶剂洗脱（甲醇－－水），样品用最少体积的甲醇－－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样（一定要滤喔！要是把Sephadex LH20 堵啦，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，很心痛呀）。

如果样品极性小，这选用正相溶剂洗脱（氯仿－－甲醇），样品用最少体积的氯仿－－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。

5 Sephadex LH-20的步骤。

(1) 选择条件：梯度洗脱在Sephadex使用中并不象在正相柱层析中那么重要。

生物化学与分子生物学基本试验试验一蛋白质的盐析与透析试验

生物化学与分子生物学基本实验实验一蛋白质的盐析与透析实验目的了解蛋白质的盐析与透析的原理和意义实验原理血清中的蛋白质，用盐析的方法，可以分离出清蛋白、α、β球蛋白和γ-球蛋白三种。

详情见盐析技术。

另选择适宜孔径的半透膜，使蛋白质分子被截留，小分子的中性盐透出而达分离的目的。

但透析时正负离子透过半透膜的速度不同，如硫酸铵中的NH4+的透出较快，膜内SO42-剩余而生成H2SO4，其酸度足以使蛋白质变性，因此，除盐时开始应对0.14 mol·L-1的NH4OH透析。

本实验分别用双缩脲试剂和Nessler试剂检验蛋白质和NH4+的存在。

仪器材料和试剂药品仪器材料：（1）离心管、试管及试管架。

（2）2m1刻度吸管、玻璃棒、小烧杯。

（3）透析袋。

（4）离心机。

试剂药品：（1）饱和硫酸铵溶液。

（2）硫酸铵粉末。

（3）双缩脲试剂称取CuSO4·5H2O 2.5g，加蒸溜水少许，微热溶解后稀释至100ml。

另取酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·H2O）10g和KI 5g，溶于500ml蒸馏水中，再加入20％氢氧化钠300ml，混匀后，慢慢加入硫酸铜溶液中，加蒸馏水至1000ml。

此液可长期储存。

（4）Nessler试剂称取150g碘化钾置于三角烧瓶中，加蒸馏水100ml使之溶解，再加入110g碘，待完全溶解后加140g～150g汞，用力振摇10分钟左右，此时产生高热，须将三角烧瓶放入水中继续摇动，直至棕红色的碘转变成带绿色的碘化汞钾为止。

将上清液倾入2000ml容量瓶中，并用蒸馏水洗涤瓶内的沉淀数次，将洗涤液一并倒入容量瓶内，用蒸馏水稀释至刻度，此为贮存液，储于棕色瓶中备用。

取贮存液150ml，加10％氢氧化钠700ml，混匀后加蒸馏水150ml，混匀，此为应用液，储于棕色瓶中，如混浊可过滤或静止数天后取上清液使用。

本试剂需有适宜的pH值，调节至用1 mol/L盐酸20ml滴定时，需本试剂11.0ml～11.5ml时为宜。

凝胶过滤层析

【实验目的】掌握凝胶过滤层析的原理及操作方法【实验原理】凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。

是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。

层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。

1、器材：核酸蛋白检测仪、层析柱、水浴锅、真空泵2、试剂：SephadexG-25【实验步骤】（1）凝胶的选择：在经过膜分离后，分子量<5000。

本次实验选用G-25葡聚糖凝胶（分离范围1000-5000）。

（2）柱子的选择：分子量<5000，膜分离后玉米肽中不同的小肽分子量比较接近，属于分级分离，所以选用50*1.6规格的柱子。

（3）干凝胶用量的计算：柱子体积/膨胀度，G-25膨胀度是4~6。

（4）凝胶的预处理：将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。

可以用玻璃棒搅拌，但是不能剧烈，防止凝胶破裂。

多洗几次，尽量洗干净。

自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。

充分溶胀后，进行真空脱气。

（5）洗脱液的选择：本实验采用蒸馏水做洗脱液。

（6）凝胶的填充：将层析柱与地面垂直固定在架子上，然后将处理好的凝胶倒入柱子里，不能有气泡，要防止干柱。

（7）柱平衡：装柱完成后，用洗脱液来平衡柱子，直至核酸蛋白检测系统基线保持水平半个小时以上。

（8）上样：上样量在5%~10%。

（9）标准曲线的制作：本次实验用到还原型谷胱甘肽、氧化型谷胱甘肽、杆菌肽（氧化型谷胱甘肽（GSSG），M=612.63；还原型谷胱甘肽（GSH），M=307.33；杆菌肽M=1422.69）。

三种肽各称取0.03g 配成2ml，进行层析，在恒定流速下进行凝胶过滤层析。