image j对SDS-PAGE灰度分析定量蛋白浓度教学提纲
SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量
SDS-PAGE电泳法测定蛋白质相对分子质量实验目的了解SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术学习SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术实验原理SDS-PAGE即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)：1. 在混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷量。
2. 在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入适量SDS (阴离子表面活性剂)，使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上(一定条件下，大多数蛋白质与之结合比为1.4g SDS/1g protein)，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质之间原有的电荷差别。
此时特定蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3. 蛋白质分子量在15,000～200,000之间时，其电泳迁移率与分子量的对数值线性相关：若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可以获得一条标准曲线，而从未知蛋白质在相同电泳条件下的迁移率即可在标准曲线上求得其分子量。
实验设备与试剂垂直板型电泳槽直流稳压电源微量注射器移液器水浴锅染色槽烧杯试管滴管分离胶缓冲液(1.5 mol/L Tris-HCl, pH8.8)：称取Tris 18.15g，加约80ml 无离子水，用1 mol/L HCl调pH至8.8，无离子水定容至100ml，4℃保存浓缩胶缓冲液(0.5 mol/L Tris-HCl液, pH6.8)：称取Tris 6g，加约60ml 无离子水，用1 mol/L HCl调pH至6.8，无离子水定容至100ml，4℃保存凝胶贮液：称取丙烯酰胺(Acr) 29.2g及N,N’-甲叉双丙烯酰胺(Bis)0.8g，重蒸水定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存10%浓缩胶贮液：称Acr 10g及Bis 0.5g，溶于重蒸水中并定容至100ml，过滤后置棕色试剂瓶于4℃保存10%SDS溶液：10g SDS加重蒸水定容至100ml，室温保存(低温下易析出结晶，用前微热，使其完全溶解)1%TEMED (四甲基二乙胺)10%过硫酸铵(AP)：配制后分装，-20℃保存电泳缓冲液(Tris-Gly缓冲液pH8.3)：称取Tris 6.0g，甘氨酸28.8g, SDS 1.0g, 用无离子水溶解后定容至1L染色液：0.25g考马斯亮蓝G-250，加入454ml 50%甲醇溶液和46ml冰乙酸即可脱色液：75ml冰乙酸，875ml重蒸水与50ml甲醇混匀实验步骤1. 安装夹心式垂直板电泳槽：夹心式垂直板电泳槽有很多型号，主要结构相同，且操作简单，不易泄漏。
用imagej进行WB定量分析
ImagJ是一款简单的图像处理与分析软件，可以用来进行WB定量分析。
一、利用ImagJ对WB条带进行灰度分析1、File——》open 打开WB片子2、把图片转化成灰度图片image——》type——》8-bit3、消除背景影响process——》subtract background 选择50基本可以4、设置定量参数analyze——》set measurements，点击面积，平均密度和灰度值及Integrated Density 5、设置单位analyze——》set scale ，在“unit of length”的方框里输入“pixels”6、把图片转换成亮带，Edit——》invert7、选择FreehandSelection，尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值当测定完所有条带，选结果中的“Edit ”的“SelectAll”，然后复制数据“IntDen”到Excel表即可进行分析8、复制数据IntDen进行分析二、利用ImagJ对WB条带进行密度分析1、File——》open 打开WB片子2、如条带不正，需修正image——》transform——》rotate调节angle值，直到条带水平为止3、选中矩形选项，圈中第一个条带，然后 analyze——》gels——》select firstlane（快捷键ctrl+1），然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上，analyze——》gels——》select secondlane（快捷键 ctrl+2），最后analyze——》gels——》plotlanes4、选中直线工具，将开口的波峰关闭5、选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值6、以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值为相对密度The protocol of imageJ for quantitative analysis of Western blotting:- open an image- transfer the image to 8-bitsimage → type: 8 bits- Process → substract background 50- analyze → set measurements: pick area, mean gray value, inte grated density. - analyze → set scale, fill “unit of length” with “pixels”- switch the image to bright bandsedit → invert- freehand selection, choose the target area on the image . a band), type a “m” for measurement, then we get the result from a new window.- after measuring all of the bands, pick the “edit” of the result window. “select all”, copy the integrated density values to excel to analyze.The integrated density means that the area value multiplies the mean gray value. For Western blotting analysis the integrated density is very important, because the area and gray value both of them have meaning for Western blotting bands.。
SDS-PAGE蛋白质纯度分析
SDS-PAGE蛋白质纯度分析十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是较常用的一种蛋白纯化分析技术。
SDS-PAGE可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离。
如果蛋白质样品中含有多个蛋白质或者纯化蛋白样品中含有其他杂蛋白，经过SDS-PAGE分离后不同的蛋白质会被分离成多个蛋白条带。
如果纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，则只显现一条蛋白条带。
由此SDS-PAGE技术可以对蛋白质样品的纯度进行分析。
SDS-PAGE分析原理SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS复合物在电泳时的迁移速度仅由蛋白质分子量决定，不同的蛋白质由于分子量的差异经过SDS-PAGE电泳后分离，再经由蛋白质染色对蛋白质分离结果进行分析。
蛋白质SDS-PAGE分析流程1. 蛋白质浓度检测2. 样品处理: 在蛋白样品中加入等量含有B-巯基乙醇的2x loading buffer，煮沸10分钟3. 电泳准备: 配置合适浓度的SDS分离胶，安装电泳槽，注入1x 电泳液4. 蛋白质样品上样：根据蛋白质浓度，取适量处理过的蛋白样品依次加入电泳孔槽内，另外取适量蛋白标准marker加入其他空余孔槽内。
5. 开始电泳: 接通电源，将电压调至120v，保持恒定电压。
6. 电泳结束剥离胶: 当溴酚蓝迁移至凝胶底部，停止电泳；将蛋白胶取出，并切去浓缩胶和分离胶底部的溴酚蓝胶条。
7. 染色: 使用R250染色液对蛋白胶染色1小时8. 脱色: 使用脱色液对染色的蛋白胶脱色至背景干净，蛋白条带清晰可见9. 拍照分析中/英文项目报告在技术报告中，百泰派克会为您提供详细的中英文双语版技术报告，报告包括：1. 实验步骤（中英文）。
ImagJWB定量分析
一、利用ImagJ对WB条带进行灰度分析1、File——》open 打开WB片子2、把图片转化成灰度图片image——》type——》8-bit3、消除背景影响process——》subtract background 选择50基本可以4、设置定量参数analyze——》set measurements，点击面积，平均密度和灰度值及Integrated Density5、设置单位analyze——》set scale ，在“unit of length”的方框里输入“pixels”6、把图片转换成亮带，Edit——》invert7、选择FreehandSelection，尽量把条带圈起来，点击键盘m（小写），出来IntDen灰度值8、复制数据IntDen进行分析二、利用ImagJ对WB条带进行密度分析1、File——》open 打开WB片子2、如条带不正，需修正image——》transform——》rotate调节angle值，直到条带水平为止3、选中矩形选项，圈中第一个条带，然后analyze——》gels——》select firstlane（快捷键ctrl+1），然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上，analyze——》gels——》select second lane（快捷键ctrl+2），最后analyze——》gels——》plotlanes4、选中直线工具，将开口的波峰关闭5、选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值6、以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值为相对密度*/link?url=iFFzpXWQu3ULvbjcoe0ME-Oi1oVTR3ANKR6xYvQXfMPUjK3Re5lnNI2kRpSadvUdXUPUr9 zJvJau9y3P4ZyoMxZR8ghHwpvUJeqRj1vn5Ty*如果有数据产生，一般是批量多次western blot结果的一个统计数据一般采取方差分析或者t检验分析就可以了*纵坐标我看文献上是用的检测蛋白的灰度值比上内参的灰度值。
SDS-PAGE测定蛋白质分子量
实验十 SDS-PAGE测定蛋白质分子量一、实验目的1.学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。
2.掌握垂直板电泳的操作方法。
3.运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量及染色鉴定。
二、实验原理1.带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳、稳态电泳。
其中区带电泳是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。
支持介质的作用主要是为了防止机械干扰和由于温度变化以及大分子溶液的高密度而产生的对流。
区带电泳早期使用不同的支持介质有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。
2.PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
3.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸钠），SDS 能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMr=K-bX，式中：Mr为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE测定蛋白质
浓缩效应
样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋” 极移动，从浓缩胶进入分离 胶，速度变慢，堆积浓缩。
缓冲液 样品 浓缩胶
分离胶
浓缩效应
样品进入浓缩胶有一个堆积 浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋” 极移动，从浓缩胶进入分离 胶，速度变慢，堆积浓缩。
【SDS-PAGE基本原理】
SDS-PAGE 是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙 醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂， 它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的 二级和三级结构。
强还原剂巯基乙醇可以断开二硫键破坏蛋白质的四级 结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解 聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS 复合物。
3、蛋白质样品的处理
1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400
牛血清白蛋白 MW=66,200 牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200µl样品溶解液中，沸水浴中加热35min后上样。
4、加样
用移液器分别取10 l样品液，小心将样品加到凝胶 凹形样品槽底部。并做好标记。
5、电泳 将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开 电泳仪开关，开始时电流为10 mA，待样品进入分离 胶后，将电流调至20-30 mA，当溴酚蓝染料距硅胶框 1cm时，停止电泳，关闭电源。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Staking gel Separating gel
相对迁移率mR=
蛋白质样品迁移距离(cm) 溴酚蓝区带距加样端距离(cm)
干货▎ImageJ分析WesternBlot蛋白条带灰度值
干货▎ImageJ分析WesternBlot蛋白条带灰度值聊点学术，一键关注“你已经是个成熟的条带了，要学会自己分析！”“连Western blot都没学好，又让我学Image J，我......”This is the dividing line.Image J分析蛋白条带灰度值首先解释一下，为什么要分析灰度值？灰度的概念是使用黑色调表示物体，即用黑色为基准色，不同的饱和度的黑色来显示图像。
采用ECL发光时，蛋白条带发出的荧光会曝光在胶片上，留下的黑色条带。
然而胶片扫描后为蓝色背景、黑色条带，这并不是单纯的黑灰白颜色。
因此，我们首先得在Photoshop 中将整张图片去色，使彩色图片变成黑白图片，形成近灰色背景、黑色条带的图片类型。
此时，条带的深浅和面积综合代表着蛋白的量。
灰度值分析自然就成为我们的首选。
延伸说一下，免疫组织化学染色(IHC)结果本身为近白色背景、棕黄色阳性表达，这时我们就不能直接用灰度反映阳性表达强弱了，而是积分吸光度，也就是咱们常说的平均光密度(IOD)。
如果你真的想用灰度计算IHC结果，显然你需要将图片转为灰度图再计算。
此处不表。
分析图文步骤如下：Image J软件界面↓1. 图片转换为黑白图：首先使用Photoshop打开胶片扫描图片，点击“图像>调整>去色”，将彩色图片转化为黑白图片，并使用裁剪工具将目标条带裁剪至合适大小后另存图片。
2.打开Image J软件：2.1.打开图片文件：File>Open；将图片转化为8bit类型：Image>Type>8-bit。
(此步骤的目的是为了将图片的每个像素用8bit表示，这样的话，整个图片的灰度将分为256个级别，即黑、灰、白的像素模式；若保留原始的16bit格式或RGB格式，图片灰度级别会呈指数增长，并有其它颜色混入，造成计算误差。
)2.2.将整张图片背景灰度均一化，消除图片背景影响：Process>Subtract Background，默认数值为50即可。
(完整版)SDS-PAGE检测蛋白质纯度
SDS-PAGE检测蛋白质纯度1．电泳的基本原理许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所在介质的pH及其组成。
由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，因此，在一定时间内，由于各组分移动距离的不同，而达到分离鉴定各组分的目的。
2．影响电泳的主要因素2.1 电泳介质的pH当介质的pH等于某种两性物质的等电点时，该物质处于等电状态，即不向正极或负极移动。
当介质pH小于其等电点时，则呈正离子状态，移向负极；反之，介质pH大于其等电点时，则呈负离子状态，移向正极。
因此，任何一种两性物质的混合物电泳均受介质pH的影响，即决定两性物质的带电状态及其量，为了保持介质pH的稳定性，常用一定pH的缓冲液，如分离血清蛋白质常用pH8．6的巴比妥或三羟甲基氨基甲烷（Tris）缓冲液。
2.2 缓冲液的离子强度离子强度对电泳的影响是：离子强度低，电泳速度快，分离区带不易清晰；离子强度高，电泳速度慢，但区带分离清晰。
如离子强度过低，缓冲液的缓冲量小，不易维持pH的恒定；离子强度过高，则降低蛋白质的带电量(压缩双电层)使电脉速度减慢。
所以常用离子强度为0.02-0.2之间。
2.3 电场强度电场强度和电泳速度成正比关系。
电场强度以每厘米的电势差计算，也称电势梯度。
如纸电泳的滤纸长15cm，两端电压（电势差）为150V，则电场强度为150/15=10V/cm，电场强度愈高，则带电粒子的移动愈快。
电压增加，相应电流也增大，电流过大时易产生热效应可使蛋白质变性而不能分离。
2.4 电渗作用在电场中，液体对固体的相对移动，称为电渗。
如滤纸中含有表面带负电荷的羧基，溶液则向负极移动。
由于电渗现象与电泳同时存在，所以电泳的粒子移动距离也受电渗影响，如纸上电泳蛋白质移动的方向与电渗现象相反，则实际上蛋白质泳动的距离，等于电泳移动距离减去电渗距离。
如电泳方向和电渗方向一致，其蛋白质移动距离，等于二者相加。
SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量实验报告
SDS－PAGE测定蛋白质相对分子质量一、前言聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳，简称PAGE，是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCl。
电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。
在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
蛋白灰度分析软件使用 ppt课件
2
（2） Quantity One ：有泳道-轨迹测定法， 等高线/手绘选取目的区域测定法等方法
• ⅰ.泳道-轨迹测定法：先剔除一系列背景，再选择泳道（lane）， 然后分析条带（band）,最后使用高斯建模得出灰度分析值 （Gauss Model trace）特点：感觉比较科学，重复性好，但十分 繁琐，而且有时不能正确反应灰度。
蛋白灰度分析
1
蛋白灰度分析软件
•蛋白灰度分析软件有：Image-Pro Plus，Quantity One，Image J 等 ~~ （1）Image-Pro Plus 综合性能最好，操作简便结果可靠！因为它有 强大的IOD 算法，能准确反应蛋白灰度~~但需要靠魔棒或轨迹法选 取目的蛋白区域，有一定的主观性，不过蛋白灰度测定本身就是半 定量分析-----测量值本身就没有一定标准，不同软件测量值不同， 即使相同软件重复测量数值也不一定相同，因此只要测定数值能反 应目的蛋白变化趋势，测量值相对偏差不大即可~~~
图），保存为TIFF 格式文件。
5
2. Image-Pro Plus 打开文件，剔除背景：
（1） 放大镜放大目libration---intensity---options---image,选择背景最大value 值------ok-------ok----system---close
10
（5）count/size---edit-----convert AOI to object---得出 IOD 值
11
（6）若测下一条带，则点NEW AOI 按钮，再按以上方法选 择AOI （7）可以count/size---view---measurement data 显示或输出测 量值
7
ImageJ和Graphpad如何对WesternBlot条带灰度分析【干货】每日生物评论
ImageJ和Graphpad如何对WesternBlot条带灰度分析【干货】每日生物评论摘要手把手教你利用Image J和Graphpad软件对Western Blot条带进行灰度分析和柱状图构建，看艾美捷干货分享。
WB是研究蛋白表达的一个经典方法。
对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量的变化。
一些凝胶成像软件带有此分析工具，比如Quantity One，Bandscan，Gel-Pro Analyzer等成像系统专用软件。
除了这些软件，还有一个比较简单的综合性质图像处理软件Image J可以很方便的进行灰度分析。
而且Image J是开源性质的免费软件，可以在其官网直接下载使用。
对Western Blot条带进行数值化有两种方法——灰度分析和光密度分析。
灰度是计算机图像分析仪根据图像颜色深浅分为256个级别。
灰度值越小物体颜色越深。
光密度是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度IO与该光线通过溶液或物质后的透射光强度Ib比值的对数OD=log（IO/Ib）；图像分析中，入射光和透射光强度分别被切片上最亮区域的平均灰度值和待测目标平均灰度值取代，则图像分析系统的光密度值=log（切片标本最亮区域的平均灰度值（g0）/待测目标的平均灰度值（g））。
光密度值越大，物体颜色越深，阳性物质相对含量越大。
对于灰度值来说，切片标本制作时染色时间长短，以及测量时显微镜照明光源电压的大小对其影响很大。
而光密度是一个比值。
是通过计算一张切片标本最亮区域的平均灰度值与该切片标本中待测目标的平均灰度值的比值，再根据数学公式计算而来的，所以受切片标本染色时间长短及照明光源电压关系很小。
然而有研究实践显示，灰度值与光密度值二者之间存在着线性关系，都可以用来进行WB定量分析。
同样，Image J软件进行WB条带定量分析时也存在两种方法，此处只列举一种方法，具体步骤如下。
1、下载安装，并打开Image J软件。
image J灰度检测
ImagJ是一款简单的图像处理与分析软件，可以用来进行WB定量分析。
一、利用ImagJ对WB条带进行灰度分析
1、File——》open 打开WB片子
2、把图片转化成灰度图片
image——》type——》8-bit
3、消除背景影响
process——》subtract background 选择50基本可以
4、设置定量参数
analyze——》set measurements，点击面积，平均密度和灰度值及Integrated Density
5、设置单位
analyze——》set scale ，在“unit of length”的方框里输入“pixels”
6、把图片转换成亮带，Edit——》invert
7、选择Freehand
Selection，尽量把条带圈起来，点击键盘m，出来IntDen灰度值
8、复制数据IntDen进行分析
二、利用ImagJ对WB条带进行密度分析
1、File——》open 打开WB片子
2、如条带不正，需修正
image——》transform——》rotate
调节angle值，直到条带水平为止
3、选中矩形选项，圈中第一个条带，然后analyze——》gels——》select first
lane（快捷键ctrl+1），然后移动第一个条带上的矩形到第二个条带上，analyze——》gels——》select second lane（快捷键ctrl+2），最后analyze——》gels——》plotlanes
4、选中直线工具，将开口的波峰关闭
5、选中魔棒工具，点击波峰可以显示波峰下面积，即条带的密度值
6、以第一个数值为基数，其他数值与第一个数值的比值为相对密度。
蛋白灰度分析软件使用 ppt课件
1
蛋白灰度分析软件
•蛋白灰度分析软件有：Image-Pro Plus，Quantity One，Image J 等 ~~ （1）Image-Pro Plus 综合性能最好，操作简便结果可靠！因为它有 强大的IOD 算法，能准确反应蛋白灰度~~但需要靠魔棒或轨迹法选 取目的蛋白区域，有一定的主观性，不过蛋白灰度测定本身就是半 定量分析-----测量值本身就没有一定标准，不同软件测量值不同， 即使相同软件重复测量数值也不一定相同，因此只要测定数值能反 应目的蛋白变化趋势，测量值相对偏差不大即可~~~
图），保存为TIFF 格式文件。
5
2. Image-Pro Plus 打开文件，剔除背景：
（1） 放大镜放大目的区域
6
（2） Measure---calibration---intensity---options---image,选择背景最大value 值------ok-------ok----system---close
10
（5）count/size---edit-----convert AOI to object---得出 IOD 值
11
（6）若测下一条带，则点NEW AOI 按钮，再按以上方法选 择AOI （7）可以count/size---view---measurement data 显示或输出测 量值
• ⅱ.等高线-手绘选取目的区域测定法：通过等高线或手绘选取目 的蛋白区域，最简便，但重复性不太好。
3
（3）Image J 最坑爹，它用魔棒选取区域 测定灰度，可是有时很难选中所需区域， 而且方法繁琐，不推荐！！
4
Image-Pro Plus 分析蛋白灰度教程
• 说明：目的蛋白的灰度=目的蛋白IOD 值/ 相应内参IOD 值 • 1. 使用Photoshop 剪切出目的区域（只含western bolt 条带，如
蛋白灰度分析软件使用精品课件
•
15、一个人炫耀什么，说明他内心缺 少什么 。。202 0年9月 上午9 时58分2 0.9.220 9:58Se ptembe r 22, 2020
•
16、业余生活要有意义，不要越轨。2 020年9 月22日 星期二 9时58 分43秒0 9:58:43 22 September 2020
图），保存为TIFF 格式文件。
最新 PPT
5
2. Image-Pro Plus 打开文件，剔除背景：
（1） 放大镜放大目的区域
最新 PPT
6
（2） Measure---calibration---intensity---options----image,选择 背景最大value 值------ok-------ok----system----close
•
17、一个人即使已登上顶峰，也仍要 自强不 息。上 午9时58 分43秒 上午9 时58分0 9:58:43 20.9.22
谢谢大家
最新 PPT
14
最新 PPT
7
最新 PPT
8
（3）Measure---count/size---measure---select measurements，选择IOD 为测量值， 调整结果显示方式：Options-label style 改为mesurement，选择IOD 为显示值。
最新 PPT
9
（4）接下来有2 种方法选择目的蛋白区域（即找出AOI， area of interest, IPP 核心元件）：魔棒和手绘轨迹法。
• ⅱ.等高线-手绘选取目的区域测定法：通过等高线或手绘选取目 的蛋白区域，最简便，但重复性不太好。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1、打开image j 把SDSPAGE图片拖到红色箭头 所指区域。
2、单击image—Type— 8-bit转换成灰度图像。
3、单击process—subtract background会出现左图的界 面，勾选light background和 preview，选择合适的像素 值，在此一30.0pixels为例， 单击OK。
4、方框工具选择并
画出第一条永道，单 击analyze—gels— select first lane也可以 用快捷键（Ctrl+1）
4、方框工具选择并
画出第一条永道。单 击analyze—gels— select first lane也可以 用快捷键（Ctrl+1），
会出现左图界面，点 击OK，并在图上画出 第一条条带。
8、新建一个Excelቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ把文 本框内的数据复制到表格， 计算绝对灰度=255-灰度 平均值，同时标出点样体 积。理论上，标样的绝对 灰度值的比值和点样体积 比值是相等的，我们可以 选择绝对灰度比值和体积 比最接近的一对数据，如 红色框内数据。
此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢
image j对SDS-PAGE灰度分析 定量蛋白浓度
SDS-PAGE图像，可以用相机或光密度扫描仪成像，作为标准样品的蛋 白最好和待测蛋白的条带大小一致，用Bradford的方法测得标样的浓 度，然后把标样的浓度调成300μg/ml。
每个泳道对应的数值为点样体积（ μl ），制备所有样品的时候蛋白 溶液和2*loading buffer的体积比均为1:1
5、单击analyze—set measurements出现 下图界面，勾选Area和mean gray value单 击OK。
7、选好条带以后按住Ctrl+m出 现一个文本，如上图所示；然后 把鼠标移到黄色方框的中心，按 住鼠标，把方框拖到下一个条带， 然后按Ctrl+m，文本中出现第二 条带的面积和平均灰度值；以此 类推。